真核基因的大腸桿菌表達(dá)學(xué)習(xí)

1、真核基因的大腸桿菌表達(dá)學(xué)習(xí)真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素第四章 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌表達(dá)體系克隆基因正確表達(dá)的基本條件克隆基因表達(dá)活性的檢測真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)體系 優(yōu)越性： 1. 對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解； 2. 是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體； 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)； 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。大腸桿菌中表達(dá)體系的不

2、足： 1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核的不同。 細(xì)菌的RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5. 細(xì)菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉?？寺』蛘_表達(dá)的基本條件 最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分

3、布有關(guān)。 重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。 具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動子； 插入序列的正確取向。真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)克隆基因表達(dá)活性的檢測 1.微細(xì)胞檢測法； 2.巨細(xì)胞檢測法； 3.偶聯(lián)反應(yīng)測定法。微細(xì)胞檢測法： 這是一種適于檢測質(zhì)?；虮磉_(dá)的體內(nèi)檢測法。 微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長期間連續(xù)產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞。 通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達(dá)狀況的理想體系。Exle: ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）, 在微細(xì)胞中不能合成出56103dal、 4

4、2103dal、30103dal、 28103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時(shí)，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子。巨細(xì)胞檢測法 1. 經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌recA uvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線照射后6小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線照射后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時(shí)合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的。 2. 將含有外源基因的噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線照射

5、使DNA受到了損傷，自身基因的表達(dá)受到了嚴(yán)重的抑制。通過同噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。偶聯(lián)反應(yīng)測定法 使DNA模板在細(xì)菌無細(xì)胞體系中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w基因組上的外源片斷進(jìn)行體外表達(dá)，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個(gè)小片段指導(dǎo)合成的。 優(yōu)點(diǎn)： 1. 放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個(gè)系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時(shí)后可被迅速檢出； 2. 應(yīng)用這個(gè)體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)載體核糖

6、體結(jié)合位點(diǎn)啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點(diǎn)組 成 部 分 1.啟動子： 最佳啟動子具備的條件 第一 必須是將啟動子，能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上 第二 這個(gè)啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因?yàn)樵诒磉_(dá)毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件 第三 這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。 （IPTG）2. 轉(zhuǎn)錄終止子 啟動子封堵作用：由一個(gè)上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動子時(shí)，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個(gè)啟動子的功能活性抑制另一個(gè)啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動

7、子封堵作用。 轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。3. 轉(zhuǎn)譯起始序列 5-末端結(jié)構(gòu)特征，決定mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。 在核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的序列結(jié)構(gòu)中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點(diǎn)突變；或使用轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因表達(dá)4.轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子 顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率。5. 轉(zhuǎn)譯終止子 mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。 大腸桿菌格外偏愛使用終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。功能啟動子的分離： 一般程序：選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色

8、體DNA， 接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質(zhì)粒載體重組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求使克隆的片斷恰好插入在緊鄰報(bào)告基因的上游位置隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報(bào)告基因的表達(dá)活性。 報(bào)告基因（reporter gene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。 追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。利用CAT基因進(jìn)行功能啟動子的分離和

9、活性測定無啟動子的CAT質(zhì)粒載體Ecoli DNA構(gòu)建Ecoli基因文庫細(xì)胞裂解物、14C標(biāo)記得氯霉素乙酰輔酶A薄層層析放射自顯影CAT活性的檢測：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化氯霉素（2-或3-）發(fā)生乙?；饔?。使用tetr作報(bào)告基因分離功能啟動子 1. 首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個(gè)tet基因、Hind 位點(diǎn)）上的tet的啟動子序列中插入一個(gè)EcoR1的酶切位點(diǎn)（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。 2. 將純化的細(xì)菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位點(diǎn)上；轉(zhuǎn)化給對tet敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。使用galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功

10、能啟動子 能夠檢測啟動子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。 來源于pBR322轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK原理： 半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸集團(tuán)給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素標(biāo)記ATP，測定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強(qiáng)度，可推算報(bào)告基因（galK）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。分離功能的啟動子： 將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的MCS區(qū)的單克隆位點(diǎn)上； 將體外連接的DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具GalE、 GalK 的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾； 將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶

11、紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素 1. 選用的報(bào)告基因galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測的蛋白質(zhì)（鑒定啟動子表達(dá)活性的強(qiáng)弱）； 2. 應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動子）。 3.采用半乳糖激酶缺陷型的大腸桿菌寄主菌株（ GalE+ GalT+ GalK）作轉(zhuǎn)化受體； 常用的大腸桿菌表達(dá)載體 1. Lac啟動子的表達(dá)載體 2. Trp啟動子的表達(dá)載體 3. PL啟動子的表達(dá)載體 理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。這類

12、表達(dá)載體的最突出的特點(diǎn)是，含有一條足夠大的編碼-半乳糖苷酶的lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個(gè)克隆的外源DNA片斷插入到這個(gè)啟動子之后，人保持著lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí)，這個(gè)重組質(zhì)粒就會合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。1. 經(jīng)過Hae 切割的203bp的酶切片斷上具有Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、CAP作用區(qū)以及RNA聚合酶作用區(qū)、 -半乳糖苷酶的頭8個(gè)密碼子。 有一些對阻遏物作用不敏感的啟動子，也被用來制備表達(dá)載體2. 95bp的Alu片斷：不完整的CAP結(jié)合序列3. L8突變的203bp區(qū)段，在CAP結(jié)合序列里發(fā)生了G-A的轉(zhuǎn)換4. 在uv5

13、突變，使lac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（RNA聚合酶結(jié)合區(qū)T-A顛換,相鄰堿基G-A的轉(zhuǎn)換）質(zhì)粒的構(gòu)建： 將含有l(wèi)ac啟動子的Hae 酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng)EcoR1切割并對其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的pBR322質(zhì)粒上。增加2個(gè)堿基對Trp啟動子的表達(dá)載體 這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于lac啟動子表達(dá)載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。構(gòu)建： 1. 大腸桿菌染色體DNA的5.4kb Hind 片斷， 含有trp啟動子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。 2. 將此片斷，克隆到pBR322質(zhì)粒的Hind 位點(diǎn)，構(gòu)建成了ptrpED3表達(dá)載體

14、（含有兩個(gè)Hind 位點(diǎn)）。 3. Hind部分酶切消化，將靠近EcoR1位點(diǎn)的一個(gè)Hind 位點(diǎn)，經(jīng)核酸外切酶 和S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED5-1. 使用Hind 接頭，將ptrpED5-1質(zhì)粒的Hinf1片斷克隆到了pBR322質(zhì)粒的Hind 位點(diǎn)上，形成重組質(zhì)粒pWT111（含有trp調(diào)節(jié)序列和trpE基因的頭7個(gè)密碼子）。Trp啟動子表達(dá)載體已用來生產(chǎn)了-干擾素和-干擾素三啟動子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動子單元PL啟動子的表達(dá)載體 是一種最廣泛使用大腸桿菌表達(dá)載體的啟動子之一。 噬菌體的阻遏物操作系統(tǒng)cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。 42度時(shí)，阻遏蛋白失活

15、； 28-30度時(shí)， PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。 通過改變溫度來控制PL啟動子的開閉pPLc24表達(dá)載體： 用來表達(dá)天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。 這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體含有MS2-聚合酶基因開始的98個(gè)密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實(shí)現(xiàn)表達(dá)。 在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind 單切點(diǎn)。EcoR單切點(diǎn)靠近 PL啟動子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。pPLa2311表達(dá)載體 可以控制具有轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的外源片斷插入基因的表達(dá)。 這種啟動子可接受熱敏感的阻遏蛋白質(zhì)的抑制。 組成： 1. pBR322的HaeEcoR片斷；編碼r 2. 噬菌體的Hae -Hae片斷： PL 3. pMK

16、20質(zhì)粒的Hae片斷：編碼kanr 4. 具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)的Hae 片斷： 經(jīng)pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來。pPLc2833表達(dá)載體 調(diào)節(jié)型強(qiáng)啟動子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達(dá)。 組成： 1. 一個(gè)調(diào)節(jié)型的強(qiáng)啟動子； 2. 一個(gè)用作選擇記號的氨芐青霉素抗性基因r； 3. 一個(gè)直接位于PL啟動子下游的多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)。 若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)取代pPLc2833質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點(diǎn)，由此形成的新質(zhì)粒pCP3。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。（42度，拷貝數(shù)提高510倍）克隆的真核

17、基因在 大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位融合蛋白質(zhì)的表達(dá)外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)2. 周質(zhì)中表達(dá)3. 胞外表達(dá)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá): 外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。 包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分優(yōu)點(diǎn)：1. 形成包涵體 a. 蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離 b. 蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用 c. 蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會使寄主細(xì)胞受傷害2. 蛋白質(zhì)的產(chǎn)量

18、高 二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。3. 表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單。缺點(diǎn)： 1. 包涵體 a. 蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復(fù)其生物學(xué)活性 b. 蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低 c. 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴 2. 還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成 （硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)） 3. 由于N末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實(shí)性受影響4. 蛋白質(zhì)會被酶解5.蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜 周質(zhì)中表達(dá)： 周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。 在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。

19、 優(yōu)點(diǎn)： 1. 由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡單 2. 蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重 3. 促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境） 4. 蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)真實(shí) 在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，在體內(nèi)對信號肽進(jìn)行切割缺點(diǎn)： 1. 信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 2. 有可能形成包涵體胞外表達(dá)： 使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。途徑： 1. 用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（

20、可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）優(yōu)點(diǎn)： 1. 蛋白質(zhì)的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化 3. 增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 4. 蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實(shí)缺點(diǎn)： 1. 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會分泌到胞外培養(yǎng)基中去的 2. 由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過程比較復(fù)雜融合蛋白質(zhì)的表達(dá) 融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 由DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型 一、由報(bào)告基因的編碼序列區(qū)和另一個(gè) 基因的啟動子及其調(diào)節(jié)序列

21、構(gòu)成的二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列 區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成 融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化。融合蛋白質(zhì)的純化 基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出駐外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。 融合蛋白質(zhì)的切割 將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。 1.溴化氰切割法： 能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。 2. 胰蛋白酶切割法： 能從精氨酸或是賴氨酸殘基羧基一側(cè)進(jìn)行特異性的切割。 3. Xa切割法： 能唯一地從特異識別序列C末端切割多肽影響克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率因素5-UTR對克隆基因表達(dá)效率的影響 a. 啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響