動(dòng)物細(xì)胞工程s

1、2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程(gngchng)1常用技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞核移植動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體以動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。 共三十八頁.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞(xbo)，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。2共三十八頁動(dòng)物細(xì)胞生長(shngzhng)和增殖的特性：貼壁生長(shngzhng)3共三十八頁4動(dòng)物細(xì)胞生長(shngzhng)和增殖的特性：接觸抑制但癌細(xì)胞會(huì)失去(shq)接觸抑制形成多層細(xì)胞。貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制。P45單層細(xì)胞共三十八頁動(dòng)物(dng

2、w)細(xì)胞培養(yǎng)過程胚胎或幼齡(yu ln)動(dòng)物的組織剪碎胰蛋白酶處理細(xì)胞懸液細(xì)胞培養(yǎng)液原代培養(yǎng)胰蛋白酶洗脫、分瓶培養(yǎng)傳代培養(yǎng)取動(dòng)物組織塊5共三十八頁傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(piyng)動(dòng)物(dngw)組織10代細(xì)胞50代細(xì)胞6保持細(xì)胞正常的二倍體核型部分細(xì)胞核型可能改變；增殖緩慢甚至停止發(fā)生突變，獲得不死性(無限增殖細(xì)胞系)共三十八頁動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)的條件 P46無菌、無毒的環(huán)境：營養(yǎng)： 糖、 氨基酸、 無機(jī)鹽、微量元素、促生長因子； 動(dòng)物血清、血漿適宜(shy)溫度、pH：氣體環(huán)境：滅菌、加抗生素，定期更換培養(yǎng)液36.5 0.5； pH7.27.4用95%空氣加5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞

3、的保存：超低溫（冷凍）7共三十八頁動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用(yngyng)： 理論研究：生理、病理、藥理生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)制品：如病毒(bngd)疫苗、干擾素、單克隆抗體檢測(cè)有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)8共三十八頁9動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較項(xiàng)目動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)相同點(diǎn)都需無菌條件；都進(jìn)行有絲分裂不同點(diǎn)原理培養(yǎng)基目的細(xì)胞(xbo)的全能性細(xì)胞的增殖液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動(dòng)物血清、葡萄糖植物激素、蔗糖獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)品獲得植物體或細(xì)胞產(chǎn)品共三十八頁10 動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)(y )細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)

4、育為動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植核移植2. 動(dòng)物(dngw)體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物(dngw)共三十八頁1110代以內(nèi)(y ni)的細(xì)胞供體激活(j hu)受體細(xì)胞供、受體細(xì)胞融合共三十八頁體細(xì)胞核移植的過程(guchng)：12克隆動(dòng)物過程(guchng)中應(yīng)用的現(xiàn)代生物技術(shù)： 細(xì)胞培養(yǎng) 核移植 細(xì)胞融合 胚胎培養(yǎng) 胚胎移植供體動(dòng)物 供體細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)M期卵母細(xì)胞去核去核卵母細(xì)胞細(xì)胞融合重組細(xì)胞核注入胚胎培養(yǎng)重組胚胎胚胎移植代孕母體克隆動(dòng)物共三十八頁克隆動(dòng)物的原理：選擇M中期(zhngq)卵母細(xì)胞的原因：核移植產(chǎn)生的克隆動(dòng)物與供核親本并非100

5、%相同的原因：細(xì)胞質(zhì)中含有與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)(wzh)，能使重組細(xì)胞發(fā)育為重組胚胎。動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性細(xì)胞質(zhì)基因來源于受體卵母細(xì)胞13共三十八頁加速家畜(jich)遺傳改良的進(jìn)程保護(hù)(boh)瀕危物種生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植了解胚胎發(fā)育和衰老過程；追蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾病體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景 P49核移植胚胎干細(xì)胞14共三十八頁成功率非常(fichng)低技術(shù)環(huán)節(jié)有待改進(jìn)克隆動(dòng)物存在健康問題克隆動(dòng)物食品安全性存在爭議體細(xì)胞核移植技術(shù)存在(cnzi)的問題 P50277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；三只羊羔出生，一只成活，即“多莉

6、”。15共三十八頁從一個(gè)共同的祖先通過無性繁殖的方法繁殖出來的一群(y qn)遺傳特征相同的個(gè)體，也可用在細(xì)胞或分子水平。 克隆(k ln)(clone)n.無性繁殖系v.無性繁殖16共三十八頁細(xì)胞克?。?由一個(gè)細(xì)胞不斷分裂所形成的一大群細(xì)胞的基因型都相同。微生物克隆：由一個(gè)細(xì)菌繁殖成一個(gè)菌落。DNA分子克隆：由一個(gè)DNA分子復(fù)制產(chǎn)生(chnshng)多個(gè)子代DNA分子。個(gè)體克?。?不經(jīng)過(jnggu)有性生殖，形成基因型完全相同的兩個(gè)或更多的個(gè)體。17共三十八頁183. 動(dòng)物(dngw)細(xì)胞融合與單克隆抗體概念：動(dòng)物(dngw)細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過

7、程。 融合后形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。 P52細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。共三十八頁動(dòng)物細(xì)胞融合的原理：誘導(dǎo)(yudo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法：19細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活的病毒(bngd)，如仙臺(tái)病毒(bngd)物理方法化學(xué)方法生物方法：共三十八頁多克隆抗體（抗血清） 獲取方法：向動(dòng)物體內(nèi)(t ni)反復(fù)注射某種抗原，使動(dòng)物產(chǎn)生抗體，從血清中分離抗體。 特點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低、特異性差，是多種抗體的混合物。 P52什么(shn me)是單克隆抗體？20每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。單克隆抗體： 單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的細(xì)胞群分泌的高度純

8、一的抗體。共三十八頁21 需要(xyo)解決的問題：使單一的B淋巴細(xì)胞在體外連續(xù)增殖 1975年，米爾斯坦（C.Milstein）和科勒（G.Khler）將B淋巴細(xì)胞與無限增殖的 骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞。 雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)(tdin)： 既能產(chǎn)生專一抗體，又能大量增殖。P54共三十八頁單克隆抗體(kngt)的制備22特定(tdng)抗原，多次免疫多次抗體陽性篩選融合的同種核細(xì)胞及未融合細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)脾臟，多種，經(jīng)免疫的B(效應(yīng)B)共三十八頁單克隆抗體(kngt)選擇(xunz)培養(yǎng)基篩選骨髓瘤細(xì)胞多種細(xì)胞經(jīng)免疫的B淋巴細(xì)胞23雜交瘤細(xì)胞能分泌專一抗體的雜交瘤細(xì)

9、胞細(xì)胞融合抗原抗體反應(yīng)篩選體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)液腹水免疫小鼠共三十八頁特異性強(qiáng)、靈敏度高可以(ky)大量制備單克隆抗體(kngt)的優(yōu)點(diǎn)： P54單克隆抗體的應(yīng)用： P54診斷用：治療用：可用于多種抗原物質(zhì)；結(jié)合同位素標(biāo)記，還能做腫瘤等疾病的定位診斷優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速將特定的單抗與抗癌藥物結(jié)合，制成“生物導(dǎo)彈”24共三十八頁動(dòng)物細(xì)胞工程(gngchng)小結(jié)25動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞核移植動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體原理，細(xì)胞生長特點(diǎn)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件，過程原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)；胰蛋白酶的作用原理，供體細(xì)胞，受體細(xì)胞，克隆動(dòng)物的遺傳特性原理，誘導(dǎo)方法，應(yīng)用原理，過程，篩選方法，

10、特點(diǎn)，應(yīng)用共三十八頁1.植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞工程中所用的技術(shù)與原理不相符(xingf)的是（ ）A.纖維素酶、果膠酶處理和胰蛋白酶處理-酶的專一性 B.植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)-細(xì)胞的全能性 C.原生質(zhì)體融合和動(dòng)物細(xì)胞融合-生物膜的流動(dòng)性 D.紫草細(xì)胞培養(yǎng)和雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)-細(xì)胞分裂26B共三十八頁2.下列關(guān)于細(xì)胞工程的敘述中錯(cuò)誤的是（ ）A.電激可誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合或動(dòng)物細(xì)胞融合B.去除(q ch)植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞均需酶處理C.小鼠骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)抗原免疫的小鼠 B淋巴細(xì)胞融合可制備單克隆抗體D.某種植物甲乙兩品種的體細(xì)胞雜種與甲乙兩品種雜交后代的染色體數(shù)目相

11、同27D共三十八頁（1）該技術(shù)是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。（2）圖中細(xì)胞(xbo)A體外培養(yǎng)不具有分裂能力，但能分泌_，細(xì)胞B體外培養(yǎng)能夠_。（3）動(dòng)物細(xì)胞融合常用的方法是 。3.1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體技術(shù)在生產(chǎn)和使用抗體方面(fngmin)開創(chuàng)了新紀(jì)元，下圖表示單克隆抗體制備流程示意圖。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：動(dòng)物細(xì)胞融合 特異性抗體無限增殖PEG誘導(dǎo)（滅活的病毒、電激）28共三十八頁（4）細(xì)胞融合是隨機(jī)的過程，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要篩選(shixun)出 細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為了促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，常向培養(yǎng)液中加入_(激素) 雜交瘤胰島素

12、29共三十八頁（5）培養(yǎng)2周后，即測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的特征，篩選(shixun)出_細(xì)胞置于不同孔內(nèi)（如圖所示）培養(yǎng)。此操作前要將培養(yǎng)細(xì)胞稀釋到710個(gè)細(xì)胞/ml，每孔滴入0.1ml細(xì)胞稀釋液，其目的是_。（6）要獲得大量的單克隆抗體，可對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行_ 培養(yǎng)。保證(bozhng)每個(gè)孔內(nèi)不多于體外或體內(nèi)分泌抗X蛋白抗體的30一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的（單一細(xì)胞培養(yǎng)以保證抗體的純度）共三十八頁4.科學(xué)家從某些能無限增殖(zngzh)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離出無限增殖(zngzh)調(diào)控基因（prG），該基因能激發(fā)許多動(dòng)物的細(xì)胞進(jìn)行分裂，這為單克隆抗體的制備提供了更為廣闊的前景。請(qǐng)回答以下問題。（

13、1）利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞融合常用的誘導(dǎo)劑是 ，誘融后需進(jìn)行兩次篩選，第一次篩選的目的是_，第二次篩選的目的是_。PEG（聚乙二醇、滅活的病毒(bngd)）篩選出雜交瘤細(xì)胞篩選出即能無限增殖又能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞31共三十八頁制備重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞“”，所指的細(xì)胞是 ，然后進(jìn)行“檢測(cè)”，其目的(md)是_。所指的細(xì)胞具有的特點(diǎn)是 。（2）有人提出將無限增殖調(diào)控基因（prG）直接導(dǎo)入B細(xì)胞(xbo)亦能獲得單克隆抗體，其思路如圖13所示。經(jīng)免疫的B細(xì)胞（漿細(xì)胞）檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中能否表達(dá)既能無限增殖又能產(chǎn)生特定抗體32共三十八頁構(gòu)建重組細(xì)胞時(shí)，只選用了細(xì)

14、胞甲的細(xì)胞質(zhì)是因?yàn)開。選取_的細(xì)胞核進(jìn)行移植。重組細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)為細(xì)胞增殖(zngzh)提供_等營養(yǎng)物質(zhì)，通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞群稱為_。細(xì)胞(xbo)甲的細(xì)胞(xbo)質(zhì)中有無限增殖調(diào)控基因（prG）效應(yīng)B細(xì)胞水、無機(jī)鹽、糖、氨基酸、促生長因子、動(dòng)物血清細(xì)胞系（細(xì)胞克?。?3（3）也有人提出用細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建重組細(xì)胞來制備單克隆抗體，其思路如圖14所示。共三十八頁5.下圖為單克隆抗體制備(zhbi)流程示意圖。(1)單克隆抗體制備技術(shù)的基礎(chǔ)是_。(2)細(xì)胞融合是隨機(jī)的過程，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，目的是_。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中需要添加無機(jī)鹽，但要注意無機(jī)鹽的_，以保證生命活動(dòng)

15、(hu dng)的正常進(jìn)行。動(dòng)物細(xì)胞融合與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞種類和數(shù)量(濃度)34共三十八頁(3)為選育出能產(chǎn)生高特異性抗體的細(xì)胞，要將從HAT培養(yǎng)基上篩選出的細(xì)胞稀釋(xsh)到710個(gè)細(xì)胞/mL，每孔滴入0.1 mL細(xì)胞稀釋液，其目的是_ _。(4)若用15N標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)能產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，放射性物質(zhì)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的先后順序是_。 使每個(gè)孔內(nèi)不多于 一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的(或單一細(xì)胞培養(yǎng)以保證(bozhng)抗體的純度)核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞膜35共三十八頁雜交瘤細(xì)胞(xbo)的篩選：HAT選擇培養(yǎng)基HAT：含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基(nj)喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇培養(yǎng)基，這三種成分與細(xì)胞的DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種：36共三十八頁淋巴細(xì)胞具有合成(hchng)DNA的兩條途徑。骨髓瘤細(xì)胞為代謝缺陷型，即缺乏HRPT或TK酶活性。雜交瘤細(xì)胞利用B細(xì)胞中的酶，可通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，只有雜交瘤細(xì)胞能存活。37共三十八頁內(nèi)容摘要2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程。生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)制品：如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體。細(xì)胞質(zhì)中含有與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)，能使重組細(xì)