蛋白質(zhì)定量新方法及相關(guān)技術(shù)研究匯報(bào)課題四

1、集成化蛋白質(zhì)組定量分析系統(tǒng)項(xiàng)目編號(hào)：2012CB910604參加單位：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所復(fù)旦大學(xué)外協(xié)單位：中國計(jì)量科學(xué)研究院國家重大科學(xué)研究計(jì)劃“蛋白質(zhì)定量新方法及相關(guān)技術(shù)研究”項(xiàng)目進(jìn)展匯報(bào)會(huì)2014年7月4日，上海匯報(bào)內(nèi)容擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題目標(biāo)完成情況主要研究進(jìn)展下一步工作計(jì)劃一、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 針對(duì)蛋白質(zhì)組樣品處理、分離和定量分析多為離線多步操作，存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、樣品易污染和丟失等問題，通過發(fā)展蛋白質(zhì)定量樣品處理新裝置以及自動(dòng)化標(biāo)記新技術(shù)，構(gòu)建集成化定量蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)，提高規(guī)?；鞍踪|(zhì)定量的通量、準(zhǔn)確度、精密度和自動(dòng)化水平研究?jī)?nèi)容集成化蛋白質(zhì)組定量分析系統(tǒng)多維液相色譜-

2、質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析蛋白質(zhì)快速變性、還原溶液快速置換蛋白質(zhì)在線酶解固相標(biāo)記二、目標(biāo)完成情況年度預(yù)期目標(biāo)目標(biāo)完成情況第三年1）建立2-3種目標(biāo)蛋白質(zhì)組的選擇性固相原位標(biāo)記方法2）完成在線固相標(biāo)記系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，形成標(biāo)準(zhǔn)操作流程3）將在線標(biāo)記系統(tǒng)與分離鑒定系統(tǒng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)樣品標(biāo)記、色譜分離和質(zhì)譜鑒定的全自動(dòng)分析4）建立基于色譜激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線1）發(fā)展了4種選擇性固相同位素標(biāo)記方法2）完成了在線固相標(biāo)記系統(tǒng)的評(píng)價(jià)及驗(yàn)證，下半年擬形成標(biāo)準(zhǔn)操作流程3）建立了3種集成化蛋白質(zhì)組定量分析系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)在線樣品前處理、在線標(biāo)記、色譜分離和質(zhì)譜鑒定的全自動(dòng)分析4）基于色譜激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技

3、術(shù)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了人肝臟中22種蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量三、主要研究進(jìn)展固相標(biāo)記方法 糖蛋白質(zhì)組 磷酸化蛋白質(zhì)組集成化定量分析系統(tǒng) 膜蛋白質(zhì)組 全蛋白質(zhì)組三、主要研究進(jìn)展固相標(biāo)記方法 糖蛋白質(zhì)組 磷酸化蛋白質(zhì)組集成化定量分析系統(tǒng) 膜蛋白質(zhì)組 全蛋白質(zhì)組固相標(biāo)記反應(yīng)標(biāo)記的樣品溶液交換，除鹽等溶液標(biāo)記反應(yīng)離心影響定量準(zhǔn)確性降低靈敏度 樣品損失提高靈敏度和樣品回收率 簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟溶液標(biāo)記 vs. 固相標(biāo)記 糖基化肽段的固相標(biāo)記反應(yīng)基于酰肼微球的固相富集手段二甲基標(biāo)記方法富集特異性高達(dá)90%以上反應(yīng)快速完全，易于操作；標(biāo)記試劑價(jià)格低廉基于酰肼微球的固相標(biāo)記主要進(jìn)展一人類肝臟糖蛋白質(zhì)組相對(duì)定量

4、分析 多酶酶切技術(shù)使用彼此間有著切割位點(diǎn)互補(bǔ)性的多種蛋白酶來酶解蛋白蛋白的鑒定數(shù)目蛋白的覆蓋率固相標(biāo)記技術(shù)N-糖基化肽段的富集以及二甲基標(biāo)記都是在酰肼微球上進(jìn)行富集回收率檢測(cè)靈敏度正常和肝癌人肝組織N-糖基化蛋白質(zhì)組規(guī)?；町惙治鯶ou HF et al. Clinical Research, in press多酶酶切trypsin, trypsin & Glu-C, chymotrypsin固相標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方案共定量到1632個(gè)N-糖基化位點(diǎn)vs. Trypsin 595個(gè)位點(diǎn)多酶酶切技術(shù)鑒定到含有相同糖基化位點(diǎn)的不同長度肽段GlycositeEnzymeSequenceRatioAverage

5、 ratioRSDERAP2N119TrypsinDIEITN*ATIQSEEDSR0.851.0013.7%Trypsin+Glu-CITN*ATIQSEEDSR1.03Chymotrypsin IIIHSKDIEITN*ATIQSEEDSRY1.12有效提高了位點(diǎn)的定量覆蓋率RSD50% 743個(gè)N-糖基化位點(diǎn)有769個(gè)N-糖基化位點(diǎn)可以在兩到三個(gè)酶切方法中被定量到正常人肝臟糖蛋白質(zhì)組定量分析定量準(zhǔn)確度藍(lán)點(diǎn)：742個(gè)(99.9%)落在log2 Ratio=-11，僅有1個(gè)例外黑點(diǎn)：831個(gè)(95.0%)落在log2 Ratio=-11，有32個(gè)例外 99.9%準(zhǔn)確定量95.0%準(zhǔn)確定量藍(lán)點(diǎn)

6、：二到三個(gè)酶切方法中定量到的糖基化位點(diǎn)黑點(diǎn)：?jiǎn)蝹€(gè)酶切方法中定量到的糖基化位點(diǎn)正常人肝組織的N-糖基化蛋白組定量分析定量到1052個(gè)N-糖基化蛋白的2329個(gè)N-糖基化位點(diǎn)vs.Trypsin 754個(gè)位點(diǎn)(32.4%)三次質(zhì)譜重復(fù)分析目前為止得到的人肝組織N-糖基化蛋白組的最大定量數(shù)據(jù)集正常和肝癌人肝組織的N-糖基化蛋白組的差異性分析位點(diǎn)分布0.5r2或r0.5藍(lán)點(diǎn)583275黑點(diǎn)676428設(shè)置門檻，每一種酶切方法三次技術(shù)重復(fù)的RSD90% 的定量比值在0.8-1.2 之間，而使用傳統(tǒng)的方法，這一比例小于80%磷酸化肽段鑒定效果與定量準(zhǔn)確度人肝及肝癌組織磷酸化肽段定量分析比較文獻(xiàn)：Sci.

7、Signal. 2009, 2, ra46 ; Nat. Meth. 2011, 8, 655.從0.5mg的人肝與肝癌樣品中一次可以定量到5000條以上的磷酸化肽段，磷酸化肽段的定量精密度優(yōu)于使用TiO2富集結(jié)合SILAC定量的方法顯著上調(diào)主要是嗜酸性激酶CKII的底物；顯著下調(diào)主要是嗜堿性激酶的底物三、主要研究進(jìn)展固相標(biāo)記方法 糖蛋白質(zhì)組 磷酸化蛋白質(zhì)組集成化定量分析系統(tǒng) 膜蛋白質(zhì)組 全蛋白質(zhì)組優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)酸性增溶劑溶解和堿性條件酶解兼容整個(gè)膜蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理時(shí)間縮短至3.5 h （常規(guī)16 28h）減少樣品損失，適用痕量樣品分析，并可提高定量分析的準(zhǔn)確度和精密度Zhang LH et

8、 al. Anal. Chem. 2013, 85, 8507-8512基于雙相柱的膜蛋白質(zhì)組樣品預(yù)處理主要進(jìn)展三SCX微反應(yīng)器雙相柱微反應(yīng)器peptidecoveragepeptidecoverageBSA3154%5981%Myo1377%1994%Cyt C1360%1365%marker上樣液雙相柱 SCXpH 置換液雙相柱 SCXBSAMyoCyt C雙相柱微反應(yīng)器回收率50 ng 鼠腦微量膜蛋白質(zhì)組分析蛋白質(zhì)肽段跨膜蛋白質(zhì)疏水性肽段跨膜肽段時(shí)間雙相柱 微反應(yīng)器14137964142173.5 h文獻(xiàn)方法34681021116 h微量細(xì)胞樣品定量分析 微反應(yīng)器方法文獻(xiàn)方法細(xì)胞數(shù)蛋白質(zhì)

9、肽段蛋白質(zhì) 肽段300 0006181762520159330 0003308194853Zhang LH et al. unpublished data在線樣品預(yù)處理裝置樣品在預(yù)處理時(shí)間由離線的28 h縮短到 4 min基于該膜構(gòu)建的集成化在線樣品預(yù)處理裝置對(duì)蛋白質(zhì)的回收率可以達(dá)到94%1.3% (n=3) 集成化蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置 A: 蛋白質(zhì)變性和還原；B: 蛋白質(zhì)除鹽；C: 蛋白質(zhì)酶解Zhang LH et al. Anal. Chem., unpublished data主要進(jìn)展四基于SILAC標(biāo)記的集成化定量蛋白質(zhì)組分析平臺(tái)SILAC標(biāo)記的蛋白質(zhì)組樣品通過在線預(yù)處理系統(tǒng)進(jìn)行變性、

10、還原、除鹽和酶解，并結(jié)合多維色譜分離質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，構(gòu)建了集成化蛋白質(zhì)組相對(duì)定量平臺(tái)Zhang LH et al. Unpublished data定量平臺(tái)性能評(píng)價(jià)以H/L=1的Hela細(xì)胞提取蛋白質(zhì)為樣品，考察了平臺(tái)的準(zhǔn)確性和精密度 平行三次分析，共同定量2274個(gè)蛋白質(zhì)，其中99.99%的蛋白質(zhì)定量比例為1:1, 90%蛋白質(zhì)定量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%（n=3)與傳統(tǒng)離線方法比較SampleamountNumber of quantified proteinsMean ratio of H/L labelled proteinsRelative standard deviation (n=

11、3)On-lineOff-lineOn-lineOff-lineOn-lineOff-line2 g4212940.9901.0039.7%8.4%10 ng5031.0041.1436.0%13.5%與傳統(tǒng)離線方法相比，定量到的蛋白質(zhì)數(shù)目不僅分別提高了1.4和16倍，而且分析時(shí)間也縮短到1/20。此外，隨著樣品量的降低，定量的準(zhǔn)確性和精密度也得到明顯改善人肝癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞定量蛋白質(zhì)分析RSD 5 文章12篇Nature Method 1 篇Angew. Chem. 1 篇Chem. Commun. 1 篇Anal. Chem. 5 篇 J Proteome Res. 3 篇Applied Materials & Interface 1 篇申請(qǐng)發(fā)明專利12項(xiàng)，其中國際專利2項(xiàng)培養(yǎng)博士后2人，畢業(yè)博士研究生7人 四、下一步工作計(jì)劃嚴(yán)格按照課題任務(wù)書執(zhí)行沖擊高水平論文建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，加強(qiáng)新技術(shù)新方法的推廣應(yīng)用致 謝科技部項(xiàng)目專家組和顧問組各參加單位及主管部門課題組所有成員及項(xiàng)目組其他成員敬請(qǐng)各位評(píng)委指正基于熒光標(biāo)記和二維色譜分離的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量熒光探針選擇完全衍生鑒定模擬定量多維色譜分離蛋白質(zhì)定量采用與質(zhì)譜分析相兼容的熒光試劑，5-吲哚乙酰氨基熒光素，對(duì)蛋白質(zhì)中的半胱氨酸進(jìn)行標(biāo)記，提出了基于色譜分離定量-熒光高靈敏度檢測(cè)