細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及預(yù)防措施

1、細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及預(yù)防措施污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問(wèn)題。 由于每一種細(xì)胞有其獨(dú)特的培養(yǎng)體系， 因此污染造成的后果也不盡相同。 某些污染的發(fā)生往往難以察覺(jué)和檢測(cè)， 而且污染源能長(zhǎng)期共存于培養(yǎng)體系中， 這類污染事實(shí)上大部分被人們忽視了。 培養(yǎng)的細(xì)胞作為一個(gè)生物體， 會(huì)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作出相應(yīng)的反應(yīng)， 造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變， 而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成潛在的威脅，而且隨著污染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。培養(yǎng)環(huán)境中的物理、 化學(xué)及生物因素都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境造成污染。 由于入侵的微生物在培養(yǎng)體系中不斷增殖、 代謝， 因此生物性的污染對(duì)細(xì)胞的危害最大。 隨著污染微生物的不斷增殖，交叉污染的可

2、能性也不斷增加。 此外，微生物代謝消耗大量必需的養(yǎng)分， 同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此，認(rèn)識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性， 建立細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度， 可以有效地防止污 染，保證實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)為了減少污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，必須建立細(xì)胞凍存庫(kù)。細(xì)胞凍存庫(kù)應(yīng)該分主細(xì)胞庫(kù)M Master cell bank , MCB 和工作細(xì)胞庫(kù)（ Working cell bank , WCB ,當(dāng)需要做實(shí)驗(yàn)時(shí) 從主細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇細(xì)胞建立工作細(xì)胞庫(kù)。 每一個(gè)凍存標(biāo)本都應(yīng)明確記錄細(xì)胞的性質(zhì)、 代數(shù)及 有無(wú)污染。同時(shí)還應(yīng)建立規(guī)范的

3、檢測(cè)程序進(jìn)行菌檢及細(xì)胞鑒定1 。為了保證培養(yǎng)細(xì)胞系的完整性， 必須進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄， 應(yīng)包括以下內(nèi)容： 細(xì)胞系的種類及來(lái)源、 有無(wú)污染 （如細(xì)菌， 病毒， 支原體） 、 細(xì)胞代數(shù)和倍增時(shí)間、 以及選擇性突變。詳細(xì)的記錄有利于對(duì)細(xì)胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、 污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M(jìn)行分析。 經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞與它較早代數(shù)的凍存細(xì)胞相比， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 細(xì)胞在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中， 其生物特性已發(fā)生了改變。 培養(yǎng)的細(xì)胞由若干生長(zhǎng)速度及活力各異的亞群組成。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快及活力高的細(xì)胞亞群逐漸占優(yōu)勢(shì)，這種選擇性趨勢(shì)會(huì)影響整個(gè)細(xì)胞群的生物特性。 應(yīng)用不同代數(shù)的

4、細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)則結(jié)果會(huì)發(fā)生偏差。 建立細(xì)胞凍存庫(kù)就能避免這種影響， 通過(guò)復(fù)蘇相同代數(shù)的細(xì)胞， 人們就能在較為 均一的條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)工作需要清潔，保持良好的環(huán)境及規(guī)范的操作程序 2， 3 。超凈工作臺(tái)是細(xì)胞培養(yǎng)中普遍使用的無(wú)菌操作裝置， 它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護(hù)。 超凈工作臺(tái)的工作原理是驅(qū)動(dòng)經(jīng)高效濾菌凈化后的空氣， 通過(guò)工作臺(tái)面形成氣流屏障， 從而阻止外界污染物的侵入并使操作過(guò)程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺(tái)中。因?yàn)椴僮鬟^(guò)程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，所以采用垂直氣流比水平氣流安全。當(dāng)進(jìn)行移液， 傾倒液體的操作過(guò)程會(huì)產(chǎn)生飛沫， 并沉積在超凈工作臺(tái)內(nèi)物體的表面。 超凈工作臺(tái)的氣流并不能阻

5、止飛沫的產(chǎn)生， 飛沫會(huì)隨著氣流的方向飄浮。 超凈工作臺(tái)不合理的放置、 不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會(huì)破壞超凈工作臺(tái)氣流的方向， 導(dǎo)致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動(dòng)、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺(tái)內(nèi)物品污染的主要因素， 造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。 因此為減少交叉污染的發(fā)生， 應(yīng)盡可能減少超凈工作臺(tái)內(nèi)的物品。 不同細(xì)胞系以及同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用， 如胰酶、 培養(yǎng)液等。 否則， 一個(gè)操作者的失誤可能引起所有細(xì)胞發(fā)生污染。細(xì)胞培養(yǎng)的污染細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。 細(xì)胞培養(yǎng)污染可

6、分為以下三類：物理性、化學(xué)性及生物性2 ， 3 。為了使細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果更可靠，應(yīng)該固定所有培養(yǎng)條件，并保證其重復(fù)性。物理性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。 物理性污染通過(guò)影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分， 從而影響細(xì)胞的代謝。 培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射（ 紫外線或熒光） 會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響 2 。細(xì)胞、 培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、 輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中， 可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變， 如細(xì)胞同步化、 細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對(duì)細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒

7、定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備， 如離心機(jī)。 培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置， 為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中， 試劑周圍不能放同位素。 培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響?；瘜W(xué)性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染 2 。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。 細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分， 如氨基酸， 若濃度超過(guò)了合適的范圍， 也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性

8、。 同樣， 不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的， 在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。 玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂（ 通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面） 是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染。水 水是唯一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)因素。 容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。 為了避免金屬離子、有機(jī)分子、 細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染， 在配制液體， 清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水4 。需要注意的是，超純水放置過(guò)久其純度會(huì)下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染， 因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應(yīng)采

9、取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。血清 動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。 由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物， 而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同， 因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。 血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、 組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等因素。 在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)， 為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。 細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的， 并經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定， 實(shí)驗(yàn)者 本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)

10、液及試劑也是非常重要的， 應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤，混用類似化合物等錯(cuò)誤。培養(yǎng)器皿及容器 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會(huì)影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的 pH 值和細(xì)胞生長(zhǎng)密度。 培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過(guò)程中的差異可能對(duì)培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。 塑料制品在生產(chǎn)過(guò)程中可能殘留一些有毒成形劑， 生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。 儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器， 因?yàn)榫凭?強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。生物性污染的來(lái)源、 危害及預(yù)防 外界的微生物如昆蟲、 節(jié)肢動(dòng)物、 原蟲、 霉菌、病毒、細(xì)菌、無(wú)細(xì)胞

11、壁的微生物 (通常指支原體) 和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染2 ， 3 。只要在一個(gè)開放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作方法、 培養(yǎng)室的無(wú)菌環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)室的規(guī)章制度。 生物性污染對(duì)細(xì)胞代謝的影響，可因污染源和細(xì)胞的種類不同而表現(xiàn)各異。細(xì)菌、真菌或其它微生物污染的檢測(cè)可以用不同培養(yǎng)基進(jìn)行檢查 5 。支原體污染的檢測(cè)需要特殊的方法。 病毒污染的檢測(cè)可以使用許多體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)， 包括大鼠或小鼠的接種、逆轉(zhuǎn)錄酶分析、凝血試驗(yàn)、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)等。細(xì)菌和真菌的污染較易發(fā)現(xiàn)并及時(shí)清除， 而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)支原體的污染缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。 為了防止支原體及其它微生物污染的

12、發(fā)生和傳播， 必須建立規(guī)范的無(wú)菌操作程序及各種規(guī)章制度。支原體歸屬于柔膜體綱( Mollicutes )的支原體目，它們都具有以下共性：無(wú)細(xì)胞壁、 無(wú)細(xì)胞壁主要成分粘肽的表達(dá)。 支原體與其它細(xì)菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對(duì)于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很大 。支原體直徑僅有0.30.8科項(xiàng)并且變形能力大，故能通過(guò)濾菌器。需要指出的是， 只要有一個(gè)具有增殖能力的支原體就能引起培養(yǎng)體系的污染。 一旦細(xì)胞被污染，支原體的滴度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，最高可至每毫升109 克隆。最為致命的是，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染， 細(xì)胞外觀可無(wú)明顯變化。

13、 如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。來(lái)源 培養(yǎng)體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳播。細(xì)胞被支原體污染后，支原體可以與宿主細(xì)胞形成一個(gè)共生體系，使污染不斷擴(kuò)大。一旦發(fā)生支原體污染， 支原體和其它微生物會(huì)隨著飛沫而不斷傳播。 操作過(guò)程中移液， 傾倒液體時(shí)都會(huì)產(chǎn)生具有潛在感染能力的飛沫， 并沉積在接觸到的表面。 這種污染性飛沫能存活數(shù)天甚至數(shù)星期。此外，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個(gè)常見(jiàn)途徑。人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來(lái)源。 污染的細(xì)胞中通常能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一

14、些與人有關(guān)的支原體，如M.buccale ， M.faucium ， M.homonis ， M.pirum 和生殖支原體等。無(wú)菌操作過(guò)程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒， 造成培養(yǎng)體系的污染。人體外周血、 骨髓、淋巴組織原代培養(yǎng)中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染( primary contamination )，這也證明支原體在分化細(xì)胞中較未分化細(xì)胞更易生長(zhǎng)。 隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展， 人們已能培養(yǎng)來(lái)自不同物種如動(dòng)物、 植物、 昆蟲的各種細(xì)胞， 同時(shí)也擴(kuò)大了支原體及其它微生物的宿主范圍。此外，某些支原體，如菜氏無(wú)膽甾原體科( Acholeplasma laidlawii )、

15、M.arginini 、M.hyorhinis 、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養(yǎng)體系中穩(wěn)定增殖數(shù)年。牛血清中能分離到 A.laidlawii 、M.arginini 和M.hyorhinis 支原體，因此血清可能成 為支原體污染的來(lái)源。由于無(wú)血清培養(yǎng)基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中 制備的，因此無(wú)血清培養(yǎng)體系并不能排除支原體污染的危險(xiǎn)。盡管隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，血清發(fā)生污染的可能性進(jìn)一步降低，但只要有一個(gè)活的支原體能通過(guò)濾菌器，整個(gè)培養(yǎng)體系就會(huì)被污染。危害支原體通過(guò)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗各種養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸， 從而改變細(xì)胞的代謝狀態(tài)。支原體可以酵解糖，分

16、解精氨酸，氧化丙酮酸，解月尿支原體可以利用尿素作為能源，這會(huì)使細(xì)胞代謝發(fā)生一系列改變，從而影響蛋白質(zhì)、DAN RNA合成以及喋吟從頭合成及補(bǔ)償合成途徑。污染時(shí)間的長(zhǎng)短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度，導(dǎo)致細(xì)胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現(xiàn)。隨后，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性發(fā)生改變， 使某些酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，并表現(xiàn)出一些特殊的細(xì)胞功能，而其它一些細(xì)胞正常的功能則被抑制。某些支原體附著在細(xì)胞表面后，會(huì)與宿主細(xì)胞交換膜抗原成分。隨著細(xì)胞膜成分的改變，細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生改變。細(xì)胞污染對(duì)研究工作帶來(lái)的最大危害是由于錯(cuò)誤 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致研究誤入歧途。此外，支原體污染還會(huì)干擾細(xì)胞的篩選，如雜交瘤

17、細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制并喪失產(chǎn)生單抗的能力（附表）。附表支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響分類可能的危害1融合細(xì)胞無(wú)分泌單抗的能力2雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗不是針對(duì)靶抗原，而是針對(duì)支原體 1雜交瘤技術(shù)3支原體消耗胸腺喀咤，干擾 HAT篩選4在HAT篩選過(guò)程中喪失了雜交瘤細(xì)胞3降低禽痘病毒的感染力及空斑的形態(tài)4誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素5抑制腺病毒的增殖6誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素7污染病毒疫苗8引起巨細(xì)胞病毒及帶狀病毒形成假空斑9降低腺病毒及 SV40胸腺喀咤的摻入10抑制腺病毒和單純皰疹病毒的增殖11抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒和牛痘病毒的增殖12支原體與病毒在蔗糖梯度離心中共沉淀13抑制新城病病毒（NDV產(chǎn)生干擾素14喪失H

18、IV敏感細(xì)胞1降低鳥氨酸脫竣酶的產(chǎn)生2降低蛋白質(zhì)和RNA勺產(chǎn)生3消耗培養(yǎng)液中的精氨酸4改變尿昔/尿氨酸的比例5 降低DNAD RNA勺合成小、陰6增加胸腺喀咤的降解4代謝7誘導(dǎo)3T3細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶8增加致癌物誘導(dǎo)芳香燒羥化酶的產(chǎn)生9促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的增殖10降低喋吟替代途徑11 降低ATP水平12降低脫氫酶的水平13降低氧的消耗14抑制胸腺喀咤的摻入1引起鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化2促進(jìn)腫瘤壞死細(xì)胞因子的釋放3抑制同種抗原引起的細(xì)胞毒性反應(yīng)4誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子5促進(jìn)支原體與宿主細(xì)胞交換抗原5生物反應(yīng)性6產(chǎn)生類淋巴因子的活性7改變成淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白8誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗支原體的多克隆抗體9

19、抑制某些淋巴細(xì)胞的分裂10對(duì)胸腺細(xì)胞產(chǎn)生毒性11活化鼠的巨噬細(xì)胞HAT次黃喋吟-氨基喋吟-胸腺喀咤核昔系統(tǒng)預(yù)防及控制 污染發(fā)生后首先應(yīng)確定污染物的種類及污染的程度。為了能正確 檢測(cè)細(xì)菌或支原體的污染，應(yīng)先撤去培養(yǎng)液中的抗生素。常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)中應(yīng)用抗生素會(huì) 導(dǎo)致：掩蓋了不很嚴(yán)重的污染；導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限 的，而且許多抗生素僅是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而非殺菌劑。因?yàn)橹гw無(wú)細(xì)胞壁，所以青霉素， 頭抱菌素等干擾細(xì)胞壁合成的抗生素對(duì)于支原體無(wú)效。菌檢及支原體檢測(cè)只有在撤去抗生素后才能進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中若發(fā)生污染或其它問(wèn)題應(yīng)有詳細(xì)的記錄，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的專家分析，找出哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問(wèn)題，包

20、括培養(yǎng)液的配置、實(shí)驗(yàn)室 環(huán)境的保持和無(wú)菌操作過(guò)程等，從而不斷完善操作規(guī)程， 避免類似問(wèn)題的出現(xiàn)。此外， 管理者還應(yīng)制定細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)規(guī)章制度，教育每一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員遵守。 實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)根據(jù)情況，制定修改各項(xiàng)規(guī)范的操作程序及人員培訓(xùn)計(jì)劃。一般來(lái)說(shuō)，隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的擴(kuò)大， 細(xì)胞發(fā)生變異和污染的可能性增加了 。因此，大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格制定各項(xiàng)操作程序及規(guī)章制度。 細(xì)胞培養(yǎng)中無(wú)菌操作需要清潔的工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)的合理安排、實(shí)驗(yàn)者熟練的操作技巧及強(qiáng)烈的責(zé)任感。只有通過(guò)不斷地學(xué)習(xí)、訓(xùn)練，才能熟練掌握無(wú)菌操作技術(shù)。為了盡可能減少污染的發(fā)生， 以常規(guī)檢查的方式來(lái)監(jiān)督是必要的。 細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生污染是不可避免的， 我們的

21、目的是盡可能減少污染的發(fā)生及危害。 根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查報(bào)告顯示，至少 10的細(xì)胞系存在支原體的污染 2 。一旦發(fā)生污染，如果細(xì)胞有詳細(xì)的記錄，則污染引起的危害較小。 我們可以根據(jù)細(xì)胞定期菌檢記錄， 拼棄最后一次細(xì)胞菌檢陰性后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用菌檢陰性的細(xì)胞重新開始實(shí)驗(yàn)。如果僅偶爾進(jìn)行菌檢或采用非特異檢測(cè)方法，尤其是支原體污染， 那么確定污染的范圍比較困難。 因?yàn)樗械募?xì)胞系都有可能被交叉污染。一旦發(fā)生污染， 所有未進(jìn)行菌檢的凍存細(xì)胞都必須進(jìn)行菌檢， 以去除污染的細(xì)胞并明確污染發(fā)生的時(shí)間。檢測(cè) 由于支原體污染并不引起細(xì)胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測(cè)非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方

22、法檢測(cè)支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒(méi)有一種方便、廣譜、特異性高、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。因此，有必要對(duì)不同檢測(cè)方法的靈敏度及局限性有所了解。不同檢測(cè)方法對(duì)送檢標(biāo)本的要求不同， 如果標(biāo)本不合格， 將不可能獲得正確的結(jié)果。 血清、 培養(yǎng)液或培養(yǎng)基附加成分在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中污染會(huì)在一定程度上被稀釋， 影響檢出率 6 。間接檢測(cè)法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標(biāo)本，則不適用于檢測(cè)血清和培養(yǎng)液的污染。由于污染物的隨機(jī)分布，因此僅進(jìn)行一次檢測(cè)通常會(huì)出現(xiàn)假陰性 1 。如果標(biāo)本中污染物濃度低于10個(gè)污染物/ ml,隨機(jī)抽取1ml標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)可能有36.6 %的假陰性率。增加標(biāo)本體積，濃縮標(biāo)本有助于降低假陰

23、性率。另一種假陰性的產(chǎn)生是由于污染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20 個(gè)樣品中有一個(gè)被污染（ 5的污染率），檢測(cè)所有20 個(gè)樣品，假陰率為36.6 。需要指出的是，僅僅單次檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本來(lái)判斷有無(wú)生物性污染的作法是不可靠的。 因此， 在分裝液體前， 就應(yīng)當(dāng)從原液中盡可能多取一點(diǎn)液體進(jìn)行檢測(cè)。如果不能做到這一點(diǎn)，則應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)方法選擇多個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。 例如， 在無(wú)菌過(guò)濾操作中，隨著濾過(guò)體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇最后過(guò)濾的液體進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本的處理與標(biāo)本的選擇同樣重要。 各種酶如胰酶、 脂酶，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿或其它化學(xué)物質(zhì)會(huì)破壞支原體膜的脂質(zhì)， 使支原體喪失活力及膜的完整性。

24、膜的完整性被破壞后， 支原體內(nèi)的蛋白酶及核酶釋放， 從而會(huì)干擾間接檢測(cè)方法的結(jié)果。 如果標(biāo)本收集后不能當(dāng)天檢測(cè)， 則應(yīng)該盡快凍存標(biāo)本以防止降解。 選擇、 處理檢測(cè)標(biāo)本的目的是盡可能發(fā)現(xiàn)潛在的污染。 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中就應(yīng)考慮到支原體污染的檢測(cè)。 我們最好選用無(wú)抗生素培養(yǎng)， 檢測(cè)應(yīng)盡可能離傳代時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，以便讓任何潛在的污染物生長(zhǎng)、 繁殖。 為防止支原體活力喪失， 如果檢測(cè)的是貼壁細(xì)胞， 應(yīng)采用刮除細(xì)胞的方法， 因?yàn)橐让富蚱渌蛛x方法會(huì)降低支原體的活性。在選用合適的檢測(cè)方法時(shí)， 應(yīng)考慮到支原體的滴度和活力這兩個(gè)因素。 直接培養(yǎng)法是最敏感的，但也是最耗時(shí)的檢測(cè)方法，大約需28 天。從理論上講，只

25、需一個(gè)有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用。 理想的直接培養(yǎng)法應(yīng)采用多功能的培養(yǎng)基，以降低假陰性率 7 。為增加對(duì)低滴度和低活力支原體檢出率，應(yīng)采用有氧和無(wú)氧兩種培養(yǎng)條件及幾種傳代方式。 直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽(yáng)性對(duì)照，而且耗時(shí)，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)支原體污染的間接法包括：色及生化分析法等。間接法能檢測(cè)到般超過(guò)109 L， 故盡管間接法不敏感，PCR ELISA、電子顯微鏡檢查、DNAa針、DNA熒光染 107 L 的滴度。通常情況下，支原體污染后其滴度一但相對(duì)較精確。 由于支原體的多樣性，表達(dá)不同特異性的抗原及酶，為生化及

26、免疫檢測(cè)法帶來(lái)技術(shù)上的困難。在選擇PCR DN琳針等方法前，應(yīng)考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)、加拿大、日本和歐共體國(guó)家生物制藥及診斷的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種方法。 其基本原理在于利用不同的技 術(shù)，多次檢測(cè)，以彌補(bǔ)各種檢測(cè)技術(shù)的缺陷，增加檢測(cè)結(jié)果的可信度。2.3.5 控制及排除控制支原體污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。 所有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備都應(yīng)消毒， 應(yīng)嚴(yán)格遵守上述的各項(xiàng)規(guī) 章制度及監(jiān)督制度，直至所有潛在的污染源都被消除。細(xì)胞一旦被支原體污染，要將它清除是非常困難的。由于一些不可復(fù)得的細(xì)胞被污

27、染，人們不得不設(shè)法清除污染，挽救一些珍貴的細(xì)胞。 事實(shí)上，經(jīng)支原體污染的細(xì)胞， 在污染經(jīng)處理被清除后， 細(xì)胞原有的許多生物學(xué)特性， 如基因的表達(dá)， 抗原性和代謝特點(diǎn)也隨之發(fā)生了相應(yīng)的改變。排除支原體污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠體內(nèi)接種、巨噬細(xì)胞吞噬、 胰酶消化等方法， 但沒(méi)有一種方法是普遍有效的。 所以在采用每一種方法時(shí)必須對(duì)其效果，以及對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的毒性影響進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 Del Guidice 和 Gardella 6 提出了一個(gè)有效的方法， 其基本步驟包括首先分離、 鑒定污染物及測(cè)定對(duì)抗生素的敏感性， 然后使用至少兩種敏感的抗生素進(jìn)行處理。 為增加排除污染的有效性， 可以通過(guò)稀釋以降低血清及其 它促生長(zhǎng)因子的濃度，從而降低細(xì)胞的密度。治療后細(xì)胞應(yīng)在無(wú)抗生素條件下培養(yǎng)若干代， 以確定污染已被徹底清除。 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染不易察覺(jué)， 細(xì)胞被支原體污染后清除非常困難， 支原體污染的細(xì)胞在支原體被清除后， 其細(xì)胞特性會(huì)發(fā)生很大改變， 對(duì)研究結(jié)果 造成嚴(yán)重影響。因此，為了保證細(xì)胞培養(yǎng)體系免受污染的影響，關(guān)鍵是加強(qiáng)預(yù)防措施。 TOC o 1-5 h z 作者簡(jiǎn)介：李穎健 （ 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生）參考文獻(xiàn)Johnson RW.Quality assurance of tissue culture media used in the biotechnology i