分子試驗(yàn)基本操作培訓(xùn)課件

1、分子實(shí)驗(yàn)基本操作培訓(xùn)余濤，鄭勤思2008-4-13第1頁，共17頁。Outline分子實(shí)驗(yàn)基本流程介紹分子實(shí)驗(yàn)基本操作的原理、步驟及注意事項(xiàng)總結(jié)第2頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本流程介紹感受態(tài)的制備PCR克隆目的片斷酶切及酶切片斷回收（電泳）連接小提質(zhì)粒并酶切鑒定（電泳）大腸桿菌的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化第3頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本流程介紹感受態(tài)的制備PCR克隆目的片斷酶切及酶切片斷回收（電泳）轉(zhuǎn)化連接小提質(zhì)粒并酶切鑒定（電泳）大腸桿菌的培養(yǎng)第4頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)原理 大腸桿菌在37 下在較好較快的進(jìn)行增殖， 4 下則可較好停止代謝，便于保存。（長期保存應(yīng)在-80 用15-20%甘油凍

2、存） 由于轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒帶有抗性標(biāo)記，用帶有抗生素的培養(yǎng)基即可進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。分為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 第5頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)Step0: LB培養(yǎng)基的配制(1L培養(yǎng)基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (僅在固體培養(yǎng)基中加入，注意瓊脂為Agar瓊脂糖/Agarose區(qū)分) 1L 去離子水一般一瓶配100-300mLStep0: 滅菌（此后一切保持無菌操作） 第6頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng) （用于篩選或短期保存菌種）Step1: 倒板 微波爐加熱培養(yǎng)基 - 室溫冷卻

3、至60 左右 - 移入超凈臺，加入抗生素（1000*的，即需稀釋1000倍），搖勻 - 趁熱快速倒入平板，12mL/板 - 超凈臺內(nèi)室溫冷卻凝固Step2: 接種 劃線法：燒紅接種環(huán) - 冷卻 - 蘸上菌液 - 在平板上劃線 -灼燒接種環(huán)。 多用于菌種保存 平鋪法：用玻璃刮刀將菌液鋪干與平板上，多用于轉(zhuǎn)化 第7頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)Step3：37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培養(yǎng)（防止染雜菌）。注意培養(yǎng)時(shí)間不可過長，一般不超過16小時(shí)，防止突變株產(chǎn)生。Step4：培養(yǎng)結(jié)束后，需放入4 冰箱的，為防止染雜菌，最好用parafilm

4、封口。 第8頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（用于擴(kuò)增）Step1：取出適量培養(yǎng)液于錐形瓶或試管。Step2: 加入適量抗生素。Step3：將目標(biāo)菌落挑入培養(yǎng)液。（可用接種環(huán)或槍頭）Step4: 將培養(yǎng)液放入37 搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速一般為220rpm。（為什么要搖？）第9頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作大腸桿菌的培養(yǎng)注意事項(xiàng)：無菌操作！抗生素加入的時(shí)機(jī)及量培養(yǎng)時(shí)間（不可過長）返回第10頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作感受態(tài)的制備原理： 感受態(tài) - 可接受外來DNA的狀態(tài) CaCl2法制備 Ca2+可以使膜骨架發(fā)生改變，產(chǎn)生膜 上的小孔洞，并可使DNA分子結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。步

5、驟：比較麻煩，屬較考驗(yàn)分子操作的實(shí)驗(yàn)之一。往往大批量制備，因此不需經(jīng)常進(jìn)行。注意事項(xiàng)：感受態(tài)制備后應(yīng)立即凍存于-80。使用時(shí)不可反復(fù)凍融。返回第11頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收原理： 限制性內(nèi)切酶： 1）發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中，用于降解噬菌體的DNA；宿主自身的DNA則被甲基化。 2）分為I、II、III類。常用II類（識別位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)一致） 3）區(qū)別與外切酶活性（內(nèi)切酶徹底切斷DNA雙鏈，外切酶只切其中一鏈，往往用于DNA復(fù)制的實(shí)時(shí)檢驗(yàn)。）分類：單切和雙切 第12頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收單切：Step1: 酶切體系的選定 確定選用的酶 - 查找對應(yīng)高效率的

6、buffer（常用的buffer有H, M, L, K, T 五種），確定要不要加BSAH, M, L, K, T buffer 都有什么？ H-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-AcetateB-L, G-M, O-H, R-K, Tango-T第13頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收Step2: 配制酶切體系：以10uL體系為例 0.5uL 內(nèi)切酶（含50%甘油防凍） 1uL Buffer (10*) 5uL 質(zhì)粒 3.5uL 去離子水原則： 1） 甘油含量不可超過總體系5%，防止星火性 2） 質(zhì)?？筛鶕?jù)具體情況調(diào)整 3） 內(nèi)切酶切記不可

7、置于常溫！第14頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收Step3: 置于37培養(yǎng)箱中，溫育2-4h。（用水浴也可以，但可能會使溶液因蒸發(fā)而產(chǎn)生濃度不均勻）。注意有些特殊的酶所需的條件有所不同，主要是溫度條件。Step4: 純化，方法同PCR片段純化。Step5: 電泳檢測第15頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收雙切：Step1: 酶切體系的選定 確定選用的兩種酶 - 查找對應(yīng)雙切的Buffer，同時(shí)看與分別單切的高效buffer是否吻合 - 確定要不要加BSAStep2: 配制酶切體系。與單切類似，但需要注意酶的用量。（甘油含量不可超5%.）Step3: 37溫育2-4hStep4: 凝膠回收第16頁，共17頁。分子實(shí)驗(yàn)基本操作酶切及酶切片斷回收凝膠回收：即雙切后將所需要的小片段重新富集純化。Step1: 電泳，電泳過程中稱重一小離心管。Step2: