干旱脅迫對(duì)小麥的生理生化化指標(biāo)的影響1

1、干旱脅迫對(duì)小麥的生理生化化指標(biāo)的影響摘 要：研究干旱脅迫對(duì)小麥生理生化指標(biāo)脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、過氧化 氫(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)、可溶性糖(WSS) 的含量的影響。結(jié)果表明干旱對(duì)這些生理生化指標(biāo)的含量都有影響，經(jīng)干旱脅迫 后Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS的含量顯著升高，且Pro和PPO的含 量升高的幅度極顯著。只有POD的含量經(jīng)干旱脅迫后呈下降趨勢。從總體上看， 經(jīng)脅迫后的小麥抗逆性強(qiáng)于正常生長的小麥。關(guān)鍵詞： 小麥、干旱、Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD植物體生存在自然環(huán)境中，由于自

2、然環(huán)境是個(gè)變數(shù)，其水熱條件隨時(shí)都變化， 對(duì)植物多少會(huì)產(chǎn)生一些影響。凡是對(duì)植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境都被稱為逆境，也稱脅 迫。干旱也屬于逆境，水分在植物的生命活動(dòng)中占主導(dǎo)地位，大多數(shù)植物遭受干 旱逆境后各個(gè)生理過程都會(huì)受到不同程度的影響。植物的生長主要是葉的生長， 但Hsico等(1987年)指出，葉的擴(kuò)展生長對(duì)缺水最為敏感，輕微的脅迫就會(huì)使其受 到明顯限制。擴(kuò)展生長不論是細(xì)胞分裂分化或體積擴(kuò)大，都同時(shí)依賴于水的吸收、 溶質(zhì)的積累和胞壁的松馳。任何能直接或間接影響三者之一的因素均能影響生 長。一當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，會(huì)采取一定的措施來抵抗不良環(huán)境，比如生理生化 指標(biāo) Pro、MDA、H2O2、PPO、G

3、SH、WSS、POD 等發(fā)生變化。小麥?zhǔn)鞘澜缟蟽H次于玉米的第二大糧食作物，也是我國北方主要的糧食作物 之一。世界上約有70%的小麥播種面積分布在干旱、半干旱農(nóng)業(yè)區(qū)。其在生長 過程中，經(jīng)常會(huì)受到干旱的影響，在世界范圍內(nèi)，由于水分所造成的減產(chǎn)，可能 要超過其他因素所導(dǎo)致的產(chǎn)量損失總和。，干旱脅迫下小麥的生理生化特性差異 被認(rèn)為是小麥抗旱性差異的內(nèi)在原因。本次實(shí)驗(yàn)是研究吸脹12小時(shí)萌發(fā)一周后， 干旱處理5天的小麥其生理生化指標(biāo)含量的變化，這可以為抗旱研究作出一點(diǎn)貢 獻(xiàn)。1材料和方法1.1供應(yīng)材料。小麥種子；主要試劑：0.1% HgCl2，TTC，3%磺基水楊酸(SSA)，冰乙酸， 茚三酮，PBS(p

4、H=7.8)，0.6%TBA(用 0. 6% TCA 配制)，PBS (pH=6.8，內(nèi)含 ImMHA)， 0.1%Ti(SO )用 20%(v/v) H SO 配制，PBS, (pH=5.8,內(nèi)含 0. 1 mmol/ LEDTA, 42 一、 .、24一、,1%PVP)， POD反應(yīng)混合液(10 mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L HO,用PBS溶解)， PPO反應(yīng)混合液(20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解)5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7)， 4 mM DTNB用0.1M pH=6.8PBS現(xiàn)配)。主要儀器：分光光度儀，離心機(jī)，試管， 微量加樣器，研缽等。1.2材料處理。經(jīng)

5、發(fā)芽率測定，小麥的發(fā)芽率是100%。小麥f用0.1% HgCl2消毒10 min后-用蒸餾水漂洗干凈-用蒸餾水于 26C下吸漲12 h f 播于墊有6層濕潤濾紙的帶蓋白磁盤(24cmX16cm)中f 于26C下暗萌發(fā)60 h f計(jì)算發(fā)芽率f選取長勢一致的玉米幼苗做干旱、高溫、 鹽漬或低溫下處理(去除較矮或較高的玉米幼苗)。1.3實(shí)驗(yàn)方法。1.31 Pro的提取步驟和結(jié)果。分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組（為干旱處理5天）和對(duì) 照組（不做干旱處理）的胚芽鞘置于研缽中，加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA） 和少許石英砂充分研磨，再用2 mL 3% SSA洗研缽，置于離心機(jī)中，在5000 rpm 下離心10

6、 min，取上清液，定容至5 mL。測定：取上清液各2 mL，分別加入 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑再煮沸15 min，冷卻后，5000 rpm離心10 min， 分別測定A520。AV.520 x V曰x總Pro content =(mmol.g-1FW)，X L X W顯竹表一 Pro正常組和實(shí)驗(yàn)組A520的Pro content正常（對(duì)照組）干旱脅迫（實(shí)驗(yàn)組）Pro content9.95( mol.g-1FW)97.69 ( mol.g-1FW)由圖表可知，正常組的Pro漢兩為9.95 （ mol.g-1FW），而干旱脅迫組的Pro含量為97.69 （ mol.g-1FW），后

7、者是前者的9.8倍。由此可見正常情況下脯氨酸的含量較小，一旦受到干旱脅迫，其含量就會(huì)大幅度增加。1.32丙二醛（皿入）提取。分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（與1.32做相同處理） 置于研缽中，加入3 mL 50mM PBS （pH=7.8）和少許石英砂充分研磨，再用2 mL PBS 洗研缽，置與離心機(jī)中，在5000 rpm下離心10 min，取上清液，定容至5 mL。 測定：分別取上清液各2 mL，加入0.6%TBA （用0.6% TCA配制）2 mL，煮沸 12 min，冷卻后，5000 rpm離心10 min，分別測定OD450和叫弗。OD450 = Ci X 85. 4OD532 = C

8、i X 7. 4 + 155 000 X C2求解方程得Ci/ （mmol/L） =11.71 OD45QC2/ （ptmol/L） =6.45 005320.56 0045。式中，G為可溶性糖的濃度；G為MDA的濃度。正常（對(duì)照組）干旱脅迫（實(shí)驗(yàn)組）可溶性糖（WSS）3.36 mmol/L16.80 mmol/L丙二醛（MDA）0.23823umol/L1.04755umol/L表二 正常組和實(shí)驗(yàn)組A、A下的WSS、MDA濃度450&32由圖表可知，可溶性糖和丙二醛的濃度都是實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組，即受干旱脅迫組的可溶性糖的濃度是正常組的5倍，丙二醛濃度是正常組的4.4倍?？?知，干旱脅迫

9、會(huì)使小麥麥芽鞘的可溶性糖和丙二醛的含量增加。1.33 H2O2提取。分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8, 內(nèi)含1mM HA）和少許石英砂充分研磨，用2 mL PBS洗研缽，5000 rpm離心10 min， 上清液定容至5 mL。測定:分別取上清液各3mL 一加入0.1%Ti（SO ）用20%（v/v） H SO配制1 mL，4 224搖勻一。5000 rpm 離心 10 min，OD。H O content =芒布 乂 V顯 乂 v總（日moLg-1FW）22gX L X WV ra表三 正常組和實(shí)驗(yàn)組OD下的HO濃度正常（對(duì)照組）干旱脅迫（實(shí)驗(yàn)組

10、）H O content38.81(mol.g-iFW)139.29(mol.g-1FW)由以上圖表數(shù)據(jù)可得，干旱脅迫可使小麥胚芽鞘的H2O2含量升高，干旱組是正常 組的3.5倍。2 21.34抗氧化酶的提取。分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（同1.32做相同處理） 置于研缽中，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8內(nèi)含1mM HA）和少許石英砂，充分 研磨，再用2 mL PBS洗研缽，置于離心機(jī)中，在5000 rpm下離心10 min，取 上清液，定容至5 mL。測定：POD測定；取POD反應(yīng)混合液（10 mmol/L愈創(chuàng) 木酚，5 mmol/L HO,用PBS溶解）3.00 ml，

11、加入酶液（提取液）100 ml （空白 調(diào)零用PBS取代）：立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)3 min時(shí)的A470。PPO測定：取 PPO反應(yīng)混合液（20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml；0加入酶液（提取 液）0.2 ml （空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)2 min時(shí)的七。(pmol.gTFWmin-1)POD activities =、xV閂 x V、TxWXt顯PPO activities =人410X V、0.01xWxt V用(U.g-1FW)正常（對(duì)照組）干旱脅迫（實(shí)驗(yàn)組）POD(gmol.g-1 FWmin-1)24.2714.21PPO (U.g-1F

12、W)1501950上表中，過氧化物酶(POD)的含量正常組的是24.27(口mol.g-iFWmin-i)，而實(shí)驗(yàn)組的 是14.21(口mol.gTFWminT)，后者是前者的0.59倍，是所有測的數(shù)據(jù)中唯一正常組大于實(shí)驗(yàn) 組的。多酚氧化酶(PPO)的含量正常組的是150 (U.g-iFW)，而實(shí)驗(yàn)組的是 1950(U.g-iFW)，后者是前者的13倍，可知干旱脅迫會(huì)使小麥胚芽鞘的多酚氧化酶含量劇 增。A412。GSH content =1.35 GSH的提取。分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘(同1.32做相同處 理)置于研缽中，加入3mL 5%三氯乙酸(TCA)和少許石英砂，充分研磨，

13、用2 mL 5% TCA洗研缽置于離心機(jī)中，在5000 rpm下離心10 min，取上清液定容至 5 mL。測定：上清液各1 mL，分別加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7)和0.5 mL 4 mM DTNB用0.1M pH6.8PBS現(xiàn)配，空白用此PBS代替)，25 C5 min，分別測定”mol.g-1FW)412 x V x 總TxTxW顯 V用正常(對(duì)照組)干旱脅迫(實(shí)驗(yàn)組)GSH content1.22(pmol.g-1FW)3.86“mol.g-1FW)由圖表可知，實(shí)驗(yàn)組GSH3.86(mol.g-1 FW)是正常組1.22(mol.g-1 FW)的3.16倍，干旱脅迫會(huì)使

14、胚芽鞘積累谷胱甘肽(GSH)。2討論本次試驗(yàn)我們的結(jié)果是，干旱脅迫小麥胚芽鞘中的脯氨酸(Pro)含量比正常小 麥的多幾倍，即干旱下小麥積累了脯氨酸(Pro)。已有很多試驗(yàn)證明了，干旱脅迫 會(huì)使脯氨酸含量增加。脯氨酸(Pro)是水溶性最大的氨基酸，具有很強(qiáng)的水合 能力，其水溶液具有很高的水勢。脯氨酸的疏水端可和蛋白質(zhì)結(jié)合，親水端可與 水分子結(jié)合，蛋白質(zhì)可借助脯氨酸束縛更多的水，從而防止?jié)B透脅迫條件下蛋白 質(zhì)的脫水變性。因此脯氨酸在植物的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用，而且即使在含水量 很低的細(xì)胞內(nèi)，脯氨酸溶液仍能提供足夠的自由水，以維持正常的生命活動(dòng)。正 常情況下，植物體內(nèi)脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等脅

15、迫時(shí)體內(nèi)的脯氨酸含量 明顯增加。已有人證明了 Pr o的分解代謝開始于它的氧化分解，執(zhí)行此功能的酶 稱為Pro脫氫酶(PDH)，它以FAD為輔因子將Pr。降解為P5C，后者在P5C還原酶(P5CR) 的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代謝的循環(huán)過程。所以，在Pr。的降解過程 中，PDH是Pr。降解的關(guān)鍵酶。在逆境脅迫過程中，PDH的活性往往受到不同程度 的限制，從而削弱了 Pr。的降解過程，因此越來越多的脯氨酸被積累。兩種抗氧化酶，多酚氧化酶和過氧化物酶在干旱脅迫中表現(xiàn)出不同的變化情 況，多酚氧化酶的含量較正常組呈上升趨勢，而過氧化物酶則呈下降趨勢。過氧 化物酶體的標(biāo)志酶是過氧化氫酶，它的作

16、用主要是將過氧化氫水解。過氧化氫（H2O2）是氧化 酶催化的氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，氧化酶和過氧化氫酶都存在于過氧化物酶 體中，從而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。干旱鍛煉提高小麥幼苗抗旱性的抗氧化機(jī)理研究中已 經(jīng)指出，連續(xù)干旱鍛煉的小麥幼苗體內(nèi)的POD活性下降，羥自由基清除能力及總抗氧化力 降低,總體上表現(xiàn)為抗氧化系統(tǒng)受到抑制。高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO作用的結(jié)果， PPO催化多酚氧化為醍，醍聚合并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生黑色素沉淀。 PPO在植物中以潛伏PPO形式存在，與葉綠體膜緊密結(jié)合潛伏形式的通常在成熟、衰老 或脅迫條件下，由于膜受傷害而活化，并導(dǎo)致PPO活性增加。所以綜

17、上所述逆境脅迫下多 酚氧化酶的含量增加，而過氧化物酶則減少。干旱，小麥胚芽鞘中的可溶性糖（WSS）和脯氨酸（MDA）的含量都增加。同樣， 在幾種環(huán)境脅迫對(duì)小麥生理生化影響一文中已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)使小 麥中WSS和MDA含量增加。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂 過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位 置釋放出后，與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松馳， 或抑制蛋白質(zhì)的合成。MDA的積累可能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害，其含量的 多少代表膜損害程度。本次試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)說明，干旱使小麥細(xì)胞膜系統(tǒng)受到一定 的損害。H2O2在本次試驗(yàn)中的結(jié)

18、果是，干旱組的含量更高些。過氧化氫酶大量分布 于動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)，屬于活性氧清除劑，對(duì)H2O2和羥自由基有清除能力，是一種 細(xì)胞保護(hù)酶。大部分研究干旱脅迫對(duì)植物幼苗保護(hù)酶活性影響已經(jīng)證明，在干旱 脅迫中植物體中的過氧化氫酶活性前期升高，但到后期呈下降趨勢。這間接證明 干旱會(huì)是植物體積累過氧化氫。HO過氧化氫是植物代謝中產(chǎn)生的一種產(chǎn)物，其 2 2積累對(duì)細(xì)胞具有氧化破壞作用，在實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)其值的變化，來了解組織的破 壞程度。因此，過氧化氫的含量也是植物逆境的一項(xiàng)指標(biāo)。GSH的N端肽鏈由谷氨酸的Y羧基和半胱氨酸的氨基構(gòu)成，這種特殊結(jié)構(gòu)使得它在細(xì) 胞內(nèi)穩(wěn)定。（徐大勇等，2001），只能被某些特定的存在于

19、質(zhì)膜外側(cè)的Y -GTP清除。（Xiang 等2001），GSH在細(xì)胞中分布并不均勻，如植物細(xì)胞30%分布于細(xì)胞質(zhì)（May等，1998）， Bloch等研究了 GSH得生物合成，并證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)的GSH是由Y谷氨酸合成酶與GSH合 成酶在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-精氨酸和甘氨酸的反應(yīng)合成的。GSH作為生物體內(nèi)最 主要的非蛋白巰基和含量最豐富的低分子量多肽，在植物抗逆中直接參與許多多功能活動(dòng)， 例如（1）參與細(xì)胞內(nèi)許多化合物、藥物及激素代謝；（2）通過“Y谷氨酸循環(huán)”儲(chǔ)存和運(yùn) 輸半胱氨酸，是半胱氨酸的儲(chǔ)存庫；（3）參與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等大分子的生物合成； （4）氧化還原的緩沖池；（5）是硫還原和運(yùn)輸形式之一，維持細(xì)胞內(nèi)硫醇和二氧化硫的平 衡；（6）對(duì)內(nèi)外源性毒物的解毒作用；（7）與其相關(guān)酶共同保護(hù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等 結(jié)構(gòu)成分不被氧化，清除自由基，在抗氧化脅迫中起重要作用；（8）可能是逆境條件下的信 號(hào)物質(zhì)之一。例如當(dāng)細(xì)胞內(nèi)生成少量H2O2時(shí)，GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用