高效液相色譜分析技術(shù)-應(yīng)用陳桂良

1、高效液相色譜分析技術(shù) 上海市食品藥品檢驗(yàn)所1高效液相色譜法應(yīng)用指導(dǎo)原則用于藥品的雜質(zhì)檢查，主要檢查原料及制劑中引入的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，尤其是難于用TLC分離的性質(zhì)相似的有關(guān)物質(zhì)。 用于原料藥的含量測(cè)定，主要用于多組分或含有幾種雜質(zhì)，或因雜質(zhì)干擾，常規(guī)方法又難以分離或分離手段繁雜的品種。 2用于制劑及復(fù)方制劑的含量測(cè)定，主要用于所含雜質(zhì)或賦形劑干擾含量測(cè)定、需先經(jīng)繁雜分離后才能測(cè)定、或各成分間相互干擾的品種。 首選填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠及辛烷基硅膠。如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他填料。首選國(guó)產(chǎn)分離柱，并應(yīng)比較不同分離柱的理論板數(shù)。應(yīng)選擇適宜的通用性較強(qiáng)的分離往。 3流動(dòng)相首選甲醇-水系統(tǒng)，

2、如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他溶劑。為保護(hù)儀器，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相。 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)選擇易得并不對(duì)測(cè)定方法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)，原料藥的含量測(cè)定避免使用內(nèi)標(biāo)法。檢測(cè)器首選UV檢測(cè)器。 用于藥品的雜質(zhì)檢查時(shí)，應(yīng)避免采用峰面積歸一化法。4枸櫞酸氯米芬異構(gòu)體 照高效液相色譜法，用硅膠為填充劑，正已烷-氯仿-三乙胺（80:20:0.1）為流動(dòng)相檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm；理論板數(shù)按順式異構(gòu)體峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，順、反式異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)大于1.3。取本品加流動(dòng)相制成每1ml中含0.10mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，其保留時(shí)間依次為順式異構(gòu)體（E）與反式異構(gòu)體（Z），按峰面積歸一法計(jì)算，

3、供試品中含反式異構(gòu)體應(yīng)為30-50%。5甲氨蝶呤含量測(cè)定照高效液相色譜法（附錄）測(cè)定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-7.0%枸櫞酸溶液-2.0%無(wú)水磷酸氫二鈉溶液（10:10:80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm。理論板數(shù)按甲氨喋呤峰計(jì)算并不低于1000，甲氨蝶呤峰與葉酸峰的分離度應(yīng)不小于8.0。 6測(cè)定法 取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液，精密量取10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取曾測(cè)定干燥失重的甲氨蝶呤對(duì)照品，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。7潑尼松龍含量測(cè)定照高效液相色譜法（附錄）測(cè)定。 色譜條件

4、與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水（65:35）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm。理論板數(shù)按潑尼松龍峰峰計(jì)算應(yīng)不低于1000，潑尼松龍峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于3.5。 8內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取塊諾酮，加甲醇制成每1ml中含1.5mg的溶液,搖勻,即得。 測(cè)定法 取潑尼松龍對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液;精密量取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋成50ml，搖勻,取10l注入液相色譜儀,記錄色譜圖；另取本品適量,同法測(cè)定,按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。9HPLC在藥品質(zhì)量控制中的應(yīng)用 鑒別雜質(zhì)分析復(fù)

5、方制劑分析含量測(cè)定對(duì)照品標(biāo)定10鑒別采用與對(duì)照品在相同條件下進(jìn)行色譜分離并進(jìn)行比較，要求其保留行為和檢測(cè)結(jié)果都相互一致作為鑒別藥品真?zhèn)蔚尿?yàn)證，是一個(gè)較好的方法；選用色譜法進(jìn)行鑒別試驗(yàn)時(shí)，必須要求該色譜條件能保證其與同類藥品有良好的分離，也就是主要有適應(yīng)性試驗(yàn)的內(nèi)容。11取本品與鹽酸去甲萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加水制成每1ml中約含5mg的溶液，照去甲萬(wàn)古霉素含量項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品主峰的保留時(shí)間應(yīng)一致。（鹽酸去甲萬(wàn)古霉素）12在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品峰的保留時(shí)間一致。（醋酸氟氫可的松軟膏） 13空白試驗(yàn)空白試驗(yàn)是指在與供試品鑒別試驗(yàn)完全相同的條件下，除不

6、加供試品外，其它試劑均同樣加入而進(jìn)行的試驗(yàn)。14對(duì)照試驗(yàn)用已知含某類成分的中草藥或純品做陽(yáng)性對(duì)照 ，以排除假陰性的出現(xiàn)15雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則USP對(duì)法定標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)定義較詳細(xì)；BP對(duì)雜質(zhì)的確定和測(cè)定方法說(shuō)明比較具體；ICH對(duì)新藥和新制劑中的雜質(zhì)也有文本介紹。16任何影響藥品純度的物質(zhì)均稱為雜質(zhì)。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)系指在按照經(jīng)國(guó)家有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門依法審查批準(zhǔn)的規(guī)定工藝和規(guī)定原輔料生產(chǎn)的藥品中，由其生產(chǎn)工藝或原輔料帶入的雜質(zhì)，或經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)確證的在貯存過(guò)程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。雜質(zhì)定義17質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)檢查項(xiàng)目的確定主要供新藥的藥學(xué)研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立參考；新藥中發(fā)現(xiàn)的表觀含量在0.1%及以上的雜質(zhì)

7、和降解產(chǎn)物，以及毒性雜質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行定性或確定結(jié)構(gòu)，即至少要確定化學(xué)類別。仿制藥品和變更工藝或原輔料產(chǎn)生的新雜質(zhì)，也應(yīng)這樣進(jìn)行研究。18質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)不包括摻入的或污染的外來(lái)物質(zhì)，不包括變更生產(chǎn)工藝或變更原輔料而產(chǎn)生的新雜質(zhì)。由于假劣藥品的情況復(fù)雜，必要時(shí)采用非法定方法予以檢測(cè)。檢測(cè)對(duì)象19藥品生產(chǎn)企業(yè)變更生產(chǎn)工藝或原輔料，并因由此帶進(jìn)新的雜質(zhì)對(duì)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂，均應(yīng)依法向有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門申報(bào)批準(zhǔn)。20由于雜質(zhì)分類方法較多，難以統(tǒng)一規(guī)定。如USP的 “普通雜質(zhì)”，正文和通法中均有“普通雜質(zhì)”的規(guī)定。ICH的分類：有機(jī)雜質(zhì)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)；有機(jī)雜質(zhì)又分特定雜質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑等。；對(duì)映體有時(shí)也作

8、為雜質(zhì)。雜質(zhì)分類21按化學(xué)類別和特性，雜質(zhì)可分為：有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)、有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)。按其來(lái)源，雜質(zhì)可分為：有關(guān)物質(zhì)（包括化學(xué)反應(yīng)的前體、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等）、其他雜質(zhì)和外來(lái)物質(zhì)等。 22按結(jié)構(gòu)關(guān)系，雜質(zhì)又可分為：其他甾體、其他生物堿、幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體等。按其毒性，雜質(zhì)又可分為毒性雜質(zhì)和普通雜質(zhì)等。普通雜質(zhì)即為在存在量下無(wú)顯著性不良生物作用的雜質(zhì)，而毒性雜質(zhì)為具強(qiáng)烈不良生物作用的雜質(zhì)。23新原料藥和新制劑中的雜質(zhì)，應(yīng)按國(guó)家有關(guān)新藥申報(bào)要求進(jìn)行研究，也可參考ICH（人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)）的文本Q3A（新原料藥中的雜質(zhì)）和Q3B（新制劑中的雜質(zhì)）進(jìn)行研究，并對(duì)雜質(zhì)和降解產(chǎn)物

9、進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)檢查項(xiàng)目的確定24新藥研制部門對(duì)在合成、純化和貯存中實(shí)際存在的雜質(zhì)和潛在的雜質(zhì)，應(yīng)采用有效的分離分析方法進(jìn)行檢測(cè)。25新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)檢查項(xiàng)目應(yīng)包括經(jīng)研究和穩(wěn)定性考察檢出的，并在批量生產(chǎn)中出現(xiàn)的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，并包括相應(yīng)的限度。26除降解產(chǎn)物和毒性雜質(zhì)外，在原料中已控制的雜質(zhì)，在制劑中一般不再控制。原料藥和制劑中的無(wú)機(jī)雜質(zhì)，應(yīng)根據(jù)其生產(chǎn)工藝、起始原料情況確定檢查項(xiàng)目，但對(duì)于毒性無(wú)機(jī)雜質(zhì)，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定其檢查項(xiàng)。27在仿制藥品的研制和生產(chǎn)中，如發(fā)現(xiàn)其雜質(zhì)模式與其原始開發(fā)藥品的不同，或與已有法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不同，需增加新的雜質(zhì)檢查項(xiàng)目的，應(yīng)按上述方法進(jìn)行研究，

10、申報(bào)新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或?qū)υ|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，并報(bào)有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門審批。28共存的異構(gòu)體和抗生素多組分一般不作為雜質(zhì)檢查項(xiàng)目，作為共存物質(zhì)，必要時(shí)，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定其比例，以保證生產(chǎn)用的原料藥與申報(bào)注冊(cè)時(shí)的一致性。但當(dāng)共存物質(zhì)為毒性雜質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)就不再認(rèn)為是共存物質(zhì)。 共存物質(zhì)29雜質(zhì)檢查分析方法應(yīng)專屬、靈敏。雜質(zhì)檢查應(yīng)盡量采用現(xiàn)代分離分析手段，主成分與雜質(zhì)和降解產(chǎn)物均能分開，其檢測(cè)限應(yīng)滿足限度檢查的要求，對(duì)于需作定量檢查的雜質(zhì)，方法的定量限應(yīng)滿足相應(yīng)的要求。雜質(zhì)檢查分析方法和雜質(zhì)的限度30雜質(zhì)檢查分析方法的建立應(yīng)按本藥典的要求作方法驗(yàn)證。在研究時(shí)，應(yīng)采用幾種不同的分離分析方法或不同測(cè)試條件 以

11、便比對(duì)結(jié)果，選擇較佳的方法作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查方法。雜質(zhì)檢查分析方法的建立，應(yīng)考慮普遍適用性，所用的儀器和試材應(yīng)容易獲得。對(duì)于特殊試材，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中寫明。31新藥研究中的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，或在非新藥中發(fā)現(xiàn)的新雜質(zhì)和新降解產(chǎn)物，應(yīng)進(jìn)行分離純化制備，或合成制備，以供進(jìn)行安全性和質(zhì)量研究。對(duì)確實(shí)無(wú)法獲得的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，研制部門應(yīng)在申報(bào)資料和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明中寫明理由。32在用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分離分析的情況下，對(duì)已知雜質(zhì)和毒性雜質(zhì)，應(yīng)使用雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行定位，如無(wú)法獲得該對(duì)照品時(shí)，可用相對(duì)保留值進(jìn)行定位。應(yīng)使用多波長(zhǎng)檢測(cè)器研究雜質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的檢測(cè)情況，并求得在確定的一個(gè)波長(zhǎng)下，已知雜質(zhì)，特別是毒

12、性雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子。33已知雜質(zhì)或毒性雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子在0.91.1范圍內(nèi)時(shí)，可以用主成分的自身對(duì)照法計(jì)算含量，超出0.91.1范圍時(shí)，宜用對(duì)照品對(duì)照法計(jì)算含量。也可用經(jīng)驗(yàn)證的相對(duì)響應(yīng)因子進(jìn)行校正后計(jì)算。34未知雜質(zhì)的定量可用主成分自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算。雜質(zhì)定量計(jì)算方法應(yīng)明確規(guī)定在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中還應(yīng)有單個(gè)雜質(zhì)限量和總雜質(zhì)限量的規(guī)定。由于色譜法雜質(zhì)限度檢查受色譜參數(shù)設(shè)置值的影響較大，有關(guān)操作注意事項(xiàng)應(yīng)在起草說(shuō)明中寫明，必要時(shí)，可在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中予以規(guī)定。35有機(jī)雜質(zhì)的檢查方法,應(yīng)包括全部分析參數(shù),如分析柱,流動(dòng)相流速,流動(dòng)相梯度或溫度梯度,檢測(cè)器類型和相關(guān)設(shè)定(如波長(zhǎng),陰極

13、和陽(yáng)極電壓等),進(jìn)樣體積,樣品濃度,樣品和對(duì)照品的制備,并應(yīng)符合方法驗(yàn)證的要求。在報(bào)告中應(yīng)附標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液的色譜圖(通常3批),用加入法或原料確定產(chǎn)品中的起始原料,副產(chǎn)物和中間體,用強(qiáng)降解(forced degradation)溶液確定潛在的降解產(chǎn)物(potential degradants)。36常用液相或氣相色譜法，有的輔料在色譜上會(huì)誤為雜質(zhì)，所以在報(bào)告中應(yīng)有用輔料的色譜圖，加主成分和不加主成分的，還有空白溶液的色譜圖。 制劑中的有機(jī)雜質(zhì)37報(bào)告中應(yīng)列出全部依據(jù)穩(wěn)定性試驗(yàn)認(rèn)定的確實(shí)在貨架效期會(huì)增多的指定雜質(zhì)，列出名稱，相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)響應(yīng)因子，限度，定量限，檢測(cè)限。應(yīng)提供系統(tǒng)適用性，

14、以保證色譜系統(tǒng)有效。38應(yīng)用實(shí)例：注射用氨芐西林鈉相關(guān)物質(zhì)檢查色譜柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm方法：ChP200539應(yīng)用實(shí)例：注射用頭孢唑林鈉 色譜柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm方法：ChP20051.（1-唑基-1-）醋酸 2.頭孢唑林烷酸水解物 3. 5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-巰基(MMTD) 4. 溶劑峰 7.未知雜質(zhì) 8.頭孢唑林 9.頭孢唑林烷酸40應(yīng)用實(shí)例：注射用阿莫西林克拉維酸鉀相關(guān)物質(zhì)檢查 色譜柱：Synergi Fusion-RP 250 x4.6mm方法：ChP200541應(yīng)用實(shí)例：頭孢克洛膠囊相關(guān)物質(zhì)檢查 色譜柱：S

15、ynergi Fusion-RP 250 x4.6mm方法：ChP20051.3-頭孢克洛 2.頭孢克洛 42含量測(cè)定在原料藥的含量測(cè)定中,高效液相色譜法已大量用于化學(xué)合成藥、多組分的抗生素或生化藥品；方法中所用的對(duì)照品,必須具有純度高、易于制備和性質(zhì)穩(wěn)定等條件；一般不使用內(nèi)標(biāo)物質(zhì),即使使用,應(yīng)選擇易得,并不得對(duì)測(cè)定方法產(chǎn)生干擾的化學(xué)試劑。43高效液相色譜法條件首選色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠及辛烷基硅膠，流動(dòng)相應(yīng)首選甲醇-水系統(tǒng)；理論板數(shù)和分離度的數(shù)值，均系指符合檢測(cè)的最低要求。 44甲氨蝶呤色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-7.0%枸櫞酸溶液-2.0%無(wú)

16、水磷酸氫二鈉溶液（10:10:80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm。理論板數(shù)按甲氨喋呤峰計(jì)算并不低于1000，甲氨蝶呤峰與葉酸峰的分離度應(yīng)不小于8.0。 45測(cè)定法 取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液，精密量取10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取曾測(cè)定干燥失重的甲氨蝶呤對(duì)照品，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。46維生素K1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用硅膠為填充劑，石油醚（60-90）-正戊醇（2000:2.5）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。維生素K1的順、反異構(gòu)體峰之間及順式異構(gòu)體峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。 47內(nèi)標(biāo)溶液的制備

17、 取苯甲酸膽甾酯約37.5mg,置25ml量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。 測(cè)定法 取維生素K對(duì)照品約20mg,精密稱定,置50ml量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取此溶液5ml與內(nèi)標(biāo)溶液1ml,置10ml量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,取10l注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取本品適量,同法測(cè)定。按內(nèi)標(biāo)法以順、反式異構(gòu)體峰面積之和計(jì)算,即得。48復(fù)方制劑HPLC法同時(shí)測(cè)定四環(huán)素可的松眼膏中四環(huán)素和醋酸可的松的含量復(fù)方維生素B制劑復(fù)方感冒片復(fù)方磺胺類藥物復(fù)方激素類藥物HPLC法測(cè)定復(fù)方安乃近片中富馬酸酮替芬的含量等495051 Synergi Hydro-RPSyn

18、ergi Max-RP（C12)Mobile Phase:A: 20mM KH2PO4, pH 4.6B: AcetonitrileGradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 minFlow rate: 1.5 mL/minSample:1. 嗎啡2. 氫嗎啡酮3. 可待因4. 烯丙嗎啡5. 羥考酮Synergi Hydro-RP52測(cè)定對(duì)照品純度方法 檢測(cè)對(duì)照品純度的分析方法取決于它們的用途，分為三類：需用外標(biāo)對(duì)照品進(jìn)行比較的分離分析方法；熱力學(xué)分析方法；其它方法。53分離分析方法色譜法 色譜法常用于雜質(zhì)的鑒別及定量。高效液相色譜法是應(yīng)用最廣泛的色譜方

19、法，TLC和GC也常用。用色譜法分出的單個(gè)成分常常回收后進(jìn)行鑒定。54測(cè)定CRS中的雜質(zhì)時(shí)，要求對(duì)照品與其已知雜質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)值近似；如果在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下，二者的響應(yīng)值有顯著區(qū)別，就須進(jìn)行適當(dāng)?shù)男?zhǔn)以估算雜質(zhì)的含量；二極管陣列檢測(cè)器能夠記錄主峰及雜質(zhì)峰的紫外圖譜，非常有用；LCMS可用于鑒定與主成分分開的雜質(zhì)，適用于鑒定沒有其它對(duì)照物或紅外圖譜的CRS。55HPLC法用于苯唑西林鈉及其制劑中含量和有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定依利特Hypersil BDS苯基柱(5m, 250mm X4.0mm), 0. 02mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.6)一乙睛一甲醇(700 : 225 : 75)為流動(dòng)

20、相，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)225nm，進(jìn)樣量10l。專屬性 與同類抗生素的分離 分解產(chǎn)物的分離56A:苯唑西林;B:氯唑西林; C:氟氯西林; D:雙氯西林57酸破壞堿破壞氧化破壞光照破壞58USP條件59RPHPLC法測(cè)定甲砜霉素及其膠囊劑的含量和有關(guān)物質(zhì)60HPLC法測(cè)定鹽酸氟西汀的有關(guān)物質(zhì)及其膠囊的含量色譜條件為； Bondapak C18 色譜柱(10m，300mmX3.9mm)，四氫呋喃一乙腈一0.8 三乙胺緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.8)(14:21 :65)為流動(dòng)相流速為1.0mLmin，柱溫為30，檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm。鹽酸氟西汀對(duì)照品(Eli Lilly& CoLT

21、D，批號(hào)為001PD5)鹽酸氟西汀原料(951101、951102、951103)，各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，鹽酸氟西汀粗品及膠囊劑輔料，鹽酸氟西汀膠囊(951201、951202、951203)均由上海中西藥業(yè)有限公司提供；鹽酸氟西汀膠囊(B2537NE)為Eli Lilly &CoLTD產(chǎn)品;咖啡因?yàn)楸舅魳印?162HPLC法測(cè)定環(huán)胞素膠囊中環(huán)胞素及降解產(chǎn)物的含量用ODS柱，水-四氫呋喃-0.4mol/L磷酸正丙胺溶液（0.4mol/L正丙胺溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.6）（590：400：10）為流動(dòng)相；柱溫：70；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm。環(huán)胞素膠囊為軟膠囊，所含成分復(fù)雜，除輔料外，可能含有的雜

22、質(zhì)有：環(huán)胞菌素C（CsC）、環(huán)胞菌素B（CsB）、環(huán)胞菌素G（CsG）、環(huán)胞菌素H（CsH）、異環(huán)胞菌素H（IsoCsH）和異環(huán)胞菌素A（IsoCsA），其中CsH 、IsoCsH和IsoCsA均為降解產(chǎn)物，其余為來(lái)源于原料藥的副產(chǎn)物，制劑過(guò)程中不會(huì)增加，一般在原料藥中加以控制，制劑中則可不考慮，但必須能與CsA及降解產(chǎn)物進(jìn)行有效地分離。 63取CsA對(duì)照品和各雜質(zhì)對(duì)照品適量，用乙腈-水（1：1）溶解并稀釋成含CsA0.25mg/ml，CsB、CsG、CsH和IsoCsA分別為0.04mg/ml，CsC和IcoCsH分別為0.02mg/ml的溶液 6465硫酸特布他林片的HPLC測(cè)定色譜柱：W

23、aters Nova-Pak C18(3.915O mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.005 molL樟腦磺酸溶液(20：80)流速1.0 mlmin；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。在上述色譜條件下，其色譜圖見圖1。1、2及1分解產(chǎn)物的峰之間的分離度均大于15。6667HPLC法同時(shí)測(cè)定四環(huán)素可的松眼膏中四環(huán)素和醋酸可的松的含量色譜條件采用依利特HYPERSIL BDSCl8(300mm4.0 mm，5 )為色譜柱，0.01 mol/mL十二烷基硫酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5):乙腈(60：40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.8 mL/ml，柱溫40，進(jìn)樣量20 l6869反相離子對(duì)HPLC法

24、測(cè)定鹽酸多巴酚丁胺的含量及有關(guān)物質(zhì)以Zorbax Rx-C8（4.6 250 mm, 5）為色譜柱，甲醇-四氫呋喃-樟腦磺酸鈉緩沖液（取樟腦磺酸鈉1.3g，加水1000ml使溶解，加三乙胺3ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（20：10：70）為流動(dòng)相，柱溫為40，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速1ml/min ;色譜條件的選擇 :70色譜條件的選擇-有機(jī)相的選擇以Zorbax Rx-C8（4.6 250 mm, 5）為色譜柱，流動(dòng)相中的水相為樟腦磺酸鈉緩沖液（取樟腦磺酸鈉1.3g，加水1000ml使溶解，加三乙胺3ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8，過(guò)濾）。取1mg/ml的強(qiáng)光破壞樣品的0.01mol/L

25、鹽酸溶液進(jìn)樣。分別以甲醇、乙腈、四氫呋喃為有機(jī)相，有機(jī)相在30min內(nèi)線性程序洗脫從0100%，維持10min。結(jié)果以甲醇為有機(jī)相的流動(dòng)相分離效果最佳，四氫呋喃次之，乙腈最差；但有關(guān)物質(zhì)最后出峰時(shí)間以四氫呋喃最短，甲醇和乙腈較長(zhǎng)。為此，選擇甲醇-四氫呋喃為有機(jī)相。經(jīng)優(yōu)化，其比例為2：1。 71離子對(duì)試劑的選擇在溶液中為帶正電荷的陽(yáng)離子，選擇常用的十二烷基硫酸鈉，辛烷磺酸鈉和樟腦磺酸鈉為離子對(duì)試劑，分別進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果以十二烷基硫酸鈉的分離效果最差，辛烷磺酸鈉和樟腦磺酸鈉均較好。鑒于樟腦磺酸鈉價(jià)格便宜，實(shí)驗(yàn)后容易清洗色譜柱，且用量少，故選用樟腦磺酸鈉為離子對(duì)試劑。 72緩沖液pH值及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

26、分別選用pH為2.2、2.5、2.8、3.2、3.5 和4.0的緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果pH為2.2、2.5、 2.8和3.2時(shí)，1主峰的柱效及其與相臨雜質(zhì)峰的分離度幾乎一樣，pH超過(guò)3.5時(shí)，1主峰的柱效下降，峰拖尾。在200400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，1在流動(dòng)相中于221 nm和 280nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但波長(zhǎng)221nm處在含有離子對(duì)試劑的流動(dòng)相中，基線噪音較大，本底較高；故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為280nm。73專屬性(光照) 74專屬性(粗品)75HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定注射用頭孢他啶中碳酸鈉的含量色譜柱：Hypersil SCX（250 mm4.0 mm，5 m，大連依利特公司裝

27、填）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：0.02 molL-1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.8）-乙腈（7030），流速：1.5 mLmin-1；ELSD溫度：40 ，靈敏度（gain）：6，霧化氣體（空氣）壓力：0.35 MPa；進(jìn)樣體積：10 L。 76A系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖1.Li+（7.6 min） 2.Na+（8.3 min） 3.K+（9.6 min）B注射用頭孢他啶供試品溶液色譜圖 77討論-國(guó)外文獻(xiàn)比較選用Zorbax 300-SCX柱，0.05 molL-1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.0）-甲醇（50：50）作流動(dòng)相。該方法的不足之處如下：1）色譜柱價(jià)格較高；2）流動(dòng)相的pH大于

28、7.0，不利于以硅膠為基質(zhì)的填料的穩(wěn)定；3）因SCX填料不及非極性鍵合相填料穩(wěn)定和耐用，緩沖液濃度一般以不大于0.02 molL-1為宜；4）在醋酸鹽溶液-甲醇（50：50）中，醋酸的pKa值由4.8增加為5.5，故該流動(dòng)相的緩沖容量偏低，色譜系統(tǒng)不夠穩(wěn)定；5）該流動(dòng)相的粘度較大，使柱壓較高，對(duì)色譜系統(tǒng)不利。為此擬改用價(jià)格較低的國(guó)內(nèi)裝填的Hypersil SCX柱，并用乙腈代替甲醇。78緩沖液種類、pH、濃度的選擇醋酸銨溶液的離子強(qiáng)度保持恒定，pH在4.86.7之間變化，Li+、Na+和K+的保留值均基本不變，而頭孢他啶的保留值則隨pH的增加而降低，但始終在Li+，Na+和K+之前洗脫。這是因

29、為隨著流動(dòng)相pH的增加，頭孢他啶結(jié)構(gòu)中酸性基團(tuán)的解離程度增加，疏水性降低，故保留減弱。為保證流動(dòng)相有足夠的緩沖容量，醋酸銨溶液的pH選擇為醋酸的pKa值：4.8。與離子交換色譜理論相符，醋酸銨溶液的pH保持不變，離子強(qiáng)度在0.020.10 molL-1范圍內(nèi)變化，Li+、Na+和K+的保留均隨離子強(qiáng)度的增強(qiáng)而減弱，相互間的分離度也相應(yīng)降低。同時(shí)，Na+峰的響應(yīng)值隨著醋酸銨濃度的增加而顯著增加。這符合ELSD的特性：被測(cè)組分峰的響應(yīng)值一般隨著其保留值的減少而相應(yīng)增加。此外，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，醋酸銨溶液濃度增加，基線噪音并未如預(yù)料地相應(yīng)增加。這與文獻(xiàn)報(bào)道10相同。醋酸銨溶液濃度以0.02 mol

30、L-1左右為宜，pH 4.8時(shí)醋酸銨溶液的離子強(qiáng)度約為0.035 molL-1。10.Gard S，Elfakir C，Dreux MCharacterization of sulfobutyl ether-cyclodextrins mixtures by anion-exchange chromatography using evaporative light scattering detectionJ Chromatogr A，2000，897：18579HPLC-蒸發(fā)光散射器檢測(cè)注射用頭孢曲松鈉中鈉離子的含量采用Hypersil SCX柱，以乙腈-0.03mol/L醋酸銨溶液（用冰醋酸

31、調(diào)節(jié)pH值為4.8）（20:80）為流動(dòng)相，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器溫度：40 ，霧化氣體（空氣）壓力：3.5 bar。針對(duì)金屬離子沒有紫外吸收的特點(diǎn)，色譜法中以電導(dǎo)檢測(cè)較為常用 。80Li、Na、K81高效液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定硫酸阿米卡星82色譜柱：Zorbax Extend C18(150 mm4.6 mm，5m)，柱溫：30 ，流動(dòng)相：水一氨水一冰醋酸(96：3.6：0.4)，流速：0.4mL/min，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度：40 ，載氣壓力：350 kPa；進(jìn)樣體積：20L。83首批地紅霉素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的建立采用反相和正相HPLC法確定雜質(zhì)的個(gè)數(shù)和歸一化系數(shù)；采用校正面積歸一化法

32、確定其純度為98.9%；使用DSC法確定其純度為98.7%；干燥失重為0.81%，硫灰為0.11%；84其效價(jià)（u/mg）為： (1-0.0081-0.0011)0.9881000 = 979；驗(yàn)證方法為采用企業(yè)對(duì)照品進(jìn)行微生物檢定法測(cè)定,平均效價(jià)為957u/mg，在誤差范圍之內(nèi)。85鹽酸左沙丁胺醇工作對(duì)照品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的同質(zhì)性,不能使用已有的沙丁胺醇國(guó)家對(duì)照品作為鹽酸左沙丁胺醇的對(duì)照品。在無(wú)法獲得其高一級(jí)對(duì)照品的情況下,采用英國(guó)藥典1998年版的容量分析法(法定方法,高氯酸滴定液經(jīng)國(guó)家基準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀進(jìn)行標(biāo)定)。86滴定法測(cè)得含左沙丁胺醇為87.3%(RSD=0.02%, n=8)；1

33、05干燥至恒重測(cè)得其揮發(fā)性物質(zhì)（水分和殘留溶劑）為0.21%；測(cè)得其無(wú)機(jī)雜質(zhì)（硫灰）為可略量；使用正相HPLC法測(cè)得其右旋體及其他有關(guān)物質(zhì)為0.44%；87按干燥品計(jì)算,含左沙丁胺醇為:(1-0.0044)87.3%/(1-0.0021) = 87.1%采用沙丁胺醇國(guó)家對(duì)照品使用HPLC法進(jìn)行驗(yàn)證，其含量為87.2%，在誤差范圍之內(nèi)。88利福噴丁工作對(duì)照品的建立89準(zhǔn)備工作 利福噴丁精制品由上海黃海制藥責(zé)任有限公司提供，批號(hào)為20010201,符合法定標(biāo)準(zhǔn)。本品對(duì)光、高熱敏感，分裝時(shí)應(yīng)控制溫度且避光。在溫度18、相對(duì)濕度為25%的避光環(huán)境中分裝，每瓶約300mg。90利福噴丁工作對(duì)照品標(biāo)定的原

34、理HPLC在對(duì)照品標(biāo)定工作中的作用越來(lái)越大，但雜質(zhì)的紫外響應(yīng)往往與主藥不一致，導(dǎo)致HPLC-UV檢測(cè)法在標(biāo)定工作中的偏離較大。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）是一種新型的通用型質(zhì)量檢測(cè)器，其響應(yīng)不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)，任何揮發(fā)性高于流動(dòng)相的物質(zhì)均能被檢測(cè)；在相同的色譜條件下，物理性質(zhì)相似的物質(zhì)在ELSD中形成的的顆粒大小、形狀相似，對(duì)蒸發(fā)光的散射能力相同，因而可以給出一致的響應(yīng)。利用這一性質(zhì)，可以標(biāo)定利福昔明工作對(duì)照品。利福平、利福昔明為利福噴丁的同系物，結(jié)構(gòu)相似，且目前已有利福平的液相用國(guó)家對(duì)照品，含量已知，可用于利福噴丁工作對(duì)照品標(biāo)定的佐證。91純度分析揮發(fā)性雜質(zhì)的分析:采用60真空干燥條件下測(cè)

35、得其揮發(fā)性物質(zhì)總量為：5.14%，揮發(fā)性物質(zhì)包括水分和殘留溶劑等，即任何揮發(fā)性高于水分的物質(zhì)的總含量。無(wú)機(jī)雜質(zhì)的分析:采用熾灼殘?jiān)姆椒y(cè)得其無(wú)機(jī)雜質(zhì)總量為：0.04%。92HPLC-ELSD法測(cè)定利福昔明的純度用C8色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇-0.05moL/L醋酸銨溶液（pH5.0）(1：1：4)，流速為1.3 mL.min-1，程序洗脫，柱溫為30。檢測(cè)器溫度為50，Gain為6，空氣流速3.4 Bar。 9394利福平對(duì)照品的HPLC-UV具有5個(gè)有關(guān)物質(zhì) 95三種利福霉素同系物在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器上的響應(yīng)基本一致?？捎糜诶Ｎ裘鞴ぷ鲗?duì)照品的首次標(biāo)定。96最小檢出量及未檢出雜質(zhì)含量的估計(jì):蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定的最低檢測(cè)限以信噪比為3計(jì)，三種利福霉素同系物均為0.03g,以供試品的進(jìn)樣量計(jì)算，大于0.04%的雜質(zhì)均能檢出。利福噴丁工作對(duì)照品純度的確定:在高濃度利福昔明精制品的色譜圖中檢出的雜質(zhì)峰，按主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)的含量，結(jié)果為3.30%，相應(yīng)的利福昔明純度為96.70%（RSD為0.28%，n = 6）。97利福噴丁工作對(duì)照品純度的合成不確定度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度