熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)具體步驟及詳細(xì)說明

1、熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)具體步驟及詳細(xì)說明用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知 的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在 染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交 從而將特定的基因在染色體上定位。探針變性將探針在75C恒溫水浴中溫育5 min，立即置0C,5 10 min，使雙鏈 DNA探針變性。標(biāo)本變性(1)將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50C培養(yǎng)箱中烤片23 h(經(jīng)Giemsa 染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片)。(2 )取出玻片標(biāo)本，將其浸在70 75C的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2x SSC的 變性液中變性23

2、min。(3)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰 乙醇系列脫水，每次5 min,然后空氣干燥。雜交將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 uL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18x18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37C雜交過夜(約15 17h)。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。洗脫此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。(1)雜交次日，將標(biāo)本從37C溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。(2 )將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42 50C的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2xSSC中洗滌

3、3次，每次5 min。(3)在已預(yù)熱42 50C的1xSSC中洗滌3次，每次5 min。(4 )在室溫下，將玻片標(biāo)本于2xSSC中輕洗一下。取出玻片，自然干燥。取200 uL復(fù)染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。雜交信號(hào)的放大(適用于使用生物素標(biāo)記的探針)(1)在玻片的雜交部位加150 uL封閉液I,用保鮮膜覆蓋，37C溫育 20min。(2 )去掉保鮮膜，再加150 uL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37C 繼續(xù)溫育40 min。(3)取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42 50C的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。(4 )在

4、玻片標(biāo)本的雜交部位加150 uL封閉液II,覆蓋保鮮膜，37C溫育20 min。(5)去掉保鮮膜，加150 uL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37C 溫育40 min。(6 )取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42 50C的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室溫清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。（9）取200 uL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。封片可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol （可使封片液產(chǎn)生自 封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封 閉。封好

5、的玻片標(biāo)本可以在-20 -701的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的 激發(fā)波長為490 nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢?發(fā)出綠色熒光。所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長及濾光鏡選擇芒花麝靠1耦費(fèi)波怏伊?xí)r）箕射諛棧俱拍）液用諧腹光FITC520IBrhodamine51157280Texas Red灑技0IVS15570U5455UPI汕615: 癌名9|注意事項(xiàng)相關(guān)溶液的配制1.20 xSSC : 175.3 g NaCl , 88.2 g 檸檬酸鈉，加水至 1 000 m

6、L（用 10 mol/L NaOH 調(diào) pH 至7.0）。去離子甲酰胺（DF）:將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲酰胺 中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號(hào)濾紙濾。體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2xSSC : 35 mL甲酰胺，5 mL 20 xSSC, 10 mL水。體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2xSSC : 100 mL 甲酰胺，20 mL 20 xSSC , 80 mL 水。體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）:65C水浴中融化，4C或-20C保存。雜交液：8 體積分?jǐn)?shù)25%DS , 20 pL 20 xSSC混合。（或40 體積分 數(shù) 50% DS , 20 pL 20 xSS

7、C , 40 pL ddH2O 混合）取上述混合液 50 pL, 與5 pL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS , 2xSSC，體積分?jǐn)?shù) 50% DF。PI/antifade 溶液PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 pg/mL，取出1 mL,加39 mL 雙蒸水，使終濃度為2.5 pg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶 液，使其濃度為10 mg/mL，用 0.5 mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取 上述溶液1 mL,加9 mL甘油，混勻。PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，20C 保存?zhèn)溆?。DAPI

8、/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAP I儲(chǔ)存液，按體積比 1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。封閉液 I：體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 3 mL, 20 xSSC 1 mL,ddH2O 1mL ,Tween20 5 pL 混合。L , ddH2O 750 pL, Tween20 5 pL 混合。熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL, 20 xSSC 1mL,ddH2O 3mL , Tween20 5pL 混合。洗脫液：100 mL 20 xSSC ,加水至 500 mL,加 Tween20 500 pL。相關(guān)溶液的配制1.20 xSSC: 175.3 g

9、 NaCI , 88.2 g 檸檬酸鈉，加水至 1 000 mL （用 10 moI/L NaOH 調(diào) pH 至7.0）。去離子甲酰胺（DF）:將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲酰胺 中。電磁攪拌30 min，用Whatman I號(hào)濾紙濾。體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2xSSC: 35 mL甲酰胺，5 mL 20 xSSC, 10 mL水。體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2xSSC:100 mL 甲酰胺，20 mL 20 xSSC, 80 mL 水。體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）:65C水浴中融化，4C或-20C保存。雜交液：8 體積分?jǐn)?shù)25%DS,20 pL 20 xSSC混合。（或40 體

10、積分 數(shù) 50% DS ,20 pL 20 xSSC,40 pL ddH2O 混合）取上述混合液 50 pL,與5 pL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS,2xSSC,體積分?jǐn)?shù)50% DF。PI/antifade 溶液PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 pg/mL，取出1 mL,加39 mL雙 蒸水，使終濃度為2.5 pg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液， 使其濃度為10 mg/mL，用 0.5 mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述 溶液1 mL,加9 mL甘油，混勻。PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比

11、例充分混勻，20C 保存?zhèn)溆?。DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAP I儲(chǔ)存液，按體積比 1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。封閉液 I：體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 3 mL,20 xSSC 1 mL,ddH2O 1mL ,Tween20 5 pL 混合。封閉液 II :體積分?jǐn)?shù) 5% BSA 3mL,20 xSSC 1mL, goat serum 250pL,ddH2O 750 pL,Tween20 5 |jL 混合。熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL,20 xSSC 1mL, ddH2O 3mL ,Tween20 5混合。洗脫液：100 mL 20 xSSC,加水至 500 mL ,加 Tween20 500 pLo熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH )是一門新興的分子 細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末