細胞工程和基因工程

1、關(guān)于細胞工程與基因工程第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月B C A 生物工程的技術(shù)體系細胞工程的基本原理基因工程的基本原理細胞工程與基因工程第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶生物活性分子天然細胞天然細胞干細胞工程干細胞工程細胞組織器官個體組織工程組織器官個體生物活性分子發(fā)酵工程細胞工程代謝工程分離工程分離工程酶工程采集破碎蛋白質(zhì)工程途徑工程基因工程生物工程的技術(shù)體系細胞工程分離工程分離工程第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞工程的基本原理 細胞工程是指通過組織、細胞、細胞器水平上的篩選和改造，獲得具有商業(yè)價值的人造組織（器官）、工程細胞株或細胞系，再通過

2、規(guī)?；囵B(yǎng)，制備特殊產(chǎn)品的技術(shù)和過程。細胞工程包括：動植物細胞及組織大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動植物細胞融合技術(shù)動植物細胞重組技術(shù)干細胞技術(shù)（組織或器官再生技術(shù)，即組織工程）第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月植物細胞和組織的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)基本原理：植物細胞的分化全能性第五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)基本原理：動物細胞的接觸抑制性第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月動植物細胞融合技術(shù)將兩種不同性狀的細胞在促融劑的幫助下融合在一起，并從中篩選出具有優(yōu)異性能的雜合細胞。例如，B淋巴細胞具有合成特異性抗體的性狀，骨髓瘤細胞具有生長迅速的性狀。將兩者融合，

3、就能篩選到集兩者優(yōu)點的雜合細胞，即單克隆抗體技術(shù)。第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞重組是把不同種類的細胞的部件重新組合裝配，包括細胞核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等，由此獲得具有優(yōu)良性能的重組細胞株或細胞系動植物細胞重組技術(shù)第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)歷277次乳腺細胞核的移植實驗；獲得29個發(fā)育為八細胞胚；使用13頭代孕母親；生出多莉動植物細胞重組技術(shù)第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月骨髓多能干細胞骨髓細胞淋巴細胞網(wǎng)狀細胞紅細胞巨核細胞血小板單核細胞巨噬細胞嗜中酸堿性粒細胞B、T 淋巴細胞干細胞技術(shù)（組織或器官再生技術(shù)）第十張，P

4、PT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程的基本原理切接轉(zhuǎn)增檢第十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的體外重組：切與接用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoRI 的識別序列EcoRI 的切割位點第十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月EcoRI 等產(chǎn)生的 5 粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T

5、-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPOHP第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月PstI 等產(chǎn)生的 3 粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P

6、 OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月PvuII 等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的體外重組：切與接用T4-DNA連接

7、酶連接DNA分子修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的體外重組：切與接用T4-DNA連接酶連接DNA分子連接多個平頭雙鏈DNA分子5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G

8、-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶第十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于

9、2022年6月同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接載體質(zhì)粒BamHISau3AIGGATCCCCTAGGGA

10、TCCTAGBamHISau3AISau3AIGATCCGCTAG第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月不同酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5 5GGATCCCCTAGGCTGCAGGACGTCGATCCG5 5 G5 GACGTCT4-DNA ligase5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 PstICTGCA3 GGGATCCCCTAGGBamHICCTAG5 5 G5 GACGTCCCTAGGATCCGCTGCAG5 G5ACGTCCCTAGGGATCCCTGCAGG混合退火第二十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增：轉(zhuǎn)與增物理轉(zhuǎn)化法：鈣

11、離子誘導的細菌轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化法：病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化細菌接合轉(zhuǎn)化第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定：檢 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于載體遺傳標記篩選抗藥性篩選法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori此類篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非

12、重組子。將外源DNA片段插在EcoRI位點： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcr 將外源DNA片段插在BamHI位點： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcs 第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于載體遺傳標記篩選抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板上；再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上。 在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子。 ApAp + Tc影印挑選第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于載體遺傳標記篩選重組子（Apr + lacZ-） pUC18Aprla

13、cZoriAp + X-gal顯色篩選法第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子： 2.7 kb + 4.0 kb非重組子： 2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子基于克隆DNA序列檢測限制性酶切圖譜法：第二十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pU

14、C18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA：目的重組子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA：目的重組子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb基于克隆DNA序列檢測限制性酶切圖譜法：第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于目標DNA序列鑒定DNA 雜交法影印堿解雜交感光漂洗取膜ATGCCGTA

15、TGTGTCATAGCGGCATACACAGGCGTGTAAATGCGCGTAAATTGTCGTAATGCGTAAGCCCCGTGTAAATGTCGACTAT此類篩選法可區(qū)分目的重組子與非目的重組子。探針第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基于目標DNA序列鑒定PCR 擴增法引物 A引物 B凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物A / BAB非重組子重組子目的重組子第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的克?。ǚ蛛x獲得） 實現(xiàn)基因工程三大用途的前提條件是從生物體基因組中克隆目的基因。目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制及生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基

16、因工程菌（細胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的克隆鳥槍法克隆目的基因cDNA法克隆目的基因PCR法獲得目的基因化學合成法獲得目的基因第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的克隆鳥槍法克隆目的基因基

17、因文庫第三十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的克隆cDNA法克隆目的基因煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1基因文庫5ppp5G G AAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTp 5逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第三十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的克隆PCR法克隆目的基因 DNA復制（生物合成）的基本原理5p-ACCTCGTGTCAAAGCCGTCGATGTACGTTAGCCGC-OH 33HO-TGGAGCACAGTTTCGGCAGCTACATGCAATCGGCG-p 53HO-UCGGCG-p 55p-ACCUCG-OH 3引物引物5 pppNR5 pppN