細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念1細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture） 從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)繁殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞不再形成組織。常用術(shù)語(yǔ)及解釋 體外培養(yǎng)（in vitro）：原意為在試管中，現(xiàn)常與組織培養(yǎng)一詞通用，譯為體外培養(yǎng)。組織培養(yǎng)（tissue culture）：維持組織在體外生長(zhǎng)，也泛指體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)（organ culture）：在體外維持器官、器官的部分或器官的原基生存和生長(zhǎng)的方法。細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液組織培養(yǎng)：使用組織塊（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培養(yǎng)：

2、使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官貼壁肺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長(zhǎng)。 簡(jiǎn)言之：從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。再培養(yǎng)（subculture）：同傳代。傳代（passage）：也稱再培養(yǎng)無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。分離一次再培養(yǎng)稱為傳一代。細(xì)胞株和細(xì)胞系細(xì)胞株：經(jīng)原代培養(yǎng)的組織細(xì)胞，培養(yǎng)到第10代左右，度過第一次死亡危機(jī)后的細(xì)胞群，這種細(xì)胞

3、的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變；細(xì)胞系則被定義為可以度過第二次死亡危機(jī)，傳代培養(yǎng)到4050代的細(xì)胞，這部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了部分改變并且細(xì)胞帶有癌變的特點(diǎn)，這種細(xì)胞在適宜條件下無限傳代。描述任何新的細(xì)胞系時(shí)，均需祥盡說明該細(xì)胞系的特征及培養(yǎng)經(jīng)過，從其他實(shí)驗(yàn)室里取得的細(xì)胞系必須維持該細(xì)胞系的原名。由某一細(xì)胞系分離出來，在性狀上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系，稱該細(xì)胞系的亞系（subline）。 細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。描述一個(gè)細(xì)胞株時(shí)，必須說明它的特殊性質(zhì)或標(biāo)志。與細(xì)胞系類似，如果不能繼續(xù)傳代或傳代代數(shù)有限，可稱為“有限細(xì)胞株（finite cell strain）”。如果可以連續(xù)傳

4、代，則可稱為“連續(xù)細(xì)胞株（continous cell strain）”。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，可稱為亞株（substrain）?？寺。╟lone）則為細(xì)胞株的一種特殊情況，指由一個(gè)細(xì)胞增殖所形成的群體。 單層培養(yǎng)（monolayer culture）：粘附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長(zhǎng)而形成細(xì)胞單層,這種培養(yǎng)方式稱為單層培養(yǎng)。 懸浮培養(yǎng)（suspension culture）：細(xì)胞在培養(yǎng)液中是懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。貼壁依賴性（anchorage-dependent）為細(xì)胞需貼附于底物或支持物上才能生長(zhǎng)的性質(zhì)。貼壁依賴性細(xì)胞（ anchorag dependent cel

5、l ）：細(xì)胞（或培養(yǎng)物）只有貼附于不起化學(xué)作用的物體（如玻璃或塑料等無活物體）的表面時(shí)，才能生長(zhǎng)，生存或維持其功能。 無貼壁性（anchorageindependent）：不依賴于貼附底物或支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)。 匯合（confluent）：細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。 近匯合（sub-confluent）：細(xì)胞在底物上生長(zhǎng)接近，但尚未完全匯合。超匯合（super confluent）：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞附在底物上生長(zhǎng)，匯合后發(fā)展成多層狀態(tài)。接觸抑制（contact inhibition）：細(xì)胞匯合相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。密度抑制（density inhibition）：細(xì)胞數(shù)量到一定數(shù)量后引

6、起抑制增殖的現(xiàn)象。群體密度（population density）：培養(yǎng)底物單位面積上單層細(xì)胞數(shù)目。飽和密度（saturation density）：在特殊培養(yǎng)條件下，每平方厘米（單層培養(yǎng)）或每毫升細(xì)胞懸液內(nèi)可達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)。體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類型 按生長(zhǎng)方式: 2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞， 只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞 可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng) 貼壁(粘附)型細(xì)胞 粘附: 是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式含義 兩方面基于粘附特性，

7、使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織； 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面， 才能生存和生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后，同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞。 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞。 類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位的 外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面 外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同 上皮樣細(xì)胞型 名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于-來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角

8、形，中有圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn) 易相連成片 相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng) 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng) 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不等的突起 中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn) 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng) 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起 每代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期繁殖期維持期衰退期游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時(shí)

9、細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形，折光性強(qiáng)。 約持續(xù)10分鐘一4小時(shí)。貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)開始貼壁。24小時(shí)后大部分細(xì)胞均已貼壁，圓形細(xì)胞變成延展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞立體感強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)顆粒少而透明。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使細(xì)胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的底物附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）。繁殖期（生長(zhǎng)期） 此時(shí)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂。細(xì)胞數(shù)目增多，由幾個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞島到形成良好單層。又可分為四級(jí)：+：細(xì)胞占瓶壁有效面積25%

10、+：細(xì)胞占瓶壁有效面積25% 75%+：細(xì)胞占瓶壁有效面積75% 95%，但仍有空隙+：細(xì)胞占瓶壁95%以上，細(xì)胞已長(zhǎng)滿或接近長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞致密。+ +為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。維持期（平臺(tái)期）： 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，透明度降低，立體感較差。代謝物積累，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變黃。衰退期：細(xì)胞內(nèi)顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。細(xì)胞皺縮，細(xì)胞質(zhì)空泡，衰老死亡，從瓶壁上脫落下來。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1. 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2. 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5

11、% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3. 無污染 4. 無毒 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃 器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料 培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

12、 超凈臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 濾 器 CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣； 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶 常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉、洗潔劑）、浸酸（6-24小時(shí)）、 流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干清洗后的玻

13、璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)（如鉛和砷）等先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干涸后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不

14、掉的微量雜質(zhì)浸泡時(shí)應(yīng)使器皿完全浸沒，且容器內(nèi)部要充滿清潔液，不留氣體死腔（即勿留氣泡或器皿露出清潔液面）浸泡時(shí)間：一般為浸泡過夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強(qiáng)清潔液 63 1000 200 次強(qiáng)清洗液 120 200 1000 弱清潔液 100 100 1000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和耐酸圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分； 配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停地用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇耐酸的陶瓷或塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留

15、污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置，特別是吸管、移液管等如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿后倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用膠塞的清洗新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時(shí)用2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)

16、是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染消毒滅菌方法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121，20min干烤：160, 2 小時(shí)過濾：0.22m化學(xué)消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理1新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染2 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置

17、的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 。培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的

18、溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低 。 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，

19、要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子； 激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10血清。對(duì)于血清支持細(xì)因生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。無血

20、清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，

21、絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清 。 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8095血清 5 20碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100

22、卑位毫升培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10） 細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種。 1、懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2 、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 3、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶

23、消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1. 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 .加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3. 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4. 用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5. 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6. 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7. 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無菌操作防止污染是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。無菌室的滅菌實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備無菌操

24、作的注意事項(xiàng)無菌操作 無菌室的滅菌1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈20-30分鐘，關(guān)閉燈后啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)2分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)。4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。無菌操作實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備1.肥皂洗手。2.穿好工作服、帶好工作帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。How to wash your hands1 濕潤(rùn)雙手并取肥皂或洗

25、手液涂抹2 手掌對(duì)手掌摩擦3手背對(duì)手掌摩擦4 兩手指縫相對(duì)互擦5 雙手并扣互擦指背6 拇指在掌心旋轉(zhuǎn)擦洗7 指尖對(duì)手掌擦洗8 流水沖凈(內(nèi)科無菌洗手法沖水時(shí)雙手須低于肘部；外科無菌洗手法，保持雙手高于肘部）無菌操作注意事項(xiàng) 1. 凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的如盛酒精、PBS、 培養(yǎng)基、 胰蛋白酶等的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面；2. 靠近酒精燈火焰操作（進(jìn)行無菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈）；3. 器皿使用前必須過火滅菌，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口；4. 繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火；5. 各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6. 進(jìn)

26、行培養(yǎng)操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)；不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸局部，不便消毒時(shí)，應(yīng)取備用品更換（吸管、離心管等備用量是使用量的3倍)； 7. 吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染；8. 金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過長(zhǎng)，以防退火。燒過的金屬鑷等要待冷卻后才能夾取組織，以免造成組織損傷；9. 已吸取過營(yíng)養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因吸管頭中殘留營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中； 10.工作臺(tái)面布局：右手使用的物品放置在右 側(cè)，左手使用的物品放置在左側(cè)，酒精燈置于中央； 11.保持順序性：組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露

27、在空氣中；培養(yǎng)用液在未見前，不要過早開瓶，用后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口；12.培養(yǎng)用瓶開瓶以后，皆應(yīng)保持45斜位或平放，開口向上長(zhǎng)時(shí)間直立會(huì)增加落菌機(jī)會(huì)；13.工作中不能面向操作區(qū)域講話或咳嗽，以免把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答培養(yǎng)液pH 值變化太快CO2 張力不對(duì)按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對(duì)應(yīng)CO2 濃度為5 到10改用不依賴CO2 培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1/4 圈NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度 培養(yǎng)液中鹽濃度不正確在CO2

28、 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earles 鹽制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液細(xì)菌、酵母或真菌污染丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌冰凍保存培養(yǎng)液將培養(yǎng)液加熱到37，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH 發(fā)生變化細(xì)菌或真菌污染丟棄培養(yǎng)物抗生素除菌培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物培養(yǎng)液中無貼壁因子培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢 由于更換不同培養(yǎng)液或血清比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度 培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液，換入新鮮配制培養(yǎng)液，補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培