大學課程設計模板

1、血管內皮生長因子對血管生成的作用09050841班 楊志艷、 高小帆 、趙東東題 目目錄： 一、設計目的與意義 三、設計方案 二、血管內皮生長因子的作用及背景 四、實驗設計五、實驗結果六、心得體會 1、通過鞏固、復習以前所學的基礎醫(yī)學知識，結合查閱的相關資料進行實驗設計，使學生掌握生物醫(yī)學實驗設計的基本思路和基本方法，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力和實踐能力。 2、 通過本課程設計使學生對以后的專業(yè)課學習、實踐與畢業(yè)設計等有所幫助。一、設計目的與意義 1、血管內皮生長因子（VEGF），早期亦稱作血管通透因子（VPF)，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在 體內誘導血管新生。 2 、VEGF在內皮細

2、胞中的作用 血管滲透性: VEGF是一個通過刺激內皮細胞上同系受體介導多重功能的多效的生長因子。 VEGF由于其對小靜脈有高滲作用而被命名為VPF。 事實上, VEGF是已知的最有效的VPF,比組織胺要強50 000倍。 由于VEGF及VEGFR途徑在腫瘤血管生成中的中心作用, 它已經是腫瘤學領域藥物發(fā)展和基礎研究的焦點。腫瘤血管的高滲透性被認為與腫瘤細胞表達VEGF有關。 血管高滲透性可導致多種血漿蛋白, 包括纖維蛋白原及其他凝固蛋白的外漏。這種能力可導致纖維蛋白在細胞外間質沉積,最終二、血管生長因子的作用及背景：可延緩水腫液體的清除, 從而使正常組織抗血管生成向促血管生成轉化。VEGF可增

3、加多種血管床的滲透性, 包括皮膚、腹膜、腸系膜和隔膜的血管床, 可導致惡性腹水和惡性腫瘤性胸腔積液等病理狀態(tài)。事實上, 抑制VEGF可減少胸腔積液和腹水的形成。 VEGF增加微血管滲透性的精確機制還不是很清楚。 Dvorak等已經發(fā)現(xiàn)VEGF通過跨內皮細胞途徑誘導大分子從內皮細胞滲出。其他研究者證實VEGF可通過其他跨細胞途徑誘導內皮細胞開窗, 或者是VEGF增加細胞間內皮細胞而打開相鄰內皮細胞間的連接。 最近更多的研究證明VEGF誘導滲透性可能是介導鈣離子依賴通路, 他涉及氧化亞氮生成、激活Akt通路和增加cGMP, 這是除了激活前列腺素的Erk1/2途徑外的一條新途徑。 內皮細胞的激活:

4、VEGF在血管內皮和內皮細胞中發(fā)揮著許多不同的作用。 這些作用包括細胞形態(tài)學的改變, 細胞骨架的變更以及刺激內皮細胞遷移和生長。VEGF可誘導增加許多不同的內皮細胞基因表達, 包括促凝血組織因子和溶解纖維蛋白途徑的蛋白, 其中溶解纖維蛋白途徑的蛋白包括尿激酶, 組織型纖維蛋白溶酶原激活劑, 纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑,尿激酶抑制劑, 金屬基質蛋白酶, 谷氨酸葡萄糖載體, 氮氧合酶, 整合素, 和多種分裂素。 VEGF已經被證實能通過釋放氧化亞氮和前列腺素誘導活體外血管舒張。將VEGF注射入大鼠體內可造成短暫的心動過速, 低血壓和心臟輸出量的減少。VEGF的這種作用可能可以從部分上解釋臨床抗V

5、EGF實驗時偶然發(fā)生高血壓和頭痛的現(xiàn)象。3、VEGF與腫瘤 VEGF可促進內皮細胞滲透、激活、存活、增殖、浸潤和遷移, 與腫瘤血管生成和淋巴管成密切相關, 阻斷VEGF信號途徑可抑制腫瘤的生長和轉移。 腫瘤為自身的生存發(fā)展、創(chuàng)造有利的微環(huán)境, 他可促進其微血管的生成, 獲取豐富的營養(yǎng)供應, 而淋巴管的生成在腫瘤擴散過程中發(fā)揮著更重要的作用, 因此闡明VEGF在腫瘤血管生成合淋巴管生成的機制, 有利于為抗腫瘤治療開辟一條有效的途徑。 新血管的形成是腫瘤生長轉移和傳播過程中的一種基本活動。 因此,在癌癥研究領域, 人們對研究腫瘤血管生成的分子機制十分感興趣。 血管內皮生長因子(VEGF)路徑是這一

6、過程的關鍵調節(jié)者。VEGF/VEGFR軸由多重配基和受體質量 疊加交錯組成,并且受體與配基結合具有專一性, 在不同的細胞中具有不同的細胞類型表達和功能。 啟動VEGFR信號通路,觸發(fā)了一個網(wǎng)狀的信號過程, 從而促進血管內皮細胞生長、轉移和存活。此外, VEGF介導的血管滲透性, 已經被證實與惡性滲出有關.最近, VEGF的一個重要作用表現(xiàn)為可動員內皮祖細胞從骨髓向遠處轉移從而形成新生血管。 VEGF促進腫瘤血管生成的作用和與人類癌癥的發(fā)病機制的關系是確定的, 因而有必要設計和發(fā)展針對這一途徑的抑制因子。 許多的VEGF/VEGFR治療的研究表明, 這些因子能有效地抑制臨床前模型的血管生成和腫瘤

7、生長。因此, 抑制VEGF途徑被確認為是一種重要的有效的抗癌模式。 應用RNAi技術沉默血管內皮生長因子(VEGF)基因,探討其對人結腸癌細胞系HCT116裸鼠移植瘤生長及其血管生成的影響。將自行構建的以VEGF基因為靶向表達短發(fā)夾狀RNA的重組質粒(pAVU6+27-VEGF-siRNA)轉染到結腸癌HCT116細胞株中(C組),以空質粒(pAVU6+27)轉染為陰性對照(B組),經G418篩選出陽性克隆細胞,未轉染質粒的HCT116細胞株為空白對照(A組),建立裸小鼠皮下移植瘤模型。通過測量移植瘤的質量、體積觀察移植瘤生長;免疫組化檢測瘤組織中VEGF蛋白表達及組織內的微血管密度(MVD)

8、改變，得出VEGF在沉默情況下對腫瘤生長及血管生成的影響，從而得到VEGF對腫瘤生長及血管生成的影響。三、設計方案實驗器材與用品： 實驗動物： BALB/c裸小鼠15只, 45周齡,雄性,體質量1923 g,購自中國科學院上海實驗動物中心, SPF實驗室飼養(yǎng)。 實驗試劑：人結腸癌HCT116細胞株，DMEM高糖培養(yǎng)基、標準小牛血清，含U6啟動子的質粒pAVU6+27,表達VEGF shRNA質粒，兔抗人VEGF多克隆抗體,兔抗人因子相關抗原多克隆抗體, S-P 9000免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑盒，G418,DOTAP脂質體轉染試劑。四、實驗設計1細胞培養(yǎng)及轉染細胞培養(yǎng)于含10 %滅活小牛

9、血清, 1105U/L青霉素, 100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于37、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于實驗。采用Roche公司的DOTAP脂質體轉染試劑盒包裹經滅菌處理的重組質粒(質粒脂質體=16)。轉染前1 d,換取新鮮培養(yǎng)液(含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液, 37, 5%CO2孵箱中培養(yǎng))后調整濃度為2105/m,l以每孔2 ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),待細胞增至60% 80%時,將質粒-脂質體復合物轉染至細胞中, 18 h后棄去轉染液,換含新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),棄去原培養(yǎng)液。設計過程 重組質粒和空質粒脂質體轉染HCT116細胞后, 400g/mlG41

10、8篩選1周,實驗組和陰性對照組均可見抗性克隆開始形成,空白對照組細胞全部死亡,換正常培養(yǎng)基繼續(xù)擴大培養(yǎng)。兩組轉染細胞的陽性克隆繼續(xù)細胞擴增、傳代培養(yǎng),取抗性克隆形成1周后細胞進行實驗。轉染重組質粒pAVU6+27-VEGF siRNA的HCT116細胞記為C組,轉染空質粒的pAVU6+27的HCT116細胞作為陰性對照B組,未轉染質粒的HCT116細胞作為空白對照A組。 2裸小鼠移植瘤模型建立將已培養(yǎng)好基本長滿瓶壁的3組HCT116結腸癌細胞PBS液沖洗2次,加入0. 25%胰蛋白酶數(shù)滴消化,將消化好的細胞吸入離心管內, 600 r/min離心6 min,棄上清,加入不含小牛血清的DMEM高糖

11、培養(yǎng)基3 m,l吸管吹打混勻(取適量計數(shù)細胞) ,再離心(600 r/min, 6 min),棄上清,按每只裸小鼠皮下接種細胞數(shù)2. 5107/m,l再加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基,供裸小鼠皮下接種用。準備好的HCT116細胞懸液經臺盼藍染色活細胞數(shù)95%,按每只0. 2 mlHCT116細胞懸液注射于消毒后的裸小鼠背部皮下。 3腫瘤生長的觀察每隔5 d測量腫瘤的長軸(a)和短軸(b),按公式V=ab2/2(cm3)求出近似體積代表腫瘤體積4。 4病理學檢查于第30天脫頸椎處死,剝離腫瘤,標本以4%多聚甲醛固定作組織病理檢查。 5免疫組化技術選取收集的術后病理標本石蠟塊進行5m連續(xù)切片,防脫片

12、處理后進行免疫組化染色。免疫組化S-P法步驟按試劑盒說明進行。VEGF蛋白表達均以細胞質或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,按Breasalier半定量公式5判斷染色結果,在每張切片上隨機選取10個視野,根據(jù)細胞染色強度分為4級,并分別計分:陰性:細胞無著色(0分),弱陽性,淺黃色(1分),中度陽性:棕黃(2分),強陽性:棕褐(3分)。計數(shù)每一強度的視野數(shù),根據(jù)下列公式計算每張切片的平均染色強度( intensity score, IS): IS=(0F0+1F1+2F2+3F3),F為在10倍視野下計數(shù)。 6VEGF蛋白表達測算 7MVD結果判定因子陽性產物呈棕黃色細顆粒狀,定位于血管內皮細胞細胞

13、膜及細胞質。光鏡下先以100倍視野選擇3個微血管染色最豐富區(qū)(新生血管熱點區(qū)) ,然后在200倍視野下計數(shù)每一區(qū)中的微血管,取其平均值。任何被因子染成棕色的內皮細胞或內皮細胞簇必須與鄰近微血管、腫瘤細胞和周圍結締組織分界清楚,才可作為1個微血管計數(shù),管腔大于8個紅細胞及有較厚肌層的血管不計數(shù),背景中陽性染色的漿細胞、白細胞依據(jù)形態(tài)排除. 8統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)均以-xs表示,采用SPSS 10. 0統(tǒng)計軟件進行處理,兩組間均數(shù)比較行t檢驗,多組間均數(shù)比較行單因素方差分析,雙變量行Spearman相關性分析。1裸鼠皮下移植瘤生長情況3組裸鼠皮下單側接種野生型、轉染PAVU6+27及pAVU6+27-

14、VEGF的HCT116細胞后,觀察腫瘤出現(xiàn)的時間、生長速度、腫瘤大小。VEGF靶向的siRNA干擾重組體pAVU6+27-VEGF轉染HCT116細胞后與空質粒組、未轉染組相比,致瘤性下降,腫瘤生長減緩(P005)。見表1。表1各組結腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤比較(n=5,-xs)組別成瘤時間(d) 30 d腫瘤體積(cm3) 30 d腫瘤質量(g)未轉染組7. 331. 53a0. 2560. 016a0. 3240. 026a空質粒組7. 760. 96a0. 2480. 014a0. 3160. 015a重組質粒組12. 502. 03 0. 1690. 009 0. 1920. 022a:

15、P005,與重組質粒組比較五、實驗結果 2各組移植瘤組織的病理檢測結果 2. 1大體形態(tài)重組質粒pAVU6+27-VEGF轉染組皮下腫瘤瘤體較小呈球形,黃白色,質軟,剖面如魚肉,剖面滲血較少;未轉染質粒組及轉染空質粒pAVU6+27組瘤體顯著增大,表面結節(jié)狀,剖面滲血較多。 2. 2光鏡下形態(tài)未轉染質粒組及轉染空質粒pAVU6+27組腫瘤細胞結構完整,細胞大小不均,呈高度異形性,毛細血管較豐富,核/漿比例增大,提示腫瘤生長旺盛;重組質粒pAVU6+27-VEGF轉染組腫瘤細胞結構模糊,毛細血管明顯減少。 2. 3免疫組化結果空載體轉染HCT116細胞和HCT-116細胞荷瘤組織中VEGF均表達

16、強陽性,表達位于腫瘤細胞的細胞質及細胞膜上,呈棕黃色。重組質粒轉染HCT116細胞荷瘤組織中VEGF呈弱陽性表達,組間差異顯著(P005)。重組質粒轉染HCT116細胞荷瘤組織中MVD明顯小于兩對照組,組間差異顯著(P005)。VEGF表達與MVD呈顯著正相關(r=0. 810,P001)。見表2。表2移植瘤組織中MVD和VEGF表達(n=5,-xs)組別MVD VEGF(IS)未轉染組28. 42. 3a2. 100. 12a空質粒組27. 42. 4a2. 040. 14a重組質粒組14. 41. 6 1. 060. 10a:P005,與重組質粒組比較 C組腫瘤瘤塊的體積(0. 1690.

17、 009)cm3和質量(0. 1920. 022)g明顯小于A、B組(P005)。A、B組荷瘤組織中VEGF均表達強陽性,表達位于腫瘤細胞的細胞質及細胞膜上,呈棕黃色。C組荷瘤組織中VEGF呈弱陽性表達,組間差異顯著(P005)。C組荷瘤組織中MVD明顯小于兩對照組,組間差異顯著(P005)。 VEGF表達與MVD呈顯著正相關(r=0810,P001)。結論應用RNAi技術沉默VEGF基因能明顯抑制人結腸癌細胞系HCT116裸小鼠移植瘤的生長,其機制與其抑制移植瘤中VEGF的表達和瘤組織內血管生成有關。 腫瘤的惡性增殖受到多種因素的影響,其中腫瘤血管生長對實體瘤的生長起重要作用,是影響腫瘤生物行為的重要因素。VEGF是一種重要的促血管形成因子,通過增加微血管的通透性和特異性,與血管內皮細胞受體結合,促進血管內皮細胞的分裂和增殖,進而導致新生血管的生成,具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能,而且還以自分泌的形式促進腫瘤細胞自身生長,在腫瘤的發(fā)展、轉移及預后等方面均起著重要的作用。研究表明,在結腸癌中VEGF表達