醫(yī)學專題藥敏與耐藥

1、藥敏與耐藥 -銅綠耐替加 進修醫(yī)師：李思敏 指導老師：歐好12021/7/20 星期二22021/7/20 星期二銅綠假單胞菌-替加環(huán)素敏感！敏感？32021/7/20 星期二疑問：1、為什么天然耐藥的藥物會檢測出敏感？2、銅綠假單胞菌敏感的標準是什么？3、為什么銅綠對替加環(huán)素天然耐藥？4、有什么因素可以影響這個結(jié)果？這個結(jié)果可信嗎？42021/7/20 星期二目錄細菌培養(yǎng)及藥敏1天然耐藥的機制2銅綠與替加耐藥特點3影響銅綠耐藥的因素452021/7/20 星期二什么是細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng)：細菌培養(yǎng)是一種用人工方法使細菌生長繁殖的技術(shù)。細菌在自然界中分布極廣，數(shù)量大，種類多，它可以造福人類，也可以

2、成為致病的原因。大多數(shù)細菌可用人工方法培養(yǎng)，即將其接種于培養(yǎng)基上，使其生長繁殖。培養(yǎng)出來的細菌用于研究、鑒定和應用。細菌培養(yǎng)是一個復雜的技術(shù)。62021/7/20 星期二72021/7/20 星期二細菌培養(yǎng)儀器82021/7/20 星期二92021/7/20 星期二藥敏試驗方法-抑菌圈在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關(guān)系。102021/7/20 星期二抑菌圈11

3、2021/7/20 星期二結(jié)果判斷和報告 用精確度為1mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑。根據(jù)NCCLS標準，作出“敏感”、“耐藥”和“中介”的判斷。幾種抗生素抑菌環(huán)解釋標準及相應的最低抑菌濃度481513141210IU慶大霉素GEN0.582314221315IU紅霉素ERY0.12921282010IU青霉素GP-G敏感耐藥敏感中介耐藥相應的MIC（g/ml）抑菌環(huán)直徑（mm）紙片含藥量抗生素代號122021/7/20 星期二藥敏試驗方法：MICMIC：在與微生物生長速率有關(guān)的特定時間間隔內(nèi)，通常是1824小時，能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度。本院細菌實驗室采用的藥敏方法就是：MIC（儀器自

4、動分析）132021/7/20 星期二MIC測定142021/7/20 星期二不同的藥敏試驗方法，針對不同藥物，可靠性不一樣。所以對不同的細菌、藥物都有明確標準及培養(yǎng)基質(zhì)控標準。152021/7/20 星期二銅綠假單胞菌的抑菌圈和MIC標準162021/7/20 星期二銅綠假單胞菌 抑菌圈直徑及 MIC 解釋標準沒有四環(huán)素（包括替加環(huán)素類），余抗生素MIC最高的標準是=2ug/ml來源于：CLSI抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準172021/7/20 星期二質(zhì)控范圍質(zhì)控菌株在質(zhì)控范圍內(nèi)來確定培養(yǎng)基質(zhì)量182021/7/20 星期二192021/7/20 星期二目錄細菌培養(yǎng)及藥敏1天然耐藥的機制

5、2銅綠與替加耐藥特點3影響銅綠耐藥的因素4202021/7/20 星期二耐藥性又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對于藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細菌的某一株也可存在天然耐藥性。212021/7/20 星期二細菌主要通過以下5種方式對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥： （1） 產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶， 將抗菌藥物轉(zhuǎn)化為無活性的代謝物； （2） 改變靶位結(jié)構(gòu)，使抗菌藥物可作用靶位的數(shù)量減少； （3） 降低細胞膜的通透性， 減少抗菌藥物的進入； （4） 產(chǎn)生生物被膜， 抵御抗菌藥物的殺傷； （5） 當藥物進入細胞后

6、， 以上這些屏障并不能阻止抗菌藥物產(chǎn)生毒性作用， 所以有效地向細胞外泵出藥物是細菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的重要方式222021/7/20 星期二232021/7/20 星期二242021/7/20 星期二天然耐藥膜微孔蛋白缺失鈍化酶的產(chǎn)生主動外排泵銅綠假單胞菌天然耐藥的機制替加環(huán)素252021/7/20 星期二銅綠其他的耐藥機制還有一些機制： 基因原件的轉(zhuǎn)移 耐藥基因的突變 -酰胺酶 膜通透性的減低 生物膜形成獲得性耐藥適應性耐藥262021/7/20 星期二目錄細菌培養(yǎng)及藥敏1天然耐藥的機制2銅綠與替加耐藥特點3影響銅綠耐藥的因素4272021/7/20 星期二銅綠-替加銅綠假單胞菌對替加環(huán)素天

7、然耐藥， 其細胞膜上的主動外排系統(tǒng)是重要因素。根據(jù)全基因組序列分析， 推測銅綠假單胞菌至少有12種主動外排泵， 到目前為止已發(fā)現(xiàn)了7種， 其中MexXY外排泵在銅綠假單胞菌對替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥的過程中起關(guān)鍵作用 。MexXY外排泵在野生株和耐藥株中均存在， 可介導銅綠假單胞菌的天然耐藥與獲得性耐藥。MexXY外排泵除了導致銅綠假單胞菌對替加環(huán)素耐藥， 尚可引起其對氨基糖苷類藥、 紅霉素和氟喹諾酮類藥耐藥， 外排泵中的任一組分失活都將導致銅綠假單胞菌對抗菌藥物的敏感性大大提高。MexXY外排泵中， MexY是內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白， MexX是膜融合蛋白。MexXY 的 2 種蛋白由操縱子 mexXY 所編

8、碼，mexXY操縱子缺失外膜蛋白基因， MexXY可利用其他外排泵的外膜蛋白作為自己的外膜蛋白。mexZ是MexAB外排泵的調(diào)節(jié)基因， 位于mexXY基因上游， 轉(zhuǎn)錄方向與mexXY基因相反； 其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物MexZ蛋白為阻遏蛋白， 可抑制mexXY基因的表達。當其突變時， 可導致阻遏功能被抑制， 使得mexXY基因表達增強， 從而導致細菌耐藥。282021/7/20 星期二替加-銅綠替加環(huán)素是首個用于臨床的甘氨酞環(huán)素類抗菌藥物，不受四環(huán)素類兩大耐藥機制(核糖體保護和外排機制)的影響，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及厭氧性細菌均有非常高的活性。多個回顧性分析，顯示替加環(huán)素對多重耐藥革蘭陽性菌及陰性菌均有

9、較好的體外藥敏活性(除外銅綠假單胞菌)，對革蘭陽性球菌的抗菌活性最強。銅綠假單胞菌對替加環(huán)素MIC50/90均為8ug/ml另有研究提示替加環(huán)素對銅綠假單胞菌MIC90為32ug/ml。292021/7/20 星期二銅綠外排系統(tǒng)的表達外排MexAB-OprM、MexXY-OprM在野生菌中即有低表達主動外排系統(tǒng)在多重耐藥銅綠假單胞菌中普遍高表達， 并且有多重表達銅綠主動外排泵系統(tǒng)有基因變異的現(xiàn)象，那么我們可設想其存在低表達和不表達的變異，目前有研究者在抗生素的進一步研究中提到抑制細菌外排泵的表達302021/7/20 星期二疑問：1、為什么天然耐藥的藥物會檢測出敏感？2、銅綠假單胞菌敏感的標準

10、是什么？3、為什么銅綠對替加環(huán)素天然耐藥？4、有什么因素可以影響這個結(jié)果？這個結(jié)果可信嗎？312021/7/20 星期二病歷報告分析目前沒有替加環(huán)素對銅綠藥敏鑒別的相關(guān)標準。據(jù)我們所得的報告，提示MIC=0.5，雖然無相關(guān)標準，與既往相關(guān)替加對銅綠的MIC的報道不相符，且據(jù)濃度提示確實達到敏感。如果對銅綠假單胞菌的判斷是正確的，那么這株銅綠有可能是變異株對可疑變異株，可考慮傳代后再培養(yǎng)及藥敏有些報告可能提到敏感只代表體外活性，體內(nèi)抗生素不一定有效，但這一項主要是針對適應性耐藥、獲得性耐藥。是否對天然耐藥有影響并不清楚該患者兩次培養(yǎng)為同一菌群，同一藥敏結(jié)果，是否為變異株，需等候檢驗科老師進一步定

11、論322021/7/20 星期二是否還存在其他原因及機制還需要有興趣的同道進一步查詢。332021/7/20 星期二謝謝聆聽！342021/7/20 星期二352021/7/20 星期二銅綠的外排系統(tǒng)可能有低表達多重藥物排除系統(tǒng)可能牽涉到細胞膜的流通性 ,不僅僅是作為回應環(huán)境的壓力, 更是在細菌自然生長時處理可能發(fā)生的細胞膜損傷. 當綠膿桿菌面對外來添加許多用來損壞細胞的試劑時,會通過細胞膜上的外排系統(tǒng)將有害物質(zhì)送出 ,以降低這些物質(zhì)對病原菌的傷害 ,而此系統(tǒng)的基因會就會相應的被大量表現(xiàn)出來面對這種環(huán)境壓力 . 谷胱甘肽 ( G S H ) 是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑 , 由谷氨酸 、 半胱氨酸

12、和甘氨酸結(jié)合而成的三肽 ,半胱氨酸上的巰基為其活性基團 ,具有重要的抗氧化作用和整合解毒作用. 當細胞內(nèi)生成少量 H 2 O 2 時 , G S H 在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下 ,把 H 2 O 2 還原成 H 2 O , 其自身被氧化為氧化性谷胱甘肽( G S S G ) , G S S G在的谷胱甘肽還原酶催作用下 ,接受 H還原成 G S H , 從而使體內(nèi)自由基的清除反應能夠持續(xù)進行 10. 因此谷胱甘肽作為細胞內(nèi)抗氧化作用的第一道防線, 對于保護細胞免受氧化壓力的損傷起著至關(guān)重要的作用. 我們猜測還原性谷胱甘肽在氧化壓力下轉(zhuǎn)變成氧化性谷胱甘肽可能是一種信號,促使外排系統(tǒng)表達. 當細

13、胞內(nèi)缺失谷胱甘肽時 ,這種信號中斷 ,引起 M e x X Y 的低表達362021/7/20 星期二膜微孔蛋白缺失 銅綠假單胞菌產(chǎn)生幾種和天然耐藥有關(guān)的蛋白通道， 主要的通道是 OPrF，大多數(shù)分子能穿過 OprF，但實際上并不是很多分子穿過 OprF 通道。有文獻顯示， 缺失 OprF 通道并沒有使細菌不產(chǎn)生耐藥。銅綠假單胞菌上的特殊通道還包括:OprB(糖蛋白特殊通道)、OprP(磷酸鹽特殊通道)、 OprO(多聚磷酸鹽特殊通道)、OprD(帶正電荷的氨基酸特殊通道)。目前已經(jīng)清楚， 亞胺培南和其他碳青霉烯類通過孔蛋白 OprD 穿過細胞膜， 而其他 內(nèi)酰胺類不能利用 OprD， 蛋白的

14、缺失增加了碳青霉烯類的耐藥性372021/7/20 星期二鈍化酶產(chǎn)生 主要包括 內(nèi)酰胺酶及氨基糖甙類鈍化酶， 大多數(shù)酶是銅綠假單胞菌由質(zhì)粒編碼從外界獲得的。 內(nèi)酰胺酶主要包括 AmpC 酶、超廣譜 內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及金屬酶(MBL)， AmpC是一種由染色體編碼的鈍化酶， 其編碼 內(nèi)酰胺酶， 內(nèi)酰胺酶能夠破壞 內(nèi)酰胺環(huán)， 從而使 內(nèi)酰胺類抗生素喪失結(jié)合位點。AmpC 酶的產(chǎn)生使銅綠假單胞菌對除碳青霉烯類以外的所有 內(nèi)酰胺類產(chǎn)生耐藥。氨基糖苷類鈍化酶能導致藥物不易進入菌體內(nèi)， 也不易與細菌內(nèi)靶位(核糖體 30s 亞基)結(jié)合， 從而失去抑制蛋白質(zhì)合成的能力 382021/7/20 星期二主動

15、外排泵 就是擁有將藥物泵出細胞的外排泵。銅綠假單胞菌外排泵是一種質(zhì)子泵， 可將多種藥物泵出細胞并參與生物被膜形成，從而產(chǎn)生多重耐藥這些外排泵引起銅綠假單胞菌對大環(huán)內(nèi)酯類、 內(nèi)酰胺類、 氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素耐藥， 只有多黏菌素類藥物不能通過外排泵泵出體外。MexXY- OprM 是近來研究最多的一類多重主動外排泵系統(tǒng)， 它除了能泵出喹諾酮類藥物， 還能泵出氨基糖甙類、 四環(huán)素類藥物。在臨床分離的耐藥株中， 已發(fā)現(xiàn)主動外排機制與型拓撲異構(gòu)酶突變共同存在， 而多種耐藥機制在同一菌株中同時存在， 容易產(chǎn)生菌株對藥物的高耐藥性。392021/7/20 星期二獲得性耐藥當長期應用抗生素時，占多數(shù)的

16、敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。目前認為后一種方式是產(chǎn)生耐藥菌的主要原因。為了保持抗生素的有效性，應重視其合理使用402021/7/20 星期二412021/7/20 星期二藥敏試驗折點的建立 1. MIC的分布2. 藥代動力學和藥效學 定 MIC的折點3. 臨床療效和細菌清除率4. 抑菌圈直徑的分布 定抑菌圈折點統(tǒng)計學的線性回歸計算錯誤率：盡可能減少極重要誤差 (假敏感率)422021/7/20 星期二432021/7/20 星期二藥敏試驗的錯誤來源體內(nèi)、體外試驗的不一致性某些菌測某些藥，結(jié)果有誤頭孢菌素、氨基糖甙類：沙門菌、志賀菌頭

17、孢菌素：李斯特菌屬頭孢菌素、氨基糖、克林、TMP/SMZ：腸球菌Beta內(nèi)酰胺類：MRS即使敏感，也應報告耐藥某些細菌對某些抗生素天然耐藥則不需要做藥敏試驗442021/7/20 星期二1.3.1替加環(huán)素判定標準分析替加環(huán)素是首個用于臨床的甘氨酞環(huán)素類抗菌藥物，目前CLSI尚無替加環(huán)素的藥敏結(jié)果判定標準，美國FDA和歐洲EUCAST中的替加環(huán)素折點有所差異，差別主要在于革蘭陰性桿菌。本研究采用FDA及EUCAST標準分別檢測2264株臨床多重耐藥革蘭陰性菌及革蘭陽性菌對替加環(huán)素的體外藥敏活性，分析不同判定標準下替加環(huán)素的藥敏結(jié)果。對于革蘭陽性球菌，F(xiàn)DA及EUCAST敏感折點相同，兩種判定標準

18、下MRSA, MRSCN替加環(huán)素敏感率相同。對于革蘭陰性桿菌，F(xiàn)DA及EUCAST折點相差1個稀釋度，采用EUCAST折點后，革蘭陰性菌敏感率下降，其中大腸埃希菌敏感率變化最小，敏感率仍保持在98%以上;而肺炎克雷伯菌及鮑曼不動桿菌敏感率變化較大，肺炎克雷伯敏感率下降了18.8%，鮑曼不動桿菌敏感率則下降了33.3%o Zarkotou等(8J采用微量肉湯稀釋法檢測部分革蘭陰性菌對替加環(huán)素體外活性，結(jié)果顯示，采用EUCAST判定折點后肺炎克雷伯菌及鮑曼不動桿菌菌株對替加環(huán)素敏感率分別下降了20.0%,452021/7/20 星期二Alterations of OprD in carbapene

19、m-intermediate and -susceptible strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with bacteremia in a Spanish multicenter studyWe investigated the presence of OprD mutations in 60 strains of metallo-lactamase-negative Pseudomonas aeruginosa intermediately susceptible (IS n = 12; MIC = 8 g/ml

20、) or susceptible (S n = 48; MICs 1 to 4 g/ml) to imipenem and/or meropenem that were isolated from patients with bacteremia in order to evaluate their impact on carbapenem susceptibility profiles. The presence of mutations in oprD was detected by sequencing analysis. OprD expression was assessed by

21、both outer membrane protein (OMP) analysis and real-time PCR (RT-PCR). Fourteen (23%) isolates had an OprD identical to that of PAO1, and OprD modifications were detected in 46 isolates (77%). Isolates were classified as OprD full-length types (T1 n = 40, including both wild-type OprD and variants s

22、howing several polymorphisms) and OprD deficient types (T2 n = 3 for OprD frameshift mutations and T3 n = 17 for premature stop codons in oprD). RT-PCR showed that 5 OprD type T1 isolates presented reduced transcription of oprD (0.1- to 0.4-fold compared to PAO1), while oprD levels increased more th

23、an 2-fold over that seen with PAO1 in 4 OprD type T1 isolates. A total of 50% of the isolates belonging to OprD deficient types were susceptible to both carbapenems, and 40% were susceptible to meropenem and intermediately susceptible to imipenem. Only one isolate (5%) within this group was intermed

24、iately susceptible to both carbapenems, and one (5%) was susceptible to imipenem and intermediately susceptible to meropenem. We concluded that OprD inactivating mutations in clinical isolates of P. aeruginosa are not restricted only to carbapenem-resistant isolates but are also found in isolates wi

25、th imipenem or meropenem MICs of only 0.06 to 4 g/ml.462021/7/20 星期二外排泵 、 在野生株中即有低度表達， 并導致其對多種抗生素的固有耐藥和獲得性耐藥。 表達的輕微升高就可提高耐藥水平， 可引起對美羅培南、 氨曲南等 內(nèi)酰胺類、 氟喹諾酮類抗菌藥物、 四環(huán)素類和 內(nèi)酰胺酶抑制劑的耐藥。 是近來研究最多的一類多重耐藥主動外排系統(tǒng)， 可介導銅綠假單胞菌的固有耐藥和獲得性耐藥。 外排泵高度表達可引起對氨基糖苷類抗生素、 紅霉素和氟喹諾酮類藥物耐藥。472021/7/20 星期二替加環(huán)素的作用機制與四環(huán)素類抗生素相似，都是通過與細菌30

26、S核糖體結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)移RNA的進入，使得氨基酸無法結(jié)合成肽鏈，最終起到阻斷細菌蛋白質(zhì)合成，限制細菌生長的作用。但替加環(huán)素與核糖體的結(jié)合能力是其它四環(huán)素類藥物的5倍。說明本品抗細菌耐藥性的能力優(yōu)于其它四環(huán)素類藥物。替加環(huán)素的抗菌譜包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和厭氧菌，體外實驗和臨床試驗顯示，替加環(huán)素對部分需氧革蘭氏陰性菌（如弗氏枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌和肺炎克雷伯氏菌、鮑曼氏不動桿菌、嗜水氣單胞菌、克氏枸櫞酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、出血敗血性巴斯德菌、粘質(zhì)沙雷菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌等）敏感。銅綠假單胞菌對替加環(huán)素耐藥。482021/7/20 星期二492021/7/20 星期二

27、 采用Vitek-2 compact配套藥敏卡片進行體外藥敏試驗，操作和藥敏解釋標準按照美國臨床實驗室標準化研究院(CLSI) 2010年版12j進行。替加環(huán)素分別采用美國FDA標準及歐洲EUCAST標準，F(xiàn)DA和EUCAST對革蘭陽性球菌的敏感折點相同:葡萄球菌屬(0.5p,g/ml為耐藥)，腸球菌屬(_0.5.g/ml為耐藥);對于革蘭陰性菌有所不同，F(xiàn)DA標準:腸桿菌科及不動桿菌屬C _2 lxg/ml為敏感，8 I留ml為耐藥)，EUCAST折點:腸桿菌科及不動桿菌屬(l N留ml為敏感，2g1m1為中介，2 !創(chuàng)為耐藥)，銅綠假單胞菌無折點IIl0502021/7/20 星期二替加環(huán)素替加環(huán)素屬于新一類抗生素，是已知甘氨