轉(zhuǎn)化酶的測定

1、轉(zhuǎn)化酶又稱蔗糖酶，是一種水解酶，植物體的庫組織中，一般含有較高活性的轉(zhuǎn)化酶，它 能將植物體內(nèi)的主要同化產(chǎn)物一一蔗糖不可逆的水解為葡萄糖和果糖，為細胞的可溶性糖貯 庫提供可利用六碳糖，以用于細胞壁、貯藏多糖及果聚糖的生物合成，并通過與呼吸作用偶 聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，所以，轉(zhuǎn)化酶與植物組織的生長有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)化和利用、植物細胞代謝及生長強度的指標。試劑：1、10%蔗糖溶液2、葡萄糖標準液(500p g/ml)3、0.05mol/l的磷酸緩沖液4、(DNS) 3，5二硝基水楊酸：將6.3g二硝基水楊酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到 500ml含有185g酒石酸

2、鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻 后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。方法：1、酶的提取：1g樣品剪碎后，用預(yù)冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100ml， 在冰箱中浸提3小時，4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，上清液即為酶的粗提液。2、酶活性的測定：吸酶液2ml,放入試管中，再加入pH6.0的緩沖液5ml及10%蔗糖溶 液1ml，在37度水浴中保溫30分鐘，取出后立即按3, 5二硝基水楊酸法測定還原糖的含量。 以煮沸酶液10分鐘鈍化酶的試管作對照。3、還原糖標準曲線的制作及還原糖含量的測定標準曲線：取6支20ml刻度試管，編號，按下表配置不同濃度的葡萄糖標準

3、液：管號123456葡萄糖原液量(ml)00.40.81.21.62.0加蒸餾水量(ml)2.01.61.20.80.40葡萄糖濃度(p g/ml)0100200300400500在上述各管中分別加入1.5ml 3, 5二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立 即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加蒸餾水定容至20ml，混勻，以1號管為空白，測540nm 波長下的OD值。以O(shè)D值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。酶反應(yīng)液中還原糖的含量的測定：吸取2ml反應(yīng)液，加入1.5ml 3, 5二硝基水楊酸試劑， 沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻定容至20ml，測定540nm波長下的OD值，查標準

4、曲線得酶反 應(yīng)液中還原糖的濃度。4、結(jié)果計算：A=(N-N)*V/(T*W*1000)A：轉(zhuǎn)化酶的活性(mg/gfw/h)N：酶反應(yīng)液中還原糖的濃度(p g/ml)N：鈍化酶反應(yīng)液中還原糖的濃度(p g/ml) V：酶反應(yīng)液的總體積T：反應(yīng)時間W：材料鮮重方法：1、酶的提?。?g樣品剪碎后，用預(yù)冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100ml, 在冰箱中浸提3小時，4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，上清液即為酶的粗提液。2、酶活性的測定：吸酶液2ml，放入試管中（以煮沸酶液10分鐘鈍化酶的試管作對照）， 加入pH6.0的緩沖液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保溫30分鐘，取出后立即吸取 2ml

5、加入1.5ml 3，5二硝基水楊酸試劑，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻定容至20ml，測定540nm 波長下的OD值，查標準曲線得酶反應(yīng)液中還原糖的濃度：Y 3 g/ml）=744.63*OD值3、結(jié)果計算：A=Y*V/（T*W*1000）（一般范圍 1440mg/g/fw/h）A：轉(zhuǎn)化酶的活性（mg/gfw/h）Y :上式計算得酶反應(yīng)液中還原糖的濃度（pg/ml）V：酶反應(yīng)液的總體積100mlT：反應(yīng)時間0.5hW：材料鮮重（fw）一個處理3次重復(fù)所需試驗臺儀器：容量瓶（100ml）刻度試管（20mlx4，1個對照），移液管（5mlx1，2mlx1，1 ml x1），研缽試劑：10%（w/v）蔗糖

6、溶液現(xiàn)用現(xiàn)配：稱取10g加入用蒸餾水定容至100ml.。葡萄糖標準液（500 g/ml）： 80度烘干葡萄糖0.05克蒸餾水定容100ml。PH=5.4,5%的磷酸緩沖液：Na2HPO4 - 12.H2O0.448125g, NaH2PO4 - 2H2O 3.731125g,加水 溶解定容至250ml.（DNS） 3，5二硝基水楊酸：將6.3g二硝基水楊酸和262 ml 2mol/l或20.96gNaOH溶液， 加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚（即苯酚）和5g亞硫酸鈉， 攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。預(yù)冷蒸餡水1000ml.（一個

7、處理，3次重復(fù)）1g左右樣品1份，剪碎1F預(yù)冷的蒸餾水研磨成勻漿1 F蒸餾水定容至100ml1 r冰箱中浸提至少3小時*混均，倒入4個離心管，在4000轉(zhuǎn)離心15分鐘】r分別吸2ml上清液，放入4個試管1 r其中任選1個試管煮沸至少10分鐘作對照，此后（包括煮沸10分鐘的對照試管）各試管加PH6.0的緩沖液5ml，10%蔗糖溶液1m】r37度水浴中保溫30分鐘取出后分別加入1.5ml 3, 5二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5分鐘1 r取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫加蒸餾水定容至20ml,540nm比色(讀數(shù)即為OD值)轉(zhuǎn)化酶的測定10%(w/v)蔗糖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配：稱取10g加入用蒸餾水定容至100ml葡萄糖標準液(500g/ml)：葡萄糖標準液:80度烘干葡萄糖0.05克蒸餾水定容100ml。PH=5.4,5%的磷酸緩沖液:Na2HPO4 12.H2O0.448125g, NaH2PO4 - 2H2O 3.731125g,加水 溶解定容至250ml.(DNS) 3, 5二硝基水楊酸：將6.3g二硝基水楊酸和