生物化學(xué)檢驗技術(shù)研究進(jìn)展新

1、生物化學(xué)檢驗技術(shù)研究進(jìn)展 趙曉君主要內(nèi)容生化檢驗的發(fā)展簡史1生化檢驗的常規(guī)技術(shù)2生化檢驗的新興技術(shù)3生化技術(shù)的臨床應(yīng)用4概念 臨床生物化學(xué)是研究器官、組織人體體液的化學(xué)組成和進(jìn)行著的生物化學(xué)過程，以及疾病、藥物對這些過程的影響，為疾病診斷、病情監(jiān)測、藥物療效、預(yù)后判斷和疾病預(yù)防等各個方面提供信息和理論依據(jù)。臨床生物化學(xué) 19世紀(jì)以來，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展和實驗室檢測需求的增加，一些化學(xué)家利用化學(xué)分析的手段實現(xiàn)了對人類體液、血液某些生化指標(biāo)的定量分析，如血糖、尿素氮等，繼之又逐漸建立了一些酶活性的測定方法，這些利用化學(xué)手段建立的用于分析患者體液、血液特定化學(xué)成分的方法對促進(jìn)臨床醫(yī)學(xué)由經(jīng)驗醫(yī)學(xué)向現(xiàn)代

2、醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變起了巨大的促進(jìn)作用，逐漸形成了一門獨立的學(xué)科 臨床化學(xué)(Clinical Chemistry)，國內(nèi)習(xí)慣稱此學(xué)科為生化檢驗。此學(xué)科一直延續(xù)到今天，已發(fā)展壯大為不可缺少的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。臨床生物化學(xué)發(fā)展的重大突破“臨床化學(xué)”名稱的由來體液生物化學(xué)組分的分析應(yīng)用及“細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定”概念 比色法和光度法在臨床生物化學(xué)實驗室中的應(yīng)用 血清酶活力測定作為細(xì)胞和組織損傷的指標(biāo)治療性藥物監(jiān)測成為臨床生物化學(xué)的一個重要分支 超微量的儀器分析、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、放射性同位素等技術(shù)在生物化學(xué)實驗室中的應(yīng)用 自動化裝置和超微分析生化檢驗的常規(guī)技術(shù)一、光譜分析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)四、層析技術(shù)五、電化學(xué)

3、分析技術(shù)光譜分析技術(shù) 定義：利用各種化學(xué)物質(zhì)(包括原子、基團(tuán)、分子及高分子化合物)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系的特征，來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)，稱為光譜分析技術(shù)。根據(jù)物質(zhì)對光譜響應(yīng)特征的不同，可把光譜分析技術(shù)分為發(fā)射光譜分析技術(shù)、吸收光譜分析技術(shù)和散射光譜分析技術(shù)三大類。它既可以研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也可以對特定物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。分光光度法原理：利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計 。應(yīng)用：氨基酸含量的測定、蛋白質(zhì)含量的測定、核酸的測定、酶活力測定、生物大分

4、子的鑒定和酶催化反應(yīng)動力學(xué)的研究 層析技術(shù) 原理：層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。分類吸附層析分配層析凝膠層析離子交換層析親和層析聚焦層析離子交換層析（ion-change chromatography）原理基質(zhì) 疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用 制備純化生物物質(zhì) 定量、定性測定混合物

5、中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度親和層析（affiuity chromatography）應(yīng)用 分離純化酶、抗原、抗體 分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b. 活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑+雜質(zhì)c. 待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d. 偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 s

6、epharose、sephadex聚焦層析（Chromatofocusing） 該法分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。 pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地 遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。層析時的

7、聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速率電泳技術(shù) 原理：電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。電泳技術(shù)分類（按實驗裝置分類） 紙電泳 薄膜電泳 凝膠電泳 毛細(xì)管電泳垂直板凝膠電泳毛細(xì)管電泳常用電泳技術(shù)一、醋酸纖維薄膜電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylami

8、de gel electrophoresis, PAGE） 1、SDS 2、PAGE等電點聚焦 三、瓊脂糖電泳 四、毛細(xì)管電泳SDS原理： 當(dāng)SDS（Sodium Dodecyl Sulfate,十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。應(yīng)用: 測定蛋白質(zhì)分子量 測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)等電點聚焦原理：在一定抗對流介

9、質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用： 高效率分離純化蛋白質(zhì) 測定蛋白質(zhì)分子量離心技術(shù)原理：離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會以不同的速度沉降。 電化學(xué)分析技術(shù)定義：利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，

10、測定化學(xué)電池的電位、電流或電量的變化進(jìn)行分析的方法稱為電化學(xué)分析法。原理：將電極浸入待測溶液中組成原電池，其中一支電極的電極電位與待測離子的活度有關(guān)，此電極為指示電極；另一支電極是電位已知并且恒定的所謂參比電極，目前最常用的參比電極有甘汞電極和銀-氯化銀電極。分類電位法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量電導(dǎo)法：測定電阻以求物質(zhì)含量電容量法：借助某些物理量的突變作為滴定分析終點的指示新興技術(shù)高效液相色譜分析法毛細(xì)管電泳技術(shù)生物芯片技術(shù)高效液相色譜分析技術(shù)（HPLC) 高效液相色譜法是用特制微粒（10m）充填的層析柱作為固定相，通過高壓使液體流動相快速通過層析柱而達(dá)到快速有效分離液相中各種物質(zhì)的層析技

11、術(shù)。它具有分離效果好、分析速度快、檢測靈敏度高等特點。在醫(yī)藥衛(wèi)生和生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，蛋白質(zhì)、糖類、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等大分子以及高分子聚合物都能用HPLC測定。 典型的高效液相色譜儀包括輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分。流動相用一高壓泵輸入，輸入前要先脫氣。在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相的離子強(qiáng)度、pH和極性，以改變分離條件、提高分離效果、縮短分離時間。進(jìn)樣可以是注射器進(jìn)樣，也可以是進(jìn)樣閥進(jìn)樣。HPLC使用的檢測器應(yīng)用最多的是紫外或紫外-可見分光檢測器，還有熒光檢測器、電化學(xué)檢測器等。臨床應(yīng)用 高效液相色譜法是目前最好的血藥濃度監(jiān)測方法，但在

12、實際應(yīng)用中還存在一些問題，如每遇到一種新藥必須摸索測定的最佳條件；各種藥物的測定條件不同，要不斷的更換流動相甚至色譜柱；每次只能測定一種藥物，至多只能測定一類藥物，無法測定性質(zhì)不同的藥物。因此，高效液相色譜法用于常規(guī)血藥濃度監(jiān)測，只適用于少量常用的某些特定藥物，大大限制了它的推廣應(yīng)用。 鑒于臨床的需要，國外一些公司設(shè)計了自動高效液相色譜儀，具有以下優(yōu)點：固定色譜柱和流動相，使一臺儀器適合多種藥物的檢測。利用計算機(jī)技術(shù)，儲存幾百種藥物的圖譜，能自動識別未知藥物。為提高圖譜鑒別能力，該機(jī)利用了三維光譜、出峰時間等多種手段。自動進(jìn)樣系統(tǒng)使儀器自動定量或定性測定，分析多達(dá)50個樣品。毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管

13、電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75m）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。 原理：CE所用的石英毛細(xì)管柱, 在pH3情況下, 其內(nèi)表面帶負(fù)電, 和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動的現(xiàn)象叫電滲, 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運(yùn)動方向和電滲流一致, 故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速

14、度；負(fù)離子的運(yùn)動方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實現(xiàn)分離。毛細(xì)管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液發(fā)展歷史1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75m內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離, 創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動力學(xué)色譜。1987年Hjerten 建立了毛細(xì)管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。19881989年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器。與高效液相色譜法的比較共同點：都是高效分離技術(shù), 儀器操作均

15、可自動化, 且二者均有多種不同分離模式。差異點： CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間，CE的分析時間通常不超過30min, 比HPLC速度快； 對CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比, 對擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多； CE所需樣品為nl級, 最低可達(dá)270fl, 流動相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為l級, 流動相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實現(xiàn)微量制備, 而HPLC可作常量制備。與普通電泳比較 CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場, 因此分離速度要快得多；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測器均已

16、和CE實現(xiàn)了連接檢測；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動化程度比普通電泳要高得多。優(yōu)點三高二少：高靈敏度：常用紫外檢測器的檢測限可達(dá)10-1310-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測器則達(dá)10-1910-21mol；高分辨率：其每米理論塔板數(shù)為幾十萬；高者可達(dá)幾百萬乃至千萬, 而HPLC一般為幾千到幾萬；高速度： 最快可在60s內(nèi)完成, 在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì), 1.7min分離19種陽離子, 3min內(nèi)分離30種陰離子； 樣品少：只需nl (10-9L)級的進(jìn)樣量；成本低：只需少量(幾毫升)流動相和價格低廉的毛細(xì)管。 毛細(xì)管電泳 (CE) 除了比其它色譜分離分析方法具有效

17、率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點外, 其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜 (HPLC) 簡單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測器。前三個部件均易實現(xiàn), 困難之處在于檢測器。特別是光學(xué)類檢測器, 由于毛細(xì)管電泳溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積的特性導(dǎo)致光程太短, 而且圓柱形毛細(xì)管作為光學(xué)表面也不夠理想, 因此對檢測器靈敏度要求相當(dāng)高。應(yīng)用 目前，毛細(xì)管電泳已廣泛應(yīng)用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成寡核苷酸、DNA酶切片段及PCR產(chǎn)物的分析鑒定、DNA順序測定等，在生物大分子和小分子的分離分析及臨床檢測等方面也有廣闊的應(yīng)用前景。生物芯片技術(shù) 生物芯片(bioch

18、ip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片及細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝像機(jī)對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程中模擬計算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。分類及基本原理根據(jù)芯片上固定的探針分為：基因芯片、 蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。另外根據(jù)原理不同，還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片?；驹恚簩⒅苽浜玫纳飿悠饭潭ㄓ诮?jīng)化學(xué)修飾的載體上，然后與標(biāo)記的樣品分子雜交，根據(jù)各探針分子雜交信號的強(qiáng)度來確定樣品分子的數(shù)量和序列