蛋白質(zhì)雙向電泳

1、蛋白質(zhì)雙向電泳1蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）概念：是從整體角度分析生物體蛋白質(zhì)組動態(tài)變化的一門科學(xué)研究內(nèi)容：蛋白質(zhì)的識別、定量；蛋白質(zhì)的定位、修飾；蛋白質(zhì)之間的相互作用并根據(jù)這些研究最終確定它們的功能2雙向電泳(2DE/DIGE)實驗組和對照組樣品制備提出生物學(xué)問題凝膠圖像分析差異蛋白點選取蛋白酶解及質(zhì)譜分析差異蛋白點的成功鑒定生物學(xué)問題的解釋技術(shù)流程 3雙向電泳(2DE/DIGE)目前進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的最常規(guī)實驗技術(shù)能實現(xiàn)多達10000種不同蛋白質(zhì)進行分離分析4雙向電泳（2DE）示意圖提取的總蛋白溶液等電聚焦，實現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點進行分離上海博苑生物科技有限公司SDS分離，使得蛋白質(zhì)按

2、分子量大小排序分子量大小通過雙向電泳使得不同等電點和分子量的蛋白質(zhì)根據(jù)其自身特性分布到凝膠的不同位置從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的雙向分離5硝酸銀染色圖譜考馬斯亮藍染色圖譜上海博苑生物科技有限公司2DE圖譜6雙向電泳（DIGE）示意圖上海博苑生物科技有限公司樣品1：Cy3標記樣品2：Cy5標記將標記的樣品混合雙向電泳分離熒光掃描儀掃描圖像重疊分析7DIGE圖譜上海博苑生物科技有限公司8樣品制備雙向電泳的最關(guān)鍵步驟之一制備原則：盡可能多地提取出總蛋白質(zhì)，盡可能簡單的操作步驟，注意防止樣品提取過程中的各種化學(xué)修飾，去除樣品中核酸、鹽離子等干擾物質(zhì)上海博苑生物科技有限公司9等電聚焦通過10000V高壓使得蛋白質(zhì)按

3、照其等電點特性進行聚焦步驟：膠條水化、低壓除鹽、高壓聚焦、低壓維持聚焦時間：聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋，過長會造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)蛋白樣品類型、蛋白載樣量、PH范圍和膠條長度來確定。上海博苑生物科技有限公司10膠條平衡等電聚焦結(jié)束后進行SDS電泳之前需進行膠條平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合，保證SDS電泳的順利進行步驟：一般采用兩步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的緩沖液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次上海博苑生物科技有限公司11SDS電泳使得蛋白質(zhì)按照分子量的大小不同而分離，與普通SDS相似在

4、雙向電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為第一向等電聚焦已經(jīng)使得蛋白得到濃縮上海博苑生物科技有限公司12蛋白檢測理想顯色劑的7S安全（safety）靈敏（sensitivity）簡單（simplicity）特異性（specificity）快速（speed）穩(wěn)定（stability）兼容性（synergy）上海博苑生物科技有限公司13蛋白檢測硝酸銀染色 優(yōu)點：靈敏度高， 缺點：重復(fù)性差，質(zhì)譜兼容性低考馬斯亮蘭染色： 優(yōu)點：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高 缺點：靈敏度低熒光染色： 優(yōu)點：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高、靈敏度高 缺點：價格貴其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金屬鹽負染等上海博苑生物科技有限公司14圖像分析常用軟件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-