發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用

1、Word 文檔發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用靈璧縣立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司二 0 一二年H一月目錄省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技簡(jiǎn)介省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技企業(yè)文化省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技的十年發(fā)展戰(zhàn)略 省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技的第一個(gè)發(fā)展五年發(fā)展計(jì)劃第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第二章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第一節(jié)概述發(fā)酪飼料的定義發(fā)酪飼料的定義是：在人為可控制的條件下，以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，通過(guò)微生物的代作用，降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，生成有機(jī)酸、可溶性多肽等小分子物質(zhì)，形成營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料或飼料原料。采用發(fā)酪技術(shù)生產(chǎn)的動(dòng)物飼料或飼料原料，其特性主要

2、是：(1)含有大量的活性微生物；(2)多數(shù)以厭氧發(fā)酪方式進(jìn)行生產(chǎn)；(3)未經(jīng)干燥的物料含水量通常在 30%H上；(4)物料的酸性物質(zhì)明顯增加，營(yíng)養(yǎng)組成更合理；(5)生產(chǎn)原料以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主。也有發(fā)酪成品是經(jīng)過(guò)干燥處理的，比較典型的有發(fā)酯豆粕和發(fā)酷棉粕。在發(fā)酪過(guò)程中有大量的活性乳酸菌和酯母菌發(fā)生的代作 用，經(jīng)過(guò)干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它們也屬于發(fā)酪 飼料。二、發(fā)酪飼料的概述發(fā)酯飼料的生產(chǎn)工藝基本都是以固態(tài)發(fā)酪的方式進(jìn)行的，生產(chǎn)菌種以乳酸菌、芬胞桿菌和酯母菌為主，絕大多數(shù)采用厭氧或兼性 厭氧發(fā)酯。發(fā)酪物料的含水量為30%50%發(fā)酪時(shí)間和溫度受環(huán) 境影響很大，基本不進(jìn)行人為控制和調(diào)節(jié)。

3、在實(shí)際生產(chǎn)中也有采用好氧發(fā)酯方式進(jìn)行的，生產(chǎn)菌種以霉菌和假絲酪母為主，生產(chǎn)用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酯母菌難 以降解的雜粕和膠質(zhì)蛋白。但是生產(chǎn)設(shè)備復(fù)雜，物料溫度和濕度 Word 文檔Word 文檔變化很大，控制及其困難。成品主要是作為飼料蛋白原料的替代 物，能降低飼料生產(chǎn)成本，但基本不具備生物學(xué)活性和功能。本節(jié)主要論述厭氧固態(tài)發(fā)酯工藝，常規(guī)的發(fā)酯飼料生產(chǎn)流程如： 原料一消毒-冷卻接種-培養(yǎng)-干燥一包裝工業(yè)化規(guī)模的微生物發(fā)酪過(guò)程基本上都是純培養(yǎng)過(guò)程，原料需要消毒，空氣需要過(guò)濾等。這些操作都是為了確保在發(fā)酪產(chǎn)品生產(chǎn) 和儲(chǔ)存過(guò)程中不受雜菌的侵襲和干擾，但也正是這些常規(guī)操作使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本居高不下

4、，影響了微生物發(fā)酯產(chǎn)品在動(dòng)物飼養(yǎng)中 的大劑量使用。大量試驗(yàn)證明，在不考慮動(dòng)物飼養(yǎng)成本的前提下，大劑量（在配 合飼料中添加5.0蛆上）使用高活菌含量的微生物發(fā)酯飼料可以 明顯改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能， 提高動(dòng)物的健康水平，甚至可以進(jìn)行 無(wú)抗生素飼養(yǎng)。但是采用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝獲得的高活菌產(chǎn)品其生 產(chǎn)成本通常都在10元/kg以上，如果以10%勺比例使用在配合飼 料中，每噸配合飼料的成本至少需要增加 800元，這個(gè)增加值對(duì) 傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)是難以接受的。降低發(fā)酯飼料生產(chǎn)成本最直接的方式就是簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是 最耗能的操作過(guò)程，是導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加的主要步驟， 也是導(dǎo)致 生產(chǎn)設(shè)備投資增

5、加的主要原因。 如能簡(jiǎn)化生產(chǎn)操作工藝步驟，同時(shí)又能保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全穩(wěn)定，就能使發(fā)酪飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用 具備強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。第二節(jié) 發(fā)醉飼料的生產(chǎn)菌種 發(fā)酯飼料的生產(chǎn)菌種很多，主要有：乳酸菌、芬抱桿菌、酯母菌 和霉菌。一、乳酸菌目前生產(chǎn)中使用的乳酸菌至少有 30多種。按乳酸菌的代途徑， 大致可歸納為四種類型：同型乳酸發(fā)酯、專性異型乳酸發(fā)酯、兼 性乳酸發(fā)酯和雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酯o（一） 同型乳酸發(fā)酯C6H12。62CH3CH（OH）COOH一分子葡萄糖分解成兩分子乳酸，整個(gè)過(guò)程不產(chǎn)氣，發(fā)酯轉(zhuǎn)化理想，產(chǎn)物最合適，效率最高。典型的生產(chǎn)菌種主要有：德氏乳 酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜熱乳桿菌、糞

6、腸球菌、乳 酸乳球菌。（二）專性異型乳酸發(fā)酯C6H12O6CH3CH（OH）COOH+CH 3COOH+CO 2 T一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外還釋放一分子二氧化碳。相比同型乳酸發(fā)酯，這種發(fā)酯的轉(zhuǎn)化效率要 低得多，而且還有產(chǎn)氣損失。典型的生產(chǎn)菌種主要有：發(fā)酪乳桿菌、高加索酸奶桿菌、短乳桿菌、巴氏乳桿菌。（三） 兼性乳酸發(fā)酯兼性乳酸發(fā)酯能同時(shí)進(jìn)行同型乳酸發(fā)酯和異型乳酸發(fā)酪，這兩種代進(jìn)行的程度和比例取決于菌種的性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件。典型的生產(chǎn)菌種有：植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠糖桿菌、清酒乳 桿菌。（四）雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酯2c6H12。6 2CH3CH（OH）COOH+3CH 3C

7、OOH比較典型的生產(chǎn)用菌種是動(dòng)物雙歧桿菌。雙歧桿菌的培 格要求很嚴(yán)格，對(duì)厭氧要求極高，目前還很難在實(shí)際生產(chǎn)中 應(yīng)用。乳酸菌分布廣、種類多，有桿狀和球形兩大類。有單個(gè)、成 對(duì)和鏈狀排列的，基本上都是厭氧菌或微需氧菌。在飼料青 儲(chǔ)、發(fā)酪開(kāi)始時(shí)就繁殖，到飼料因密封缺氧后仍然能繁殖， 只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度卻快一些。乳酸菌能分解飼料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高飼料 的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性，同時(shí)還能抑制大腸桿菌和沙門氏菌等 有害微生物的生長(zhǎng)代，使飼料產(chǎn)品能長(zhǎng)期保存。在飼料青儲(chǔ) 和發(fā)酪的過(guò)程中，同型和異型乳酸發(fā)酯同時(shí)存在，產(chǎn)物除乳 酸外還有少量乙醇和CO2。二、芬抱菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的芬胞

8、菌有近十種，以桿菌為主，主要為以下三種：地衣芬抱桿菌、枯草芬抱桿菌和蠟樣芬抱桿菌。芬抱桿菌 能耐受高溫，在有氧和無(wú)氧條件下都能存活。在營(yíng)養(yǎng)缺乏、干旱 等條件下形成芬抱，在條件適應(yīng)時(shí)又可以重新萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體。利用芬胞桿菌發(fā)酯飼料的目的主要是為了消耗培養(yǎng)體系中殘留的 氧氣，為乳酸菌創(chuàng)造一個(gè)厭氧環(huán)境。另外，近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)， 有些芬抱桿菌能產(chǎn)生殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的 細(xì)菌素（也稱抗菌肽），這些抗菌肽有很強(qiáng)的針對(duì)性，只對(duì)某些類型的微生物細(xì)胞有破壞作用，對(duì)酯母菌和乳酸菌沒(méi)有影響。三、酯母菌酯母菌是一類單細(xì)胞真菌，形態(tài)多種多樣，主要有球形、卵形和 絲狀形（如假絲酷母），以出芬的無(wú)性繁殖為主，最

9、適宜生長(zhǎng)溫 度為2535 C, pH偏酸性（4.06.0）。酯母菌基本上都是兼性 厭氧菌，在有氧的條件下迅速增殖， 在無(wú)氧的情況下進(jìn)行酒精發(fā) 酪（EMP）。目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的有 20多種，主要為以下三種： 釀酒酪母、熱帶假絲酷母、產(chǎn)骯假絲酪母。啤酒酪母和面包酯母 是最常用的釀酒酪母。熱帶假絲酪母和產(chǎn)骯假絲酪母的生長(zhǎng)速度 很快，在適宜的溫度和營(yíng)養(yǎng)條件下， 它們的世代倍增時(shí)間不超過(guò) 3h,特別適合處理食品加工業(yè)產(chǎn)生的廢水。酯母菌的個(gè)體比乳酸菌大得多，直徑通常為26 g,體積幾乎是乳酸菌的1000倍左右。工業(yè)生產(chǎn)中常用的酯母菌主要有釀酒 酪母和假絲酪母，釀酒酪母是生產(chǎn)啤酒、白酒等含乙醇類發(fā)酯物 的重

10、要菌種；假絲酯母主要用于好氧發(fā)酯生產(chǎn)動(dòng)物飼料或者廢水 處理。四、霉菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的霉菌有近十種，主要為：米曲霉、黑曲霉、 白地霉。一般來(lái)說(shuō)利用霉菌發(fā)酪，基本上都是有氧發(fā)酪，發(fā)酪過(guò) 程會(huì)產(chǎn)生大量的代熱，生產(chǎn)過(guò)程中料曲的溫度控制往往是生產(chǎn)成 敗的關(guān)鍵。霉菌發(fā)酪目前采用淺盤發(fā)酪，料曲厚度不超過(guò)5cm ,如果采用厚層發(fā)隙，需采用強(qiáng)通風(fēng)裝置，生產(chǎn)能耗很大，從這一 點(diǎn)上說(shuō)，霉菌發(fā)酯不適于生產(chǎn)飼料或者飼料原料。目前，實(shí)際生產(chǎn)中利用霉菌主要是利用它能合成纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶的特性，利用廉價(jià)的粗蛋白原料作為發(fā)酪底物， 生產(chǎn)高活性的蛋白飼料或者粗酶制劑。五、選用生產(chǎn)菌種的基本原則（一） 安全性（必須同

11、時(shí)符合以下兩個(gè)要求）（1）菌體本身不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。（2）不會(huì)危害環(huán)境固有的生態(tài)平衡（主要針對(duì)某些基因工程菌）。（二）有效性（能滿足一個(gè)要求即可）（1）菌種本身具有很好的生長(zhǎng)代活力，能有效降解大分子好抗 營(yíng)養(yǎng)因子，合成小肽和有機(jī)酸等小分子物質(zhì)。（2）能保護(hù)和加強(qiáng)動(dòng)物微生物區(qū)系的正平衡。這種功效主要是指能有效維護(hù)和提高有益微生物在動(dòng)物消化道中的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，其可通過(guò)兩種方式達(dá)到： 一種方式是利用發(fā)酪飼 料的生產(chǎn)菌種本身就是從飼養(yǎng)的目標(biāo)動(dòng)物的消化道中分離出來(lái)的有益菌，通過(guò)飼喂高比例的發(fā)酯飼料直接提高有益微生物的數(shù) 量，形成數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)；另一種方式是利用生產(chǎn)菌種或代產(chǎn)物可以選 擇性地抑制或者殺滅有害微生物

12、，形成有益菌的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。實(shí)現(xiàn) 第二種途徑的方式可以多種多樣，比較常用的有：耗盡氧氣，降 低體系的氧化還原電位；降低環(huán)境的 pH值；代物中含有能選擇 性殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌物質(zhì)等。第三節(jié)發(fā)醉飼料生產(chǎn)菌種之間的相互關(guān)系目前人類可利用的這些發(fā)醉技術(shù)基本上都是純培養(yǎng)技術(shù)，而實(shí)際上在自然界中很難找由單一微生物存在的生態(tài)環(huán)境。據(jù)已有的微生物研究報(bào)道， 地球上存在的微生物超過(guò) 100 萬(wàn)種，而人類所分離的純種累計(jì)不超過(guò)10萬(wàn)種，做過(guò)比較系統(tǒng)研究的不超過(guò)1萬(wàn)種。根據(jù)目前已有的研究成果，大體 可以把微生物之間的關(guān)系分為以下幾種：中性共生、同住、 互惠共生、共生、競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和寄生。一、中性共生

13、這是指兩種或兩種以上的微生物同時(shí)存在于同一個(gè)環(huán)境中，但是它們之間沒(méi)有直接的生態(tài)關(guān)系，各自生活互不干擾。例如淡水中生長(zhǎng)的衣藻和水生細(xì)菌。二、同住這是指兩種微生物同處在一個(gè)棲所， 其中一個(gè)獲益，另一個(gè) 不受影響。常見(jiàn)的現(xiàn)象是一種微生物產(chǎn)生一種代物供另一種微生 物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或者產(chǎn)生適合于另外一種微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。發(fā)酯飼料生產(chǎn)中比較常見(jiàn)的例子有以下幾種：酯母菌能在高濃度的糖液（25癖右）中生長(zhǎng)。當(dāng)糖被酯母菌消耗以后，糖濃度的 降低就有利于不耐受高滲透壓的微生物（如乳酸菌）的生長(zhǎng)。能分泌淀粉酶的微生物（芬抱菌）水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖，為 另外一些只能利用還原性單糖的微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。還有一種比較特

14、殊的同住微生物， 好氣性菌可消耗氧氣，降低環(huán) 境的氧化還原電位，使之適合于厭氧微生物的生長(zhǎng)。 這種同住關(guān) 系只能產(chǎn)生在開(kāi)始階段，在后期就不是同住關(guān)系了。 這種現(xiàn)象在 發(fā)酯飼料到生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常遇到，也是利用微生物組合發(fā)酯生產(chǎn)發(fā)酪飼料的重要理論基礎(chǔ)。三、互惠共生這是兩種微生物互惠互利的現(xiàn)象，比較典型的菌種是阿拉伯 糖乳桿菌和糞鏈球菌的組合。阿拉伯糖乳桿菌不能合成苯丙氨 酸，糞鏈球菌不能合成葉酸。阿拉伯糖乳桿菌不能在缺少苯丙氨 酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，糞鏈球菌也不能在沒(méi)有葉酸的培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)。但是把它們組合在一起， 卻可以共同在沒(méi)有苯丙氨酸也沒(méi)有 葉酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈兡芟嗷閷?duì)方提供必需的限制性

15、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。這種現(xiàn)象在自然界中普遍存在， 發(fā)酯飼料的菌種組合 應(yīng)該多考慮這種組合優(yōu)勢(shì)。四、共生共生是指兩種微生物在同一個(gè)嚴(yán)酷環(huán)境中彼此相依為命。比較典型的例子是地衣，它是藍(lán)細(xì)菌（或藍(lán)藻）與真菌共同組成的 一個(gè)形態(tài)和生理單位。藍(lán)藻或藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞僅限于特定的層，地 衣的菌絲交織成菌絲組織， 形成一個(gè)稠密的外皮層。 皮層下為藍(lán) 藻的細(xì)胞層，在下面為菌絲疏松交織的菌髓層。真菌可以從藍(lán)藻獲得碳水化合物，真菌菌絲所攝取的水和無(wú)機(jī)鹽又可以提供給藍(lán) 藻，因此地衣能耐干旱、潮濕和抗寒冷。這種現(xiàn)象在發(fā)酪飼料的 生產(chǎn)過(guò)程中很難遇到，少有實(shí)用的例子。五、競(jìng)爭(zhēng)當(dāng)兩種微生物對(duì)某種環(huán)境因子有相同要求時(shí)，就會(huì)發(fā)生生存競(jìng)爭(zhēng)。由于

16、微生物的世代時(shí)間比較短，代強(qiáng)度大，所以生存競(jìng)爭(zhēng) 往往表現(xiàn)的很激烈。在一個(gè)生存環(huán)境，不同的時(shí)間會(huì)出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)種。 這種優(yōu) 勢(shì)微生物在某種環(huán)境下能最有效地適應(yīng)當(dāng)時(shí)的環(huán)境，而環(huán)境條件一旦改變，就可能被另一種微生物代替弁發(fā)育成新的優(yōu)勢(shì)種。目前工業(yè)化發(fā)酪生產(chǎn)之所以采用純種培養(yǎng)，其主要原因就是消除其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)。目標(biāo)代物合成能力強(qiáng)的微生物其生長(zhǎng)速度往往 比較低，至少比同類的野生菌低。野生菌的代活動(dòng)是很“經(jīng)濟(jì)的”。 如果從生長(zhǎng)速度分析，它們的物質(zhì)和能量的利用效率要遠(yuǎn)高于生 產(chǎn)菌種。但是，由于生產(chǎn)成本的限制，發(fā)酪飼料的生產(chǎn)往往不能 采用純種培養(yǎng)，所以微生物之間的生存競(jìng)爭(zhēng)不可避免。如何巧妙利用微生物之間的生

17、存競(jìng)爭(zhēng)是研究微生物發(fā)酯飼料生產(chǎn)的一個(gè)非常重要的課題。 從理論上分析，通過(guò)控制調(diào)節(jié)微生物生存環(huán)境可以調(diào)整物料中微生物的種類和數(shù)量分布，從而達(dá)到利用微生物有益菌群種群優(yōu)勢(shì)發(fā)酪飼料的目的，但是到目前為止， 有關(guān)方面的成熟技術(shù)還是很少。六、拮抗一種微生物可以產(chǎn)生不利于另一種微生物生存的代物質(zhì)，或者通過(guò)代活動(dòng)改變生存環(huán)境， 而這種環(huán)境不利于其他周圍微生物 的生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象就稱為“拮抗”。如：青貯飼料接種的乳酸菌和 醋酸菌在發(fā)酪過(guò)程中，不斷降低 pH值，結(jié)果絕大多數(shù)不耐酸的 微生物不能生存，甚至趨向死亡。酯母菌在無(wú)氧條件下將糖發(fā)酯 成酒精，當(dāng)酒精濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，其他微生物就不能生存。研究發(fā)現(xiàn)拮抗還具有

18、明顯選擇性， 農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心分離 獲得的枯草芬抱桿菌 MA139能分泌殺滅大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽（細(xì)菌素），但對(duì)自身、酪母菌和乳酸 菌的生長(zhǎng)代基本沒(méi)有影響，這種拮抗的選擇性是發(fā)酯飼料研究所 希望的。七、寄生一種微生物生活在另一種微生物體或體外，依靠攝取寄生細(xì) 胞的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖， 弁使后者遭受損害甚至死亡， 這種現(xiàn)象 稱之為寄生。這種現(xiàn)象在飼料發(fā)酪過(guò)程中可能存在， 目前在研究 中還沒(méi)有遇到。微生物是發(fā)酯飼料的動(dòng)力來(lái)源， 研究發(fā)酯飼料中微生物的相 互關(guān)系是獲得高質(zhì)量發(fā)酪飼料的必要前提，也是飼料發(fā)酯生產(chǎn)的 核心。第四節(jié)發(fā)酯飼料的生產(chǎn)工藝一、固態(tài)厭氧發(fā)酯高活性生物飼料相對(duì)于

19、好養(yǎng)發(fā)酯，厭氧發(fā)酯的能耗低，微生物代產(chǎn)生的熱量 也要小得多，生產(chǎn)過(guò)程往往不需要翻拌散熱。另外，發(fā)酪產(chǎn)品只 要密封得當(dāng)，即使長(zhǎng)期存放也不會(huì)腐敗變質(zhì)。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酯生物飼料的成功例子主要有 兩種：一種是適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的袋裝發(fā)酪飼料；另一種是屬于規(guī)模化流水線生產(chǎn)的袋裝發(fā)酪飼料。它們接種的微生物基本一致，主要有酯母菌、乳酸菌和芬胞桿菌。適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的發(fā)酯袋是一種普通的密封包裝袋， 物 料接種以后裝袋，再將袋口用繩扎緊，物料的含水量為30%40% 開(kāi)始時(shí)，酪母菌消耗袋殘留的氧氣進(jìn)行增殖和呼吸代， 同時(shí)也為乳酸菌創(chuàng)造一個(gè)厭氧的生活環(huán)境。然后，酪母菌在無(wú)氧條件下進(jìn)行糖酯解，產(chǎn)生酒精和

20、CO2,乳酸菌也同時(shí)增殖、代，產(chǎn)生有機(jī) 酸。隨著袋氣壓的不斷增加， 不斷有CO2帶著酒精和有機(jī)酸排出 袋外，管理飼料的飼養(yǎng)員可以根據(jù)排出的酸香味來(lái)判定物料發(fā)酪 的成熟度。有氧發(fā)酪階段：C6H12O6+6O 2 6CO2+6H 2。無(wú)氧發(fā)酪階段：C6H12。62CO2+2C2H5OH（乙醇）在夏季，發(fā)酷35d就有明顯的酸香味。在冬季，時(shí)間需要延長(zhǎng)。如果環(huán)境溫度低于 12 C,發(fā)酪就有可能歸于失敗。酪母在低溫 下長(zhǎng)期代低迷，不產(chǎn)生CO2,使得外界的O2長(zhǎng)時(shí)間與接種的乳 酸菌接觸，會(huì)導(dǎo)致乳酸菌活力大減，甚至死亡。事實(shí)證明，如果環(huán)境溫度適宜，時(shí)間控制得當(dāng)，采用上述袋裝式 土辦法發(fā)酪，也可以獲得質(zhì)量很好

21、的微生物發(fā)酯飼料，活性乳酸菌的含量能達(dá)到 108cuf/g以上。將其在生羊配合飼料中添加 15%20%生羊采食量能明顯提高，最多能提高10%Z上，而且增重速度和健康水平也有顯著提高。這種工藝雖然簡(jiǎn)單，但是受限制的因素很多，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也很難把握，實(shí)際推廣有一定困難。為了使這種袋裝發(fā)酯技術(shù)進(jìn)入程序化、 工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酪飼料的 質(zhì)量能得到有效保證，必須完成以下幾個(gè)前提：發(fā)酪過(guò)程不受環(huán) 境溫度限制；產(chǎn)品質(zhì)量不受存放時(shí)間限制， 或者保質(zhì)期能達(dá)到三 個(gè)月以上；產(chǎn)品在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中不受外界空氣干擾。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酪飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可 移動(dòng)式固態(tài)厭氧發(fā)酯飼料（也稱袋裝發(fā)酯飼料）生產(chǎn)技術(shù)。這

22、種發(fā)酪技術(shù)的具體工藝流程如圖1-1原料接種以后直接進(jìn)入包裝袋中， 包裝袋上附加一個(gè)可以調(diào)節(jié)氣 壓的硅膠膜。在發(fā)酪過(guò)程中，微生物會(huì)產(chǎn)生CO2等氣體，使得袋的氣壓大于外界常壓。當(dāng)袋氣壓達(dá)到某一臨界值時(shí)，氣體通過(guò)硅 膠膜排到外界。但是外界的氣體始終沒(méi)有機(jī)會(huì)進(jìn)入發(fā)酪體系，從而也就排除了外界雜菌的干擾。研制的特定微生物菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu) 勢(shì)，原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。這種工藝很簡(jiǎn)單，如果以日產(chǎn) 30t計(jì)算，設(shè)備投資不超過(guò) 40萬(wàn) 元，特別適合在我國(guó)廣大農(nóng)村推廣使用。第三章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一節(jié) 發(fā)酯飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見(jiàn)的益生菌，生物飼料的發(fā)酪生產(chǎn)一般都

23、 離不開(kāi)乳酸菌。乳酸菌種類很多，市場(chǎng)上流行的產(chǎn)品也極多，至 少有20多種。大量實(shí)驗(yàn)證明，只有動(dòng)物消化道國(guó)有的微生物才 能在消化道定植，外源微生物只能短時(shí)間存活在消化道，不可能長(zhǎng)期融合到動(dòng)物消化道的微生態(tài)系統(tǒng)中。篩選發(fā)酪飼料的生產(chǎn)菌 種，其主體應(yīng)該來(lái)源于最終適用的動(dòng)物消化道，而乳酸菌細(xì)菌是動(dòng)物消化道起主要作用的微生物。一、樣品的采集為了獲得合適的生產(chǎn)用乳酸菌，樣品的采集很重要。適合于實(shí) 際生產(chǎn)的乳酸菌必須來(lái)源于健康動(dòng)物的消化道，最好是在發(fā)生 了瘟疫的養(yǎng)殖場(chǎng)而幸存的畜禽。發(fā)生瘟疫的養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物大比 例死亡，幸存的畜禽雖少，但是生命力很頑強(qiáng)，是極好的生產(chǎn) 菌種采集樣本。以下以篩選符合生羊健康養(yǎng)殖需要

24、的生物飼料用乳酸菌為例，敘述樣品的采集和乳酸菌的分離。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)生羊進(jìn)行攻毒試 驗(yàn)，在飼料中不斷加大大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)用E.ColiK88這是一種常見(jiàn)的攻毒試驗(yàn)用大腸桿菌）的用量，以檢驗(yàn)生羊的抵抗力。經(jīng)過(guò) 57d的試驗(yàn)，生羊的健康水平越來(lái)越差。我們選擇其中兩頭最 健康的生羊進(jìn)行屠宰，在無(wú)菌環(huán)境中提取它的胃液、 小腸液和大 腸液，迅速保存在無(wú)菌生理鹽水（NaCl的濃度為0.9%中。目標(biāo)乳酸菌一般都是厭氧菌，為了確保乳酸菌的活力， 需要盡可能降低生理鹽水的氧化還原電位。 最簡(jiǎn)便的方法是在溶液中加入 適量的半胱氨酸，半月氨酸有茄基（一 SH）,有很好的還原力， 可以消除溶液中殘余的氧。二、乳酸菌的分離

25、純化樣品中的目標(biāo)乳酸菌含量一般都不是很高，而且還污染了其他 雜菌。為了提高篩選成功的幾率，在樣品進(jìn)行分離純化以前， 可以對(duì)樣品進(jìn)行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標(biāo)乳酸菌的含量。樣品的增殖培養(yǎng)比較簡(jiǎn)單，把經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的樣品接種到適于 目標(biāo)乳酸菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。比較常用的是牛奶增殖培養(yǎng)液， 在無(wú)抗生素牛奶中補(bǔ)充 6%8%勺蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后 用氮?dú)饣蛘叨趸简?qū)除溶液中殘留的空氣，再接入適量采集 的樣品，在3032 c條件下厭氧培養(yǎng)1024h。如果樣品中的 目標(biāo)乳酸菌含量比較低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。樣品經(jīng)過(guò)預(yù)增殖培養(yǎng)以后，目標(biāo)乳酸菌含量明顯提高，可以進(jìn) 入下一步分離純化操作。乳酸菌分離培養(yǎng)基通

26、常采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)組成與pH如下：蛋白陳：5.0g/L;牛肉浸膏：4.0g/L;酯母膏：2.0g/L; 葡萄糖：12.0g/L;玉米漿：10.0mL;司盤80: 1ml;磷酸氫二鉀： 1.0g/L ;三水乙酸鈉：3.0g/L ;檸檬酸三俊：1.0g/L ;硫酸鎂： 0.1g/L;硫酸鎰：0.03g/L;瓊脂：18.0g/L。pH6.20.2。加熱溶解上述各組分，配制成均勻的溶液，分裝在厭氧滾管中（每個(gè)管中加56mL）。在115 c消毒殺菌30min。冷去口至50 c 左右后，在冰水中滾動(dòng)滾管，使固體培養(yǎng)基均勻凝固在管壁上。 為了指示培養(yǎng)基的氧化還原電位，可以在培養(yǎng)基中加入極少量 的

27、刃天青（一種顯色劑），濃度0.02姆足夠了。在低電位時(shí)培 養(yǎng)基顯藍(lán)色，隨氧化還原電位不斷上升，培養(yǎng)基的顏色逐步由 藍(lán)轉(zhuǎn)為淺藍(lán)、粉紅、紅色。如果培養(yǎng)基的顏色轉(zhuǎn)成粉紅就基本 不合格了。同增殖培養(yǎng)過(guò)程一樣，在MRS分離培養(yǎng)基中加入適 量的半胱氨酸可以在一定時(shí)間維持環(huán)境的低電位。分離純化培養(yǎng)基準(zhǔn)備好以后，就可以進(jìn)行目標(biāo)乳酸菌的分離操 作了。在超凈工作臺(tái)上（或者其他無(wú)菌環(huán)境中），對(duì)經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的樣 品進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液還是用無(wú)菌的生理鹽水，把稀釋后的 樣品接種到厭氧滾管中， 密封（滾管有密封蓋）。在3032 c條 件下培養(yǎng)12d。為了提高篩選幾率，可以同時(shí)做多個(gè)稀釋梯度樣品的培養(yǎng)。如 果兩天以后不出現(xiàn)

28、理想的菌落，可以再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。雖然乳酸菌的最適宜生長(zhǎng)溫度是3740 C ,但是在分離篩選過(guò)程中，培養(yǎng)溫度應(yīng)適當(dāng)調(diào)低，以降低其生長(zhǎng)速度，這樣菌落之 間的差異可以更明晰，也更有利于挑選理想的菌種。經(jīng)過(guò)上述分離操作，我們獲得了 5株乳酸菌，它們分別是:.來(lái)源于羊胃的格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri);.來(lái)源于十二指腸的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri ).來(lái)源于小腸的屎腸球菌 ( Enterococcus faecium );.來(lái)源于空腸的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus );.來(lái)源于結(jié)腸的發(fā)酹乳桿菌(Lactobacil

29、lus fermentium )。三、發(fā)酯力和耐酸穩(wěn)定性分析為了后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的需要，我們對(duì)分離獲得的乳酸菌進(jìn)行發(fā)酯 力測(cè)定和耐酸穩(wěn)定性試驗(yàn)。發(fā)隙力測(cè)定比較簡(jiǎn)單，主要測(cè)定其乳酸菌的產(chǎn)量，具體方法如下：接種分離獲得的細(xì)菌純種于試管培養(yǎng)液中，3032。恒溫培養(yǎng)12h,然后再擴(kuò)大接種到牛奶瓶中，3032c恒溫培養(yǎng)6h,測(cè)定乳酸含量。在乳酸發(fā)酯的過(guò)程中乳酸通常以乳酸鈣的形式存在，通過(guò)去除發(fā)酯液中的葡萄糖和蛋白質(zhì)， 弁加入適當(dāng)濃度硫酸酸化， 鈣離子 轉(zhuǎn)化成難溶的硫酸鈣沉淀，使溶解度不高的乳酸鈣全部轉(zhuǎn)變?yōu)槿?酸。乳酸在銅離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對(duì)羥基聯(lián)苯作用生成在 565 nm處有特征吸

30、收的紫色物質(zhì)。在一定濃度圍，乳酸含量與 565 nm處波長(zhǎng)吸光度呈線性關(guān)系，因此，可以通過(guò)測(cè)定 565 nm處的吸光度來(lái)測(cè)定乳酸的含量。實(shí)驗(yàn)室乳酸含量的測(cè)定一、原理稀乳酸在 濃硫酸作用下加熱，可以變成乙醛。乙醛與羥基聯(lián)苯作用可以生成紅色的復(fù)合物，在565nm條件下比色測(cè)定，可以確定乳酸含量。二、試劑1.4.0喻酸銅溶液將4g無(wú)水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至 100ml。.羥基聯(lián)苯(C6H5 c6H4OH)溶液將1g羥基聯(lián)苯溶解于100ml濃度為0.08mol/L的NaOH溶液中， 儲(chǔ)存在褐色試劑瓶中。.乳酸標(biāo)準(zhǔn)液將280mg純?nèi)樗徜嚾苡谒?，配?250mL溶液，其乳酸濃度為 1mg/mL,存

31、放于4c冰箱中。在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)將溶液稀釋 10倍, 使乳酸含量為100閨/mL。在分別取1, 2, 3, 4, 5, 6mL稀釋 液，稀釋配制成1, 2, 3, 4, 5, 6閨/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液。.濃硫酸溶液在比色管中分別加入1mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和0.05mL硫酸銅溶液，然 后加入6mL濃硫酸，放置5min ,冷卻至20 c以下。三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和乳酸含量的測(cè)定在上述比色管中加入 0.05mL羥基聯(lián)苯溶液，混合均勻，在室溫 下放置68h ,過(guò)夜。在565nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(1)最大吸收波長(zhǎng)的確定乳酸發(fā)酯液樣品顯色后，表明，最大吸收波長(zhǎng)為565 nm圖2-1最大吸收波長(zhǎng)的確定(

32、2)最佳顯色條件的選擇結(jié)果表明，氫氧化鈣和濃硫酸的加入量對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著，其余因素的作用不顯著，最佳顯色條件為 A2B3c2D1E1F3,即氫氧 化鈣0.05g , 20麻酸銅0.8 ml,濃硫酸6 ml,對(duì)羥基聯(lián)苯 0.125 ml,靜置時(shí)間15 min,加熱顯色時(shí)間 5 min。(3)乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度在1080由/ml圍與吸光度值基本呈線性關(guān)系，當(dāng)濃度大于等于 60聞/ml時(shí)吸光度值大于1,考慮到儀 器誤差的因素，故制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)濃度圍取在15、20、25、30、35、40、45、50由/ml ,得到如圖的乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn) 曲線回歸方程為 A=0.0189C0.

33、0808(A為吸光度值，C為乳酸濃度，n=8）, r=0.9989,在1550/ml圍呈良好線性關(guān)系0.40.23010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110乳液可林液濃度（微克/富升）（圖2-2 :乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度與吸光度值之間的關(guān)系）LngLnd,O.CSSSSO.SO.102030105060乳酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（微克/塞升）（圖2-3 :乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)肝液進(jìn)行預(yù)處理， 排除蛋白質(zhì)和葡萄糖的干擾， 使測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值；優(yōu)化了顯色條件，使測(cè)定時(shí)操作簡(jiǎn)便，精確度高，顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，適合于發(fā)酯液中乳酸含量的測(cè)定。耐酸穩(wěn)定性分析主要是考慮乳酸菌在實(shí)際使用過(guò)

34、程中過(guò)動(dòng)物胃酸的成活問(wèn)題。生長(zhǎng)育肥羊的胃酸 pH比較低，一般的微生物很難在其中存活，這種功能實(shí)際上也利于生羊的健康， 使它可以在衛(wèi)生條件比較差的環(huán)境中生存。 但是這種特性不利于外源有益 微生物的存活，外源有益菌必須先通過(guò)胃液的考驗(yàn)才能達(dá)到其發(fā)揮作用的場(chǎng)所（腸道）。所以耐胃酸穩(wěn)定性也是決定乳酸菌實(shí)際 使用效果的一個(gè)重要指標(biāo)， 具體檢驗(yàn)方法如下：取1.0mL活菌數(shù) 量已知的培養(yǎng)液，在無(wú)菌條件下，接種到生長(zhǎng)羊、牛的胃液中，在37。恒溫培養(yǎng)。同時(shí)做6個(gè)平行，每隔1h取樣1次，分析乳 酸菌數(shù)量的變化。在生長(zhǎng)羊胃液中，上述5株菌都體現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性， 具存活 率都在50減上（見(jiàn)表2-4）表3-4各種乳酸細(xì)

35、菌在生長(zhǎng)羊胃液中的穩(wěn)定性時(shí)間/h123456格氏乳桿菌存活率/%羅伊氏乳桿菌存活率/%屎腸球菌存活率/%嗜酸乳桿菌存活率/%發(fā)酵乳桿菌存活率/%88.282.691.488.481.371.486.562.176.391.288.684.294.692.891.495.811213666.957.246.871.264.855.676.871.364.288.586.384.6本組試驗(yàn)均是在羊消化道中分離獲得的乳酸菌都是天然菌， 沒(méi)有經(jīng)過(guò)基因工程改造，屬于安全菌株。遺傳性能穩(wěn)定，不會(huì)隨著傳代而發(fā)生 變異，安全無(wú)毒?？梢源罅繎?yīng)用在牛、羊等飼料中。另有研究提出在模擬的胃酸中（pH值與真實(shí)胃液胃酸相

36、同）進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，其結(jié)果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的穩(wěn)定性， 其原 因是真實(shí)胃液中蛋白酶對(duì)外來(lái)生物活性物質(zhì)具有極強(qiáng)的分解作用，破壞了相當(dāng)部分外來(lái)多酶蛋白和一些細(xì)菌素的活性。 這是自然界一種自 我保護(hù)的功能。第二節(jié)發(fā)醉飼料用芽泡桿菌的分離篩選和安全性評(píng)價(jià) 芽泡桿菌也是一類比較常見(jiàn)的發(fā)醉飼料生產(chǎn)菌，但是這類菌 的應(yīng)用效果與菌種來(lái)源、飼養(yǎng)環(huán)境和動(dòng)物類型都有很大的關(guān) 系。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)由穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的 還很少。另外，芽抱桿菌不同于乳酸菌和釀酒醉母（或者啤酒醉母），乳酸菌和解母菌的安全穩(wěn)定性一般都很可靠（一些耗氧發(fā)醉 的絲狀醉母除外），但是芽泡桿菌的安全穩(wěn)定性卻一直是行 業(yè)主管部

37、門關(guān)注的重點(diǎn)。芽泡桿菌一般都不是動(dòng)物消化道固有菌，它們發(fā)揮作用的原 因至今還沒(méi)有統(tǒng)一的定論。但是目前人們對(duì)兩點(diǎn)原因是比較 認(rèn)可的：產(chǎn)生能殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗 菌肽類物質(zhì)（或者稱為細(xì)菌素）；消耗環(huán)境中的氧氣，為乳 酸菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造厭氧環(huán)境。芽泡桿菌的分離篩選主要也 是依據(jù)上述兩個(gè)原則。安全性評(píng)價(jià)主要依據(jù)抗生素敏感性以及致毒性，相關(guān)的技術(shù) 都比較成熟。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標(biāo)芽泡桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)或者進(jìn)行攻毒試驗(yàn)幸存的動(dòng)物體中篩選。1.樣品的采集與初篩在發(fā)生了大批死亡的養(yǎng)殖場(chǎng)里，我們從土壤和糞便中采集樣品，共需采集24個(gè)樣品，每個(gè)樣品約 2

38、g,在無(wú)菌條件下分別保存在20mL無(wú)菌生理鹽水中，并用冰塊降溫，在 12h進(jìn) 行后續(xù)的培養(yǎng)分離，具體方法如下：(1)取0.5ml樣品液，加入到5ml的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)肉湯(MNB) 中。MNB培養(yǎng)基組成與 pH:葡萄糖：5.0g/L;蛋白月東：5.0g/L;牛肉膏：3.0g/L;醉母浸粉：1.0g/L;MgSO 4 H2O:0.005g/L。 pH:7.0 0.2把上述組分均勻溶解在水溶液中，在120 c消毒30min ,然后冷卻到常溫，備用。(2)從24種樣品中分離得到芽胞桿菌菌株約120株，這些芽泡桿菌均具有革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化物酶陽(yáng)性、產(chǎn)生好氧芽抱的特性，但是僅有 6株對(duì)E.coliK88具有強(qiáng)烈

39、的抑制作用，它們都基本具備了芽泡桿菌的特性，將此6株菌株編號(hào)為：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633 和 MA744 ,并將 這6株作為后續(xù)復(fù)篩的備選菌種。二、菌種的復(fù)篩在芽泡桿菌的復(fù)篩過(guò)程中，設(shè)計(jì)了待篩菌與4種指示菌同步混合培養(yǎng)的方法，這種設(shè)計(jì)的目的：創(chuàng)造豐富的營(yíng)養(yǎng)條件 便于候選菌株的富集生長(zhǎng)；采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選 的芽泡桿菌營(yíng)造一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境，有利于產(chǎn)生高抗菌活性的芽抱桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)條件，拮抗其他細(xì)菌而存活下來(lái)。同時(shí)在不同的試管中分別接種4種指示菌（見(jiàn)表3.5）,濃度約為 106cfu/mL。表2-54種指示菌及其來(lái)源指示菌學(xué)名來(lái)源金黃色葡錮球菌

40、Staphylococcus IVDC C56005中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心鼠傷寒沙門氏菌SalmonellatyphimuriumIVDC中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心大腸桿菌K88C79-13中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心大腸桿菌K99Esherichia coli IVDC C83901中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心Esherichia coli IVDC C83529在上述4個(gè)指示菌中，大腸桿菌 K88的抵抗力最強(qiáng)，金黃色 葡萄球菌抵抗力最弱。制備指示菌懸液時(shí)，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（MNB）中，37 c培養(yǎng)1824h , 保證菌懸液的濃度為 108cfu/m

41、L左右。接種菌液后，在 37 c混合震蕩培養(yǎng) 48h,培養(yǎng)液然后置于 70 c的水浴中保溫30min ,殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。存活的芽泡經(jīng)過(guò) 10倍稀釋，取一定的稀釋液涂布于MNA固體培養(yǎng)基（在MNB培養(yǎng)液中加入1.8%左右的瓊脂）平皿表面，使之形成單 菌落。根據(jù)菌落形態(tài)的差異，挑起產(chǎn)芽泡的、革蘭氏陽(yáng)性的 單菌落，接種到試管斜面中，編號(hào)后保存在4 c冰箱中。然后在采用平板擴(kuò)散的方法，將分離由來(lái)的芽泡桿菌用滅菌牙簽疏取少許分別點(diǎn)種到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37 c下培養(yǎng)24h,除去部分水份以便于抗菌物質(zhì)在培 養(yǎng)基中擴(kuò)散），37 c培養(yǎng)24h,然后把平板倒扣于盛一薄層氯 仿的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約

42、 40min ,以便殺死活細(xì)胞并能讓菌 落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里殘余的 氯仿?lián)]發(fā)30min （以揮發(fā)徹底）。在平板表面鋪一層剛培養(yǎng)好 的指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿后傾倒由剩余的菌液，晾干平板,置平板于37 c培養(yǎng)1618h ,觀察點(diǎn)種的芽泡桿菌周圍抗菌 圈的大小和清晰程度，來(lái)判斷受試菌對(duì)指示菌的抗菌能力。這6種芽泡桿菌當(dāng)中，MA139對(duì)4株指示菌表現(xiàn)由最強(qiáng)的抗菌能力（見(jiàn)表2-6、圖2-7 ）。表2-6初分離出6株芽抱桿菌對(duì)4株才旨7K菌的抑菌圈直徑菌株抑菌圈直徑/mmE. coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.8 0.

43、635.6 0.746.80.540.60.8MA13932.0 1.035.9 0.747.50.542.50.7MA35728.2 0.435.0 0.645.40.840.80.7MA55931.30.933.6 0.844.4 1.138.30.9MA63429.6 0.731.5 1.245.60.638.6 1.0MA74431.0 1.033.6 0.645.70.838.4 1.1注：表中值為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差*尸1圖2-7 MA139對(duì)指示菌的抑制作用（A、B、C、D分別代表對(duì)大腸桿菌K88、K99、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用）三、芽抱桿菌的抗逆性試驗(yàn)與乳酸細(xì)菌的耐

44、受性試驗(yàn)一樣，芬抱桿菌也需要進(jìn)行類似的檢驗(yàn)。芬抱桿菌必須在胃腸道存活，同時(shí)還必須能夠經(jīng)受住小腸液對(duì)菌體的破壞作用，也就是要求芬抱能夠抵抗小腸液中的膽鹽和 胰液素對(duì)它的毒害作用。分別提取生長(zhǎng)羊（體重4060kg）的胃食糜和小腸食糜，分別是 用4層無(wú)菌醫(yī)用紗布擠壓過(guò)濾，取濾液，檢驗(yàn)芬抱桿菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量對(duì)胃酸的 pH有很大影響，食糜量越少， 酸度越大。為體現(xiàn)良好的代表性，生羊胃液的樣本數(shù)可以適當(dāng)多 一些（通常取10份）混合以后在用紗布擠壓過(guò)濾。經(jīng)過(guò)篩選出來(lái)細(xì)菌 MA139,活化兩次后接種于 MNB培養(yǎng)基中， 37 c下225r/min震蕩培養(yǎng)36h ,將培養(yǎng)液置于 80 c水浴保

45、溫 15min,離心收集芬抱（相對(duì)離心力為 2500 Xg, 5min ）,菌體用 磷酸緩沖液（PBS:0.144%NaHPO4,0.024%KHPO4,pH7.0）洗滌兩 次，最后復(fù)溶在PBS緩沖液中，即為菌懸液，用于后續(xù)的抗逆耐 受性試驗(yàn)。從試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃液中保持3h ,活性芬胞的數(shù)量基本沒(méi)有下降，證明其對(duì)胃酸的耐受性很好。在小腸液中，起始 24h 不生長(zhǎng)，而24h后開(kāi)始生長(zhǎng)，培養(yǎng)液變得渾濁。在試驗(yàn)的第 5 天，取樣染色分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有大量芬胞增殖。 表明MA139 在小腸液中開(kāi)始受到了一定的抑制，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 能夠適應(yīng)這種環(huán)境。表明 MA139的芬抱可以在羊小腸中存

46、活弁 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體增殖。四、芬抱桿菌的鑒定通過(guò)上述的分離篩選，我們獲得了比較有價(jià)值的桿菌MA139,但是這株桿菌還沒(méi)有經(jīng)過(guò)生理生化鑒定，我們只是從篩選的過(guò)程 中體現(xiàn)的發(fā)酪特性方面初步認(rèn)為是芬抱桿菌。在投入應(yīng)用前，我們必須做嚴(yán)格的鑒定。.形態(tài)學(xué)鑒定首先進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察其單菌落的形態(tài)，弁對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行革 蘭氏染色及芬胞染色。MA139的細(xì)胞呈直桿狀，芬抱橢圓形近 中生，抱囊不膨大。在 MNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h,產(chǎn)生黏液，細(xì) 胞形態(tài)為長(zhǎng)桿狀；24h后菌落圓形，隆起，表面皺褶，不透明， 干燥；培養(yǎng)至36h,菌體均以休眠體芬抱的形式存在，菌落呈白 色圖2-8 (1)。在液體靜止培養(yǎng)時(shí)有菌膜形成。圖2-8

47、.生理生化鑒定形態(tài)鑒定結(jié)果(圖2-8)符合芬胞桿菌的特性，接著進(jìn)行生理生 化鑒定。生理生化鑒定比較復(fù)雜，涉及的操作步驟很多。參照常 見(jiàn)細(xì)菌細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)中的方法，對(duì)試驗(yàn)菌種進(jìn)行糖醇發(fā)酯試驗(yàn)、需氧性測(cè)定、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)等。芬抱桿菌鑒定用培養(yǎng)基如下：(1)糖醇發(fā)酯培養(yǎng)基及葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)培養(yǎng)基組成：(NH，)2HPO4 1.0g/L;MgSo 4 7H20 0.2g/L ;酯母浸膏 0.2g/L。配好后加入2%勺澳百里香蘭指示劑1mL/L,調(diào)節(jié)pH為7.2,分 別加入1%勺底物(糖醇或者葡萄糖)，按照底物類型分裝試管， 弁將

48、杜蘭管口朝下放入試管，115 c滅菌30min。(2)運(yùn)動(dòng)型培養(yǎng)基瓊脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化鈉：5.0/g ;蛋白陳:10g/L。pH7.07.2。121c滅菌 15min。3) V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基 蛋白陳：5.0g/L ; K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖: 5.0g/L。pH7.0 0.2o 2mL/支分裝試管,121c滅菌 15min。(4)耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別加入 2% 5% 7%10%勺 NaCl,pH7.07.2。121c滅菌 15min。(5)石蕊牛奶試驗(yàn)培養(yǎng)基石蕊乙醇溶液25mL,脫脂牛奶1000mL, 4mL/支分裝試管，115 c滅菌 15mi

49、n。(6)檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基NaCl:5.0g/L; MgSO4 7H20:0.2g/L ;(NH4)H2PO4： 1.0g/L; K2HPO4： 1.0g/L;檸檬酸鈉：5.0g/L 澳 百里草酚蘭(濃度為4%)。pH6.8 0.2o分裝試管，121c滅菌15min。(7)明膠水解培養(yǎng)基蛋白陳：0.5%明膠：10%15%pH7.07.2。分裝試管，115 c滅菌20min。(8)淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基 可溶性淀粉：20g/L; KNO3: 1.0g/L; NaCl:0.5g/L; K2HPO4: 0.5g/L ; MgSO4 7H2O:0.1g/L ; 瓊脂：2.0g/L o pH7.07.2。

50、121c 滅菌 15min。(9)厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分裝厭氧試管，充氮除氧，121c滅菌15min。生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2-9 o表2-9試驗(yàn)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng) 目MA139項(xiàng)目MA139葡萄糖發(fā)醉+葡萄糖產(chǎn)氣-麥芽糖發(fā)醉+運(yùn)動(dòng)性+棉籽糖發(fā)醉+厭氧生長(zhǎng)-乳糖發(fā)酵+淀粉水解試驗(yàn)+甘露醇發(fā)醉+H2O2酶試驗(yàn)+2%NaCl+檸檬酸鹽試驗(yàn)+5%NaCl+石蕊牛奶還原+7%NaCl+V-P試驗(yàn)+10%NaCl一明膠液化試驗(yàn)+”為反應(yīng)陽(yáng)性；，”為反應(yīng)陰性。根據(jù)生理生化的試驗(yàn)結(jié)果，基本可以證明試驗(yàn)菌MA139是芬抱桿菌。3.基因鑒定：16SrRNA分析為了進(jìn)一步確證生理生化鑒定的可靠性，

51、還可以補(bǔ)充進(jìn)行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比較常用的分析手段。采用基因組DNA提純?cè)噭┖刑崛?MAA139基因組DNA,弁以此為模版，選擇細(xì)菌16SrRNA基因特性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，弁對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物提純回收，測(cè)定 16SrRNA序列。目前這種試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)設(shè)備比較完善的生物研究所實(shí)驗(yàn)室都能進(jìn)行。其結(jié)果 證實(shí)MA139是枯草芬抱桿菌。五、芬抱桿菌的安全性評(píng)價(jià)確證了芬抱桿菌的特性，接下來(lái)需要考慮其安全性問(wèn)題。益生菌菌種的安全性是研究開(kāi)發(fā)中必須關(guān)注的問(wèn)題。這其中包括：生產(chǎn)菌種必須屬于官方公布允許使用的飼用微生物 菌種；使用的菌種本身必須無(wú)毒無(wú)害，不會(huì)產(chǎn)生任何毒素； 不存在耐藥性的質(zhì)粒或者耐藥

52、性基因不存在轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。以下還以枯草芬抱桿菌 MA139為例，簡(jiǎn)要說(shuō)明進(jìn)行芬胞桿菌 安全性評(píng)價(jià)的方法。安全性試驗(yàn)的靶動(dòng)物一般都選用老鼠，具體可參考如下方法：選擇12只體重基本一致的 SD大鼠(Sprague-Dawley,SD ) 初始體重在200220g比較適合，雌雄各半，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn) 組，一組用5mL芬抱菌懸液(108cfu/mL )注射到大鼠腹腔 中；另一組用5mL生理鹽水注射大鼠作為試驗(yàn)對(duì)照。注射前 禁食6h。灌服后觀察其中毒癥狀，看是否出現(xiàn)呼吸困難、抽 搐、肢體麻痹等。觀察時(shí)間為 1周。灌服MA139的芬抱后，所有大鼠均無(wú)明顯臨床癥狀， 無(wú)一死 亡，試驗(yàn)組和對(duì)照組間，沒(méi)有明顯差異，證

53、明 MA139安全無(wú) 毒。六、抗生素敏感性試驗(yàn)在實(shí)際生產(chǎn)中，絕大多數(shù)的動(dòng)物飼料都添加了抗生素，動(dòng) 物的腸道經(jīng)常處于抗生素壓力之下，這種選擇性壓力更容易 促進(jìn)細(xì)菌間耐藥性基因的傳遞和轉(zhuǎn)移。所以在選擇菌種的時(shí) 候，對(duì)于哪些攜帶有可轉(zhuǎn)移耐藥性基因的質(zhì)粒的細(xì)菌，從長(zhǎng) 遠(yuǎn)考慮，在生產(chǎn)實(shí)際中一定不要采用。在抗生素尚未完全被 益生素類的綠色添加劑完全取代的時(shí)候，抗生素有時(shí)會(huì)與益 生素聯(lián)合添加，因而在菌株篩選的時(shí)候，會(huì)人為地篩選出對(duì)抗生素具有抗性的微生物應(yīng)用于實(shí)際，這種短期行為也加大 了耐藥性細(xì)菌擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的可能。所以，為了確保芬抱桿菌 的使用效果，需要對(duì)抗生素的敏感性進(jìn)行檢驗(yàn)。研究結(jié)果顯示（表2-10 ,圖

54、 2-11）, MA139對(duì)試驗(yàn)的十種抗 生素的敏感性不一樣，對(duì)桿菌肽 鋅不敏感，對(duì)其它的抗生素都有 一定的敏感性，對(duì)桿菌肽鋅的耐 藥性可能與產(chǎn)生桿菌肽的細(xì)菌具 有一定的同源性。圖2-11 MA139對(duì)抗生素的敏感性表2-10MA139對(duì)抗生素的敏感性抗生素名稱濃度抑菌圈直徑/mm結(jié)果判定大觀毒素Spectinomycin(SPT)100 Ng/片26.5+桿菌肽Bacitracin(B)0.04IU/片0.0-卡那霉素Kanamycin(K)30/片24.1+多黏BPolymyxinB(PB)300/片12.8+吠喃唾酮Furazolidone(FR)300/片21.3+紅毒素Erythro

55、mycin(E)15/片24.0+氯毒素Chloramphenicol(C)30/片28.7+四環(huán)素Tetracycline(TE)30/片17.7+萬(wàn)古霉素Vancomycin(VA)30/片19.2+利福平Rifampin(RA)5/片27.8+注：+”為敏感；-8為不敏感。從上述分析可以發(fā)現(xiàn)，芬抱桿菌的分離篩選遠(yuǎn)比乳酸菌復(fù) 雜，特別是在安全穩(wěn)定性方面的檢驗(yàn)更是極為繁瑣。但是這些都是必須完成的工作，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，任何步驟出現(xiàn)差錯(cuò)都有 可能導(dǎo)致很嚴(yán)重的后果。第三節(jié)發(fā)酯飼料生產(chǎn)菌種的制備和保存在獲得了飼料生產(chǎn)菌種以后，需要對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 和保存，在生產(chǎn)中稱為制種。生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)模不同

56、，準(zhǔn)備生產(chǎn)菌 種的方式也有差別。大型生產(chǎn)企業(yè)由于用量比較大，往往自己制種，現(xiàn)生產(chǎn)現(xiàn)用。生產(chǎn)規(guī)模比較小的企業(yè)傾向于購(gòu)買菌種，或者 部分購(gòu)買，部分自己制備。在前期的敘述中，我們已經(jīng)知道，發(fā)酪飼料的生產(chǎn)菌種主要是 乳酸菌、酯母菌和芬抱桿菌。現(xiàn)在就針對(duì)這三種微生物的擴(kuò)大培 養(yǎng)和干燥保存進(jìn)行論述。一、乳酸菌的培養(yǎng)乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厭氧菌，很難制成干粉，最好現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。乳酸菌培養(yǎng)最簡(jiǎn)便、最成熟的方式類似酸奶的發(fā)酪。在無(wú)抗生素 污染的牛奶中加入6.0%8.0%勺糖，經(jīng)過(guò)消毒，冷卻至37 c左右， 在無(wú)菌條件下接種、厭氧培養(yǎng)，就可以獲得比較理想的培養(yǎng)物。以下是在實(shí)際生產(chǎn)中采用的乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法

57、。選取無(wú)抗生素污染的純牛奶 10L,加入600800g白砂糖（也可用紅糖代替），加熱至6070 C,直至蔗糖完全溶解，然后分裝在500mL三角瓶中，用棉花塞塞緊，外包牛皮紙。在 110 c 左右消毒滅菌10min,冷卻至37 c左右，接種乳酸菌，這樣不 僅可以提高糖酸轉(zhuǎn)化效率，而且乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程容易控制氣壓。在3640。恒溫培養(yǎng)2024h，就可以用于后續(xù)的發(fā)酪飼料擴(kuò)大接種，乳酸菌培養(yǎng)液與發(fā)酯飼料的接種比例為0.2%&右。需要強(qiáng)調(diào)的是一定要用無(wú)抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般對(duì)抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就會(huì)對(duì)乳酸的生 長(zhǎng)繁殖起到明顯的抑制作用，基本不能獲得合格的培養(yǎng)物。如果 沒(méi)有

58、合格的無(wú)抗生素污染牛奶，可以用無(wú)藥物污染的豆粕粉。豆粕經(jīng)過(guò)浸泡、磨漿以后可以替代牛奶，豆粕干物質(zhì)在溶液中的含 量為8.0炕右，類似于豆?jié){，其后續(xù)的補(bǔ)糖和接種發(fā)酪過(guò)程與牛 奶發(fā)酪過(guò)程類似。也可以用無(wú)抗生素污染的奶粉 （如新西蘭奶粉） 加水調(diào)漿（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢復(fù)成原始牛奶的營(yíng)養(yǎng)濃度。二、乳酸菌培養(yǎng)液的脫水干燥傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)液的干燥都是設(shè)法先除去培養(yǎng)液中的自由 水。但是對(duì)乳酸菌培養(yǎng)液來(lái)說(shuō)，除水是比較困難的單元操作。乳 酸菌對(duì)熱和氧氣都很敏感，即使是高濃度的乳酸菌培養(yǎng)液， 其含水量一般都超過(guò)90%干物質(zhì)的含量不超過(guò)10%除水通常需要 較長(zhǎng)的時(shí)間。對(duì)于厭氧的乳酸菌來(lái)說(shuō)，與空氣接觸時(shí)間

59、越長(zhǎng)，活 力損失也越大。采用常規(guī)的氣流干燥，乳酸菌的活性損失一般都要超過(guò)90% 以上。即使采用瞬時(shí)噴霧干燥，活力損失也要超過(guò) 85%脫水后 的制劑，在20c條件下，在空氣中暴露24h,活力損失就會(huì)達(dá)到 40%iZ上，給實(shí)際推廣造成很大困難。近年來(lái)，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保 存方面進(jìn)行了大量研究，提出了很多高科技的方法， 其中比較常 用的方法是抽真空冷凍干燥和包埋造粒。但因成本造價(jià)高昂，弁不適合工業(yè)化生產(chǎn)。下面敘述是比較實(shí)用的乳酸菌脫水干燥方 法：一般普通的大麥、小麥和玉米等農(nóng)副產(chǎn)品的含水量都在14%左右，經(jīng)過(guò)100 c氣流干燥以后，可以比較簡(jiǎn)單地把水份降低到 6%&右。然后

60、再用這些經(jīng)過(guò)干燥的載體以大比例（10倍以上）與乳酸絕培養(yǎng)液混合，使混合物的水份含量為11%20%從而使 乳酸菌處于休眠狀態(tài)，不易失活。干燥冷卻后的載體可以迅速的 吸附培養(yǎng)液中的游離水，然后在真空包裝。實(shí)驗(yàn)表明，此方法保 存的乳酸菌，在室溫條彳下保存3個(gè)月，乳酸菌的活力可以保存 50%上，保存6個(gè)月時(shí)，乳酸菌的活力保存在 40炕右。此方 法簡(jiǎn)便實(shí)用，成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定，保質(zhì)期長(zhǎng)，且活性乳酸菌的 回收率較高。（一） 活性乳酸菌脫水干燥流程抽真空密封包裝干燥載體一|一混合乳酸菌培養(yǎng)一1（二）流程說(shuō)明.載體的干燥載體為麥粉、玉米粉或者其他農(nóng)副產(chǎn)品。粉碎后過(guò)20目篩。對(duì)載體進(jìn)行氣流干燥，檢測(cè)其含水量。將