脂肪間充質干細胞移植治療慢性阻塞性肺疾病

1、脂肪間充質干細胞移植治療慢性阻塞性肺疾病 中國組織工程研究 第20卷 第41期 20161007出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 7, 2016 Vol.20, No.41 www. CRTER.org 研究原著 郝術安，吳 琦，王茂均(天津醫(yī)科大學研究生院，天津市 300070；天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院內科，天津市 300350； 3 天津市海河醫(yī)院呼吸科，天津市 300222) 3 21 2 DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.015 ORCID: 0000-0001-8

2、143-5847(郝術安) 文章快速閱讀： 文題釋義： 慢性阻塞性肺疾?。菏且环N常見的以持續(xù)氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限進行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關。 間充質干細胞減輕肺部炎癥反應：大量研究證實間充質干細胞可以分化成肺上皮細胞，并誘導其表達氣道和/或肺泡上皮細胞的標記，可表達HLA ，HLA 以及其他共刺激分子，使得間充質干細胞可以成功逃避機體免疫監(jiān)測。此外，它可以在損傷組織局部分泌一些生長因子和細胞因子，提高自由基清除酶的活性，增強機體的抗氧化能力，減輕脂質過氧化引起的損傷。另有研究表明到達損傷肺組織中的間充質干細胞能在下調促炎因子表達的同

3、時上調抗炎細胞因子的表達，從而起到減少甚至是中止炎癥的作用。 摘要 背景：慢性阻塞性肺疾病是一種具有氣流受限特征的以炎癥為核心的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。 目的：探討脂肪間充質干細胞對慢性阻塞性肺疾病大鼠的治療作用。 方法：健康雄性SD大鼠60只隨機分成3組(n=20)，治療組和模型組大鼠通過煙熏及氣管內注入脂多糖的方法建立慢性阻塞性肺疾病模型，對照組大鼠不進行任何處理。造模后治療組大鼠經尾靜脈注射CM-Dil 標記的脂肪間充質干細胞，模型組及對照組給予等量生理鹽水，移植后14 d，檢測大鼠肺通氣功能、炎癥因子水平和肺組織病理學變化。 結果與結論：與對照組比較，模型組和治療組肺功能明顯下降，治療組肺功

4、能較模型組明顯改善(P 0.05)；治療組肺泡灌洗液中白細胞總數、巨噬細胞數及中性粒細胞數均顯著低于模型組(P 0.05)；治療組肺泡灌洗液中白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白水平低于模型組(P 0.05)；與模型組相比，治療組血清中超氧化物歧化酶活性顯著增高、丙二醛水平顯著降低(P 0.05)；治療組較模型組肺氣腫樣改變減輕；CM-Dil 標記的脂肪間充質干細胞能夠歸巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織并存活；結果表明，脂肪間充質干細胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能，減輕炎癥反應，具有一定治療作用。 關鍵詞： 干細胞；移植；慢性阻塞性肺疾病；脂肪間充質干細胞；炎癥因子；細胞移植 主題詞

5、： 肺疾病，慢性阻塞性；脂肪組織；間質干細胞移植；組織工程 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 郝術安，男，1981年生，河北省唐山市人，漢族，2006年河北醫(yī)科大學畢業(yè)，主治醫(yī)師，主要從事呼吸內科研究。 通訊作者：吳琦，博士，教授，天津市海河醫(yī)院呼吸科，天津市 300222 中圖分類號:R394.2 文獻標識碼:B 文章編號:2095-4344 (2016)41-06177-06 稿件接受： 2016-07-27 6177 Hao Shu-an, Attending physician, Graduate School, Tianjin Med

6、ical University, Tianjin 300070, China; Department of Respiratory Medicine, Xianshuigu Hospital of Jinnan District, Tianjin 300350, China Corresponding author: Wu Qi, M.D., Professor, Department of Respiratory Medicine, Tianjin Haihe Hospital, Tianjin 300222, China www. CRTER.org Adipose-derived mes

7、enchymal stem cell transplantation for treatment of chronic obstructive pulmonary disease Hao Shu-an1, 2, Wu Qi3, Wang Mao-jun2 (1Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Department of Respiratory Medicine, Xianshuigu Hospital of Jinnan District, Tianjin 300350, China; 3

8、Department of Respiratory Medicine, Tianjin Haihe Hospital, Tianjin 300222, China) Abstract BACKGROUND: Chronic obstructive pulmonary disease is progressive respiratory disease characterized by airflow limitation. OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem c

9、ell transplantation in rats with chronic obstructive pulmonary disease. METHODS: Sixty healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control, model and treatment groups (n=20 per group). Rat models of chronic obstructive pulmonary disease were made in the model and treatment group, whi

10、le no treatment was done in the control group. After modeling, rats in the treatment group were given tail vein injection of CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells, and rats in the model and control groups given the same amount of normal saline. Rat pulmonary ventilation function, inf

11、lammatory factor level and pathological changes of the lung were detected at 14 days after cell transplantation. RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, reduced lung function was found in rats with chronic obstructive pulmonary disease, but the cell transplantation significantly improved this reduct

12、ion (P 0.05). Compared with the model group, significantly reduced indexes were visible in the treatment group (P 0.05), including the total number of white blood cells, the number of macrophages and neutrophils, levels of interleukin-8, tumor necrosis factor and C-reactive protein in the bronchoalv

13、eolar lavage fluid as well as serum level of malondialdehyde, while serum superoxide dismutase activity was increased significantly in the treatment group (P 0.05). In the treatment group, emphysema-like changes were mitigated and CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells were capable of

14、 homing to the lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease and survived. All these findings show that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can improve lung function of rats with chronic obstructive pulmonary disease, and reduce inflammatory response, which has for

15、 certain some therapeutic effects. Subject headings: Pulmonary Disease, Chronic Obstructive; Adipose Tissue; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Tissue Engineering Cite this article: Hao SA, Wu Q, Wang MJ. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treatment of chronic obstructive

16、pulmonary disease. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(41): 6177-6182. 0 引言 Introduction 慢性阻塞性肺疾病是臨床中常見的一種慢性疾病，多見于中老年患者活質量 3-5 1-2 1.2 時間及地點 實驗于2014年1月至2015年10月在天津醫(yī)科大學動物實驗室完成。 1.3 材料 1.3.1 實驗動物 64只四五周齡雄性SD大鼠，體質量200-250 g，購于天津市實驗動物中心。 1.3.2 主要試劑、儀器 超氧化物歧化酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒(上海閎巨實業(yè)有限公司)；白細胞介素8、白細胞介素1

17、0、腫瘤壞死因子 ELISA試劑盒(上海滬鼎生物技術有限公司)；臺式離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；顯微鏡(德國Lica公司)；721分光光度計(上海第三分析儀器廠)；流式細胞儀(美國Coulter公司)。 1.4 實驗方法 1.4.1 實驗分組 取60只SD大鼠隨機分成3組，分別為對照組、模型組和治療組，每組20只。治療組和模型組制備慢性阻塞性肺疾病模型，對照組不進行造模。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org ，該病進展緩慢，但常反復 6 發(fā)作，使患者勞動能力顯著降低，嚴重影響患者的生 。該病致病因素很多，炎癥反應是其主要 發(fā)病機制，到目前

18、為止尚未找到有效的治療方案。干細胞是一類能夠在特定條件下分化成為各種組織器官的細胞 8-9 7 ，目前已有大量研究將干細胞運用于治療各種 10-11 自身免疫性疾病及其他多種疾病，脂肪間充質干細 胞是繼骨髓干細胞之后干細胞研究領域中的又一熱點。實驗旨在探討脂肪間充質干細胞移植對慢性阻塞性肺疾病大鼠的治療作用。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 隨機對照動物實驗。 6178 1.4.2 脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)10-11 取4只SD大鼠，以頸椎脫臼法處死，分離出腹股溝及附睪處脂肪組織，PBS沖洗，用剪刀剪成乳糜樣的細小顆粒，取少量放入離心管中，加入0.

19、1%型膠原酶，用膠頭滴管將混合液吹打混勻，使剪碎的脂肪組織呈懸浮狀態(tài)，于37 消化120 min，離心管中加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基，用膠頭滴管吹打均勻，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，加入PBS沖洗2遍，加入完全培養(yǎng)基，用膠頭滴管吹打至懸浮狀態(tài)，吸取少量懸液接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ，體積分數為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天時進行第1次換液，之后隔日換液1次，培養(yǎng)皿中細胞達80%-90%融合時，加入0.25%胰酶消化，并按12-13的比例進行傳代培養(yǎng)。取第5代細胞貼壁融合達80%時向其中加入含4 mg/L CM-DiI的培養(yǎng)基，37 孵育30 min，PBS沖洗2遍，

20、熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況，然后消化細胞傳代培養(yǎng)。 1.4.3 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立 參照任薇等 12-13 方法，治療組和模型組給予生理鹽水10 mL/(kg?d) 灌胃4周后開始造模，造模第1天、第14天，腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠，氣管注入脂多糖200 L，第2-28天(第14天除外)每天上午將大鼠置于密封的1 m3 煙室中，持續(xù)吸入香煙煙霧30 min(滁州煙卷廠生產的紅三環(huán)香煙，焦油量19 mg，尼古丁1.2 mg)，每天熏1次，每次15支香煙，同時每天繼續(xù)用生理鹽水灌胃，最終以大鼠出現(xiàn)頻繁咳嗽作為判斷造模成功的標準。 1.4.4 脂肪間充質干細胞移植 造模成功后1周，

21、對照組及模型組大鼠尾靜脈注射0.5 mL生理鹽水，治療組大鼠尾靜脈注射CM-Dil標記的脂肪間充質干細胞懸液 0.5 mL(1106 )。 1.4.5 肺功能儀檢測大鼠肺通氣功能 細胞移植后 14 d，各組大鼠腹腔注射8%水合氯醛麻醉，行氣管切開后迅速插入Y形氣管插管，Y形氣管插管的一端連接呼吸流量換能器，另一端連接三通管，通過BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)記錄一段平靜呼吸曲線后，在呼氣末以注射器經三通管迅速向氣管內打6 mL空氣，此過程相當于大鼠被動深吸氣，然后立即將注射器移開，讓氣體自然呼出，計算各組大鼠1 s時間用力呼出量(FEV1)、1 s時間用力呼出量與用力肺活量之比(FEV1/FV

22、C)、最大呼氣中期流速(MMEF)、最大呼氣流量(PEF)測定肺通氣功能。 1.4.6 肺泡灌洗液中各類白細胞計數及白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白水平 細胞移植后14 d，每組隨機取7只大鼠，打開胸腔，使氣管及雙肺暴露于 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH www. CRTER.org 手術視野，切開氣管，用血管鉗夾閉右側主支氣管，向左肺內注入生理鹽水進行灌洗，灌洗液在左肺停留數秒后抽出灌洗液，重復以上操作過程3次，收集3次肺泡灌洗液。取少量肺泡灌洗液滴入離心管中，1 500 r/min離心10 min，膠頭滴管吸出離心管中的上清液，按

23、照ELISA試劑盒說明書測定肺泡灌洗液中白細胞介素8、腫瘤壞死因子及C-反應蛋白水平。吸取10 L肺泡灌洗液滴入細胞計數板，于低倍鏡下計數位于四角的四個大方格中的細胞數。另取少許沉淀細胞涂片，進行瑞氏染色，選取細胞計數板上的100個白細胞，根據細胞形態(tài)特點進行分類計數，求出各種白細胞所占的百分率，再以細胞總數求得肺泡灌洗液中各類白細胞的絕對值。 1.4.7 血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平 細胞移植后14 d，每組隨機取7只大鼠，從大鼠頸動脈抽取少量血液。以硫代巴比妥酸反應比色法檢測血清中丙二醛水平。以黃嘌呤氧化法檢測血清中超氧化物歧化酶活性。 1.5 主要觀察指標 肺通氣功能；肺泡灌洗液中各

24、類白細胞計數及白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白水平；血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平；大鼠肺組織病理變化。 1.6 統(tǒng)計學分析 所有實驗數據以x_ s表示，用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行兩樣本t 檢驗分析，P 0.05為差異有顯著性意義。 2 結果 Results 2.1 實驗動物數量分析 參加實驗數量60只，進入結果分析數量60只，中途無脫落。 2.2 各組大鼠肺通氣功能檢測結果 與對照組比較，模型組和治療組肺功能明顯下降，治療組肺功能較模型組明顯改善(P 0.05)。各組大鼠肺通氣功能指標比較見表1。 2.3 肺泡灌洗液中細胞計數與分類 模型組肺泡灌洗液中白細胞總數、巨噬細

25、胞數及中性粒細胞數均顯著高于對照組(P 0.05)，治療組肺泡灌洗液中白細胞總數、巨噬細胞數及中性粒細胞數均顯著低于模型組(P 0.05)。各組大鼠肺泡灌洗液中細胞計數比較見表2。 2.4 各組大鼠血清中白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白水平 治療組白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白水平低于模型組(P 0.05)，但還高于對照組(P 0.05)，見表3。 2.5 各組大鼠血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平 與模型組相比，治療組血清超氧化物歧化酶活性明顯增高、丙二醛水平顯著降低(P 0.05)，見表4。 6179 _ www. CRTER .org 表1 各組大鼠肺通氣功能指標比較 (

26、xs，n=20) Table 1 Comparison of pulmonary ventilation function indexes of rats among groups 對照組 模型組 治療組 表4 各組大鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛水平 (xs) Table 4 Serum superoxide dismutase and malondialdehyde levels in rats 項目 對照組 模型組 治療組 _ 項目 1 s時間用力呼出量(L) 肺活量之比(%) 最大呼氣中期流速(L/s) 2.080.15 1.060.23b 1.730.23ab 超氧化物歧化酶(U/mL

27、) 152.731.26 102.021.23a 141.621.22ab 丙二醛(mol/mL) 3.78 0.33 6.86 0.35a 4.02 0.32ab 表注：與模型組比較，aP 0.05；與對照組比較，bP 0.05。 bab 1 s時間用力呼出量與用力85.022.38 38.712.56 72.082.34 1.860.18 1.060.17 1.370.55 4.850.10 4.130.18b 4.380.14ab bab 最大呼氣流量(L/s) 表注：與模型組比較，aP 0.05；與對照組比較，bP 0.05。 表2 各組大鼠白細胞總數、巨噬細胞數及中性粒細胞數變化 _

28、 (xs) Table 2 The total number of white cells, the number of macrophages and the number of neutrophils in the white blood cells of rats in each group 表5 各組大鼠平均內襯間隔、單位面積平均肺泡數、平均肺 _ 泡面積比較 (xs) Table 5 Mean lining interval, mean alveolar number per unit area, and the average alveolar area in rats 組別 平均

29、內襯間隔 (m) 對照組 模型組 治療組 45.052.11 80.562.13a 55.372.15ab 平均肺泡數 (106個/m2) 406.3718.21 205.2812.27a 325.1512.18ab 平均肺泡面積 (m2) 5 108.12330.21 8 134.20423.25a 5 982.37415.30ab 項目 - 對照組 模型組 治療組 3.950.55ab 1.960.28 ab 白細胞總數(109 L1) 2.500.57 6.420.68a 巨噬細胞數(%) 1.670.18 3.470.58 a 表注：與模型組比較，aP 0.05；與對照組比較，bP 0

30、.05。 中性粒細胞數(%) 7.871.20 25.122.13a 13.24 1.18ab 表注：與對照組比較，aP 0.05，與模型組比較，bP 0.05。 表3 各組大鼠血清白細胞介素8、腫瘤壞死因子、C-反應 蛋白水平比較 (xs) Table 3 Comparison of interleukin 8, tumor necrosis factor alpha and C-reactive protein levels in rat serum 對照組 26.482.24 18.202.30 模型組 57.062.23 78.012.27 baa _ 項目 白細胞介素8(ng/L)

31、腫瘤壞死因子(g/L) 治療組 36.412.15 30.122.31ab ab 圖1 CM-Dil 標記的脂肪間充質干細胞 Figure 1 CM-Dil labeled adipose-derived mesenchymal stem cells 圖注：脂肪間充質干細胞能夠歸巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織并存活。 C-反應蛋白(ng/L) 1.93 0.78 a 25.722.76a 8.350.24ab 表注：與模型組比較，P 0.05；與對照組比較，P 0.05。 A B C 圖2 各組大鼠肺組織病理變化(蘇木精-伊紅染色) Figure 2 The pathological chan

32、ges of lung tissues in rats (hematoxylin-eosin staining) 圖注：圖中A為對照組肺組織結構完整(200)；B為模型組肺組織可見到慢性阻塞性肺疾病樣病理改變(40)；C為治療組肺氣腫樣改變減輕(100)。 2.6 熒光顯微鏡下觀察脂肪間充質干細胞的定位 CM-Dil 標記的脂肪間充質干細胞能夠歸巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織并存活，見圖1。 2.7 大鼠肺組織病理變化 治療組、模型組肺組織均 6180 可見到慢性阻塞性肺疾病樣病理改變，但治療組較模型組肺氣腫樣改變減輕(圖2)，平均內襯間隔(MLI)、單位面積平均肺泡數(MAN)、平均肺泡面積

33、(MAA)差異均有顯著性意義(P 0.05)，見表5。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 慢性阻塞性肺疾病是一種慢性炎癥性疾病14-15 ，其累及包括中央氣道、外周氣道、肺實質在內的組織。目 前最主要治療為早期戒煙16 ，積極預防氣道感染 17-18 ， 早期有效地控制炎癥反應19-21 ，長期家庭氧療能改善患 者低氧血癥22，加強體育鍛煉增強機體抵抗力 23 ，防治 并發(fā)癥等 24 ，傳統(tǒng)的藥物及相關外科治療均不能阻止病 情的進一步發(fā)展，作用非常有限 25 ，幾乎沒有其他明確 的方法能夠延長患者的壽命，也沒有任何治療方法能夠完全恢復慢

34、性阻塞性肺疾病患者受損的肺功能 26-27 。 骨髓間充質干細胞可以在特定條件下分化成為多種不同的組織器官被廣泛應用于多種臨床疾病的治療 28-30 。 相關研究證實脂肪組織中同樣含有大量的間質干細胞，也具有體外增殖及多重分化的潛力，能運用于組織與器官的再生與修復 31-33 。目前有研究認為骨髓間 充質干細胞移植后，在一定誘導條件下可以到達損傷的肺組織分化成肺泡上皮細胞 34-37 。實驗對治療組大 鼠經尾靜脈注射CM-Dil 標記的脂肪間質干細胞，其余兩組注射等劑量的生理鹽水，研究結果顯示脂肪間質干細胞能夠歸巢到大鼠的肺組織并且存活，與上述研究結果一致。除此之外脂肪間質干細胞還可以通過分泌

35、各種細胞因子減輕炎癥反應、促進損傷組織的修復 38-42 ，結果顯示治療組炎癥因子高于對照組而低于 模型組，提示脂肪間質干細胞移植有降低炎癥反應的作用。 綜上所述，脂肪間質干細胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織病理改變，減輕炎癥反應，具有一定治療作用。 致謝：感謝天津市海河醫(yī)院呼吸科的吳琦老師與天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院內科的王茂均老師。 作者貢獻：實驗設計為郝術安、吳琦，實驗實施為郝術安、吳琦、王茂均，實驗評估為吳琦、王茂均，資料收集為郝術安、吳琦、王茂均。 利益沖突：所有作者共同認可文章內容不涉及相關利益沖突。 倫理問題：實驗過程中對動物的處置符合2009 年Ethical issues

36、in animal experimentation相關動物倫理學標準的條例。 文章查重：文章出版前已經過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。 文章外審：文章經國內小同行外審專家雙盲外審，符 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH www. CRTER.org 合本刊發(fā)稿宗旨。 作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數據(包括計算機數據庫)記錄及樣本已按照有關規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。 文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協(xié)議。 4 參考文獻 References 1 中華醫(yī)

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