包頭醫(yī)學院微生物學與微生物檢驗實驗指導之實驗5 金黃色葡萄球菌的檢測

1、實驗5 金黃色葡萄球菌的檢測目的要求掌握金黃色葡萄球菌檢測的基本程序熟悉金黃色葡萄球菌檢測的基本方法與步驟。器材和試劑1樣品 可疑奶粉 2培養(yǎng)基及試劑 普通營養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板、卻普曼瓊脂平板、7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵管（微）、甲苯胺藍DNA瓊脂平板、葡萄糖微量發(fā)酵管、新鮮抗凝血漿（人或兔）。3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、檢驗程序1：10奶粉稀釋液 7.5%NaCl肉湯增菌 直接計數(shù) 血平板和卻普曼瓊脂平板 觀察菌落特征，革蘭染色鏡檢 血漿凝固酶試驗、甘露醇試驗 耐熱核酸酶試驗、腸毒素測定等二、檢驗方法1、樣品的采取和送檢（

2、1）散裝或大型包裝的乳品檢樣：用滅菌刀、勺取樣。在移采另一件樣品前，應將用過的刀、勺清洗滅菌。采樣時應注意不同的部位、使樣品有代表性。樣品仿品放入滅菌器內，及時送檢。(2)小型包裝的乳品檢樣：應采取整件包裝，奶粉1瓶或1包。采樣時應注意包裝的完整性。（3）成批產品質量的檢樣：采樣量一般以1的比率抽取，應注意代表性，不足千件者抽取1件。2、檢樣處理（1）罐（瓶）裝乳粉：將罐或瓶表面先用溫水洗凈，再用點燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上表面，然后用滅菌的開罐器打開罐或瓶面，以無菌手續(xù)稱取25g檢樣，放入裝有玻璃珠的三角燒瓶內，然后徐徐加入225ml溫熱的滅菌生理鹽水，（先加少許使乳粉調成糊狀，再全部加入，

3、以免奶粉結塊）。振搖均勻，使充分溶解后即為1：10稀釋液。（2）袋裝乳粉：可用75%的酒精棉球擦拭消毒袋口后，以無菌手續(xù)開封取樣。以后操作同罐（瓶）裝乳粉。增菌培養(yǎng)：用無菌吸管吸取上述稀釋液5ml加入7.5%NaCl肉湯或胰酪胨大豆肉湯45ml培養(yǎng)基內，置37溫箱培養(yǎng)24h。再肉湯中呈渾濁生長，胰酪胨大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈渾濁生長。分離培養(yǎng)：直接取可疑奶粉或增菌培養(yǎng)物劃線接種至血平板或卻普曼瓊脂平板，經37孵育18-24h后觀察菌落。取可疑菌落做革蘭染色鏡檢。根據(jù)形態(tài)染色特性，然后進一步做生化反應鑒定。生化反應（1）觸酶試驗：本試驗用于初步區(qū)別葡萄球菌和鏈球菌，前者為陽性，后者為陰

4、性。（2）血漿凝固酶試驗：1）原理：致病性葡萄球菌產生的一種能凝固人和兔血漿的蛋白質?？煞譃閮煞N： 結合型血漿凝固酶直接作用于血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細菌表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測出。 另一種是分泌至菌體外的游離型凝固酶，作用類似凝血酶原，可被人或兔血漿中協(xié)同因子激活變成凝固酶樣物質，使液態(tài)的纖維蛋白原變成固態(tài)的纖維蛋白，進而使血漿凝固，可用試管法測出。2）方法：玻片法：取人或兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的破片上，挑取可疑菌落分別與血漿和鹽水混合；試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿和生理鹽水，挑取被檢菌分別加入血漿中并混勻，于370C水浴3-4小時3）結果判斷、解

5、釋和報告：玻片法以血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象判為陽性，反之，細菌在血漿中呈均勻混濁則為陰性；試管法以血漿凝固判為陽性，反之，試管內血漿不凝固仍流動的，則為陰性。若陰性，應繼續(xù)觀察到24h，仍不凝固者為陰性。4）臨床意義：血漿凝固酶試驗被廣泛用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其它葡萄球菌，常作為鑒定葡萄球菌致病性的主要依據(jù)之一，金黃色葡萄球菌的本試驗為陽性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（3）耐熱核酸酶測定：1）原理：致病性葡萄球菌能產生一種耐熱核酸酶，能將DNA水解成由幾個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。水解后的DNA短鏈與甲苯胺藍結合，使甲苯胺藍DNA瓊脂顯示粉紅色。非致病性葡萄球菌雖然也能產生

6、DNA酶，但不耐熱。因此耐熱DNA酶測定可作為鑒定致病性葡萄球菌的重要指標。2）方法：玻片法：取融化好的甲苯胺藍DNA瓊脂3ml均勻澆在載玻片上，待瓊脂凝固后打上68個孔徑25mm的小孔，各孔分別加1滴經沸水浴3min處理過的待檢菌和陽性、陰性對照葡萄球菌培養(yǎng)物，37孵育3h，觀察有無粉紅色圈及其大小。平板法：在已形成葡萄球菌菌落的 平板上挑選待檢菌并做好標記，置60烤箱加熱2h（使不耐熱的DNA酶滅活），取出后平板上傾注10ml已預先融化的甲苯胺藍DNA瓊脂，37孵育3h，觀察菌落周圍有無粉紅色圈。劃線刺中法：將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種劃線刺中于甲苯胺藍DNA瓊脂平板上

7、，371培養(yǎng)24小時，觀察刺中線周圍有無淡粉紅色出現(xiàn)。3）結果判斷、解釋和報告：玻片法孔外出現(xiàn)粉紅色圈的為陽性；平板法葡萄球菌菌落周圍有無粉紅色圈的為陽性。金黃色葡萄球菌的本試驗為陽性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（4）甘露醇發(fā)酵試驗：1）原理：致病性葡萄球菌多能發(fā)酵甘露醇產酸，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。2)方法：將待檢菌分別接種于兩支甘露醇發(fā)酵管，其中一支滴加滅菌的液體石蠟（不低于1cm ）, 35培養(yǎng)1824小時后觀察結果。3）結果判斷、解釋和報告：兩支培養(yǎng)基均混濁，由紫色變?yōu)辄S色為甘露醇發(fā)酵試驗陽性，兩支都為紫色或只有一支變?yōu)辄S色為陰性。金黃色葡萄球菌的本試驗為陽性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（5）腸毒素測定：1）瓊脂擴散試驗：金黃色葡萄球菌腸毒素與腸毒素抗血清在瓊脂板上可形成白色沉淀線。2）ELISA法：利用雙抗體夾心法，測定標本中金黃