包頭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與微生物檢驗實驗指導(dǎo)之實驗4 肉中沙門氏菌的檢測

1、實驗4 肉中沙門氏菌的檢測目的要求掌握沙門氏菌的形態(tài)、染色特性、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)及檢驗程序掌握沙門氏菌的血清學(xué)鑒定方法器材和試劑1標(biāo)本 變質(zhì)肉2培養(yǎng)基及試劑 緩沖蛋白胨水、氯化鎂孔雀綠増菌液、亞硫酸鹽胱氨酸増菌液、伊紅美蘭瓊脂平板、SS瓊脂平板、動力吲哚尿素培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、甲基紅試劑、VP試劑、硝酸鹽培養(yǎng)基及A、B試劑、沙門菌O及H因子單價血清、3%過氧化氫溶液。3其他 高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、生理鹽水。步驟和方法標(biāo)本采集及運送：（1）采樣是食品檢驗中的一個重要環(huán)節(jié)，所采樣品應(yīng)具有代表性。（2）采樣

2、必須用滅菌器具，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。（3）樣品可分為大、中和小樣三類。大樣指一整批食品；中樣指從樣品各部分隨機(jī)抽的混合樣品，以200g為準(zhǔn)；小樣指做分析用的檢樣，以25g為準(zhǔn)。食品微生物檢驗一般取小樣。根據(jù)食品的種類采取不同的 采樣方法。如固體粉末和液體混合后取樣；袋、罐、瓶裝食品應(yīng)取未開封的完整體；冷凍食品在冷凍狀態(tài)取樣，非冷凍食品需在0-5保存。（5）樣品采集后應(yīng)立即送檢，一般不應(yīng)超過3h。2、檢驗方法：食品中沙門菌的檢驗方法有四個基本步驟：即前增菌或選擇性增菌；選擇性平板分離沙門菌；生化試驗鑒定到屬；血清學(xué)分型鑒定。（1）增菌培養(yǎng)：將標(biāo)本25g加入裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣口

3、瓶中。固體食品用均質(zhì)器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎；粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于361培養(yǎng)4h，移取10ml，轉(zhuǎn)接種在100ml氯化鎂孔雀綠増菌液或四硫酸鈉煌綠増菌液內(nèi)，361培養(yǎng)18-24h.鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必進(jìn)行前增菌。直接取樣25g（25ml）加入滅菌生理鹽水25ml，按前述方法制成勻液，取25ml接種于100m亞硫酸鹽胱氨酸増菌液內(nèi)，361培養(yǎng)18-24h.（2）分離：取増菌液分別接種到伊紅美蘭瓊脂平板、SS瓊脂平板，361培養(yǎng)18-24h.（3）菌落觀察：由于本菌不分解乳糖并產(chǎn)堿，所以在SS瓊脂和麥康凱平板上形成

4、無色或淡黃色、半透明、圓形、凸起、邊緣整齊的光滑濕潤小菌落。產(chǎn)H2S的菌株可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。（4）生化反應(yīng)1）氧化酶試驗：取氧化酶紙片，刮取SS瓊脂上的較大的菌落，觀察紙片顏色的變化，呈藍(lán)紫色為陽性，不變?yōu)殛幮詾殛幮裕ㄈ缭噭辂}酸二甲基對苯二胺，陽性者則為紅色）。沙門氏菌氧化酶試驗為陰性。2）初步試驗鑒定：將沙門氏菌分別接種在克氏雙糖鐵瓊脂、動力吲哚尿素培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水管和硝酸鹽培養(yǎng)基管中，經(jīng)35孵育18-24h后，加入相應(yīng)試劑，觀察結(jié)果。同時做觸酶試驗。結(jié)果見表1表1 沙門氏菌的基本生化反應(yīng)KIA MIU 硝酸鹽 氧化酶 觸酶 還原斜面 底層 產(chǎn)氣 H2S 動力

5、吲哚 脲酶傷寒沙門菌 K A - +/- + - - - + +甲型副傷寒 K A + -/+ + - - - + +乙型副傷寒 K A + + + - - - + +氧化酶試驗原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。甲基紅試驗的原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸等，使pH降至45以下，加入甲基紅試劑則呈紅色為陽性。若分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，則pH 62以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。V-P試驗原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被

6、氧氧化為二乙酰，進(jìn)而與胍基起作用生成紅色化合物，則為V-P試驗陽性動力靛基質(zhì)尿素酶培養(yǎng)基原理：制備的動力靛基質(zhì)尿素酶培養(yǎng)基除加有200g/L尿素和酚紅指示劑外，其蛋白胨較原克利斯頓森尿素培養(yǎng)基提高10倍，并制成半固體培養(yǎng)基，以便觀察細(xì)菌的動力。由于蛋白胨中含有豐富的色氨酸，產(chǎn)生色氨酸酶的細(xì)菌可以水解色氨酸形成靛基質(zhì)，當(dāng)加入靛基質(zhì)試劑后形成玫瑰吲哚。產(chǎn)生玫瑰紅色為陽性。產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將培養(yǎng)基中的尿素分解產(chǎn)堿，使酚紅指示劑顯桃紅色。因此，該試驗可同時觀察細(xì)菌動力、靛基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)菌分解尿素的活性，故簡稱為MIU試驗過氧化氫酶試驗原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成

7、分子氧出現(xiàn)氣泡。硝酸鹽還原試驗原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。但硝酸鹽還原的過程因細(xì)菌不同而異，有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽有的細(xì)菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮。（5）沙門氏菌的血清學(xué)分型鑒定：待檢菌形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)疑為沙門菌，可選用沙門菌的多價診斷血清進(jìn)行玻片凝集。首先用A-F群多價診斷血清作玻片凝集試驗，在試驗時應(yīng)以

8、生理鹽水作對照。血清凝集試驗在5min內(nèi)不出現(xiàn)凝集者可確定為陰性。但若生化反應(yīng)比較典型，應(yīng)考慮選用Vi凝集試驗（傷寒和丙型副傷寒沙門菌具有Vi抗原），若凝集，則用無菌生理鹽水將菌洗下，制成濃厚的懸液，100水浴15min（破壞Vi抗原），再與A-F群多價“O”診斷血清做凝集試驗。若與A-F群多價“O”血清發(fā)生凝集，應(yīng)再與沙門菌”O(jiān)”單價因子血清分別作玻片凝集試驗，以確定該菌株屬于的群別。一般先選用本地區(qū)檢出率最高血清型的相應(yīng)血清作玻片凝集反應(yīng)。若已確定是何種血清型沙門菌，再分別用H因子血清先檢查第一相抗原，然后檢查第二相抗原，最后確定該菌種屬于哪一型沙門菌。結(jié)果報告：綜合上述生化和血清學(xué)試驗的

9、結(jié)果，對食品中沙門菌做出菌型判斷，并報告結(jié)果。注意事項：1、嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范。2、采樣注意代表性、采樣后立即送檢。3、挑選典型菌落進(jìn)行生化反應(yīng)。4、血清學(xué)試驗中取菌量要適宜，保證抗原-抗體的最佳比例。附錄1糖發(fā)酵培養(yǎng)基肉湯膏（pH7.47.6） 100ml糖 0.51g16g/L溴甲酚紫乙醇溶液 0.1m1將上述成分溶解后，分裝試管。經(jīng)55.16kPa高壓滅菌l5min。如需觀察產(chǎn)氣，可于每試管中加小倒管一支；如加入的糖為雙糖必須滅菌后加入培養(yǎng)基內(nèi)。2尿素培養(yǎng)基蛋白陳 1g氯化鈉 5g葡萄糖 1g尿素 20g磷酸二氫鉀 2g2g/L酚紅液 6m1蒸餾水 1000m1以上各成分(除尿素外)加熱溶解，調(diào)整pH至6.8，以68.95kPa滅菌l5min后，以無菌操作加入已過濾除菌的尿素溶液，混勻后分裝試管，置40C冰箱保存?zhèn)溆谩?克氏雙糖鐵復(fù)合培養(yǎng)基蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g乳糖 10g 葡萄