包頭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)之實(shí)驗(yàn)1 細(xì)菌涂片的制備和革蘭染色

1、微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)醫(yī)學(xué)技術(shù)系微生物與免疫檢驗(yàn)教研室微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的目的要求1通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證理論，使課堂效果更為生動(dòng)，學(xué)到的知識(shí)更為鞏固。2通過(guò)學(xué)生親自動(dòng)手操作，得到比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)的訓(xùn)練。3在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的過(guò)程中，幫助學(xué)生建立無(wú)菌觀念，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。4幫助學(xué)生熟悉和掌握常見(jiàn)病原微生物的生物學(xué)性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方法以及各種臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢查的基本程序。5在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立操作、獨(dú)立思考、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及注意事項(xiàng)一、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則在進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，須時(shí)刻牢記實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是病原微生物，任何疏忽都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后

2、果，不僅自身有可能被感染，而且有可能將病原微生物傳給他人。因此決不能有絲毫僥幸心理，冒任何不必要的危險(xiǎn)。迸入實(shí)驗(yàn)室時(shí)必須遵守下列規(guī)則。1進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)必須穿自大衣，離室時(shí)脫下反折，白大衣要經(jīng)常清洗消毒。2每次實(shí)驗(yàn)后均要用肥皂洗手，必要時(shí)用消毒藥水泡手。3書(shū)包、衣物等勿帶入實(shí)驗(yàn)室，必要的文具、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、筆記等帶入后，放在指定的地方。4每次實(shí)驗(yàn)后均用消毒藥水擦洗工作臺(tái)面，并用紫外線燈照射過(guò)夜。5在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吃東西、喝飲料和吸煙，不可把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭面等部位。6進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后要保持安靜，禁止高聲談話，不準(zhǔn)打鬧嘻笑。7必須按照老師指定的方法，小心地處理傳染性材料、培養(yǎng)物和污染的物質(zhì)，要

3、正確地使用存放污染器材的各種消毒容器。8接種環(huán)使用前后必須進(jìn)行燒灼滅菌。9必須小心地避免任何有菌材料的濺出，若不慎污染了工作臺(tái)、手、眼、衣服和地面等處，應(yīng)立即報(bào)告老師，以便及時(shí)作適當(dāng)處理。10培養(yǎng)物和傳染性材料須放在工作臺(tái)的安全部位，盡可能保持臺(tái)面的清潔整齊。11愛(ài)護(hù)公物，合理使用實(shí)驗(yàn)材料和器材，如不慎損壞了某些器具，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師，聽(tīng)候處理。12實(shí)驗(yàn)完畢后值日生清理臺(tái)面，將需培養(yǎng)的標(biāo)本及時(shí)放入培養(yǎng)箱，并打掃地面，關(guān)閉水、電、煤氣和門窗，帶課教師檢查合格后方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。二、實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理辦法1皮膚破損 先除去異物，用蒸餾水或生理鹽水洗凈后，涂2%紅汞或2%碘酒。2燒傷 局部涂凡士林、5

4、%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷 若為強(qiáng)酸，先用大量清水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌中和；強(qiáng)堿腐蝕傷時(shí)先以大量清水沖洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗滌中和。若受傷處是眼部，經(jīng)過(guò)上述步驟處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1一2滴。4菌液誤人口中 應(yīng)立即吐入消毒容器內(nèi)，并用1:1000高錳酸鉀溶液或3%雙氧水漱口；并根據(jù)菌種不同，服用抗菌藥物預(yù)防感染。 5菌液流灑桌面 將適量2%一3%來(lái)蘇爾或0.1%新潔兒滅倒于污染面，浸泡半小時(shí)后抹去。若手上有活菌，亦應(yīng)浸泡于上述消毒液3分鐘后，再用肥皂和水清洗。 6火警 如發(fā)生火警疫情時(shí)須沉著處理，切勿慌張，應(yīng)立即關(guān)閉電閘和煤氣閥門。如酒精、乙醚、汽油等有

5、機(jī)溶液起火，切忌用水撲救，可用沙土等撲滅火苗。三、實(shí)驗(yàn)時(shí)的注意事項(xiàng)(一)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)1在開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)以前，須仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，進(jìn)行獨(dú)立思考，并根據(jù)實(shí)際情況，作出實(shí)驗(yàn)的具體安排和打算。2.合理安排時(shí)間和實(shí)驗(yàn)材料，盡量避免出錯(cuò)，力求取得理想的結(jié)果。(二)認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)操作1認(rèn)真聽(tīng)取指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)前的講解。2細(xì)心操作，若發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，在獨(dú)立思考分析原因的基礎(chǔ)上找老師幫助。 3在自己的實(shí)驗(yàn)材料上作好標(biāo)記，包括班級(jí)、姓名、菌名、日期等。 4認(rèn)真觀察自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將其記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中（根據(jù)需要用彩色筆繪圖記錄)，并回答實(shí)驗(yàn)報(bào)告中所有的問(wèn)題。5遇到實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符的情況，應(yīng)仔細(xì)分析原因，培養(yǎng)自己獨(dú)立思考、分析

6、問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。 實(shí)驗(yàn)1 細(xì)菌涂片的制備和革蘭染色目的要求1掌握革蘭染色的原理、方法；2熟悉細(xì)菌涂片的制備。3學(xué)會(huì)在在顯微鏡下觀察和描述細(xì)菌。器材和試劑1菌種 葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌。2試劑 革蘭染色液、生理鹽水、擦鏡液。3、光學(xué)顯微鏡、載玻片步驟和方法 1涂片制備 (1)涂片:取一張潔凈載玻片，將大腸桿菌液體培養(yǎng)物直接涂布于載玻片?；蛳仍谳d玻片上放置一接種環(huán)生理鹽水，再取固體培養(yǎng)基上少許葡萄球菌或蠟樣芽孢桿菌與生理鹽水磨勻。涂成lcmlcm大小的區(qū)域，取菌量不可太多，使鹽水磨成灰白色為宜。 (2)干燥:涂片最好在室溫下自然干燥，或?qū)?biāo)本片接種面向上，置酒精燈火焰高處慢慢烘干，

7、切不可放在火焰上燒干。 (3)固定:干燥后的標(biāo)本片迅速通過(guò)火焰3次。這樣既可殺菌，又能將細(xì)菌固定在玻片上，以免玻片上的細(xì)菌在染色過(guò)程中被水沖洗掉。 2革蘭染色 （1）原理: 1)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)食量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入。2)革蘭陽(yáng)性菌等電點(diǎn)(pI23)比革蘭例性菌(pI45)低，在相同pH條件下，革蘭陽(yáng)性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固;不易脫色。3）革蘭陽(yáng)性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。

8、(2)方法:1）初染：滴加結(jié)晶紫23滴于涂布細(xì)菌處，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。2)媒染:滴加盧戈（Lugol）碘液數(shù)滴，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。3)脫色:滴加95%乙醇數(shù)滴。輕輕晃動(dòng)玻片;使玻片上流下的乙醇液無(wú)紫色為止，大約30秒左右(靈活掌握時(shí)間)，用流水沖洗，用于。 4）復(fù)染:滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液數(shù)滴，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。待標(biāo)本片自然干燥或用吸水紙吸干后，在涂菌處滴加一滴香柏油。然后用油鏡觀察；染色結(jié)果:葡萄球菌染成紫色，為革蘭陽(yáng)性菌，呈葡萄狀排列的球菌；變形桿菌染成紅色，為革蘭陰性菌，單個(gè)散在分布的桿菌。影響因素：一是操作因素，涂片太厚或太薄，菌體分散不均

9、勻，可影響染色結(jié)果。固定時(shí)應(yīng)避免菌體過(guò)分受熱。二是染液因素;所有染液應(yīng)防止水分蒸發(fā)而影響濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脫色用的乙醇以95%濃度為宜，若瓶密封不良或涂片上積水過(guò)多，可使乙醇濃度降低而增強(qiáng)脫色能力。三是細(xì)菌因素，不同時(shí)間的細(xì)菌培養(yǎng)物，染色結(jié)果有差異，如葡萄球菌幼齡菌染成紫色。而老齡菌染成紅色。細(xì)菌染色一般用18一24h的細(xì)菌培養(yǎng)物。附錄革蘭染色液配制1結(jié)晶紫染液:稱取結(jié)晶紫48g，溶于100ml95%乙醇中制成飽和液。取20ml飽和液80ml 10g/L草酸銨溶液混合即成，過(guò)濾后備用。2.盧戈(Lugol)碘液:先將2g碘化鉀溶于I0ml蒸餾水中，再加1g碘，待碘全部溶解后再加300ml蒸餾水