包頭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)醫(yī)學(xué)技術(shù)系微生物與免疫檢驗(yàn)教研室微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的目的要求1通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證理論，使課堂效果更為生動(dòng)，學(xué)到的知識(shí)更為鞏固。2通過(guò)學(xué)生親自動(dòng)手操作，得到比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)的訓(xùn)練。3在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的過(guò)程中，幫助學(xué)生建立無(wú)菌觀念，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。4幫助學(xué)生熟悉和掌握常見(jiàn)病原微生物的生物學(xué)性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方法以及各種臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢查的基本程序。5在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立操作、獨(dú)立思考、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及注意事項(xiàng)一、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則在進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，須時(shí)刻牢記實(shí)驗(yàn)的對(duì)象是病原微生物，任何疏忽都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后

2、果，不僅自身有可能被感染，而且有可能將病原微生物傳給他人。因此決不能有絲毫僥幸心理，冒任何不必要的危險(xiǎn)。迸入實(shí)驗(yàn)室時(shí)必須遵守下列規(guī)則。1進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)必須穿自大衣，離室時(shí)脫下反折，白大衣要經(jīng)常清洗消毒。2每次實(shí)驗(yàn)后均要用肥皂洗手，必要時(shí)用消毒藥水泡手。3書(shū)包、衣物等勿帶入實(shí)驗(yàn)室，必要的文具、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、筆記等帶入后，放在指定的地方。4每次實(shí)驗(yàn)后均用消毒藥水擦洗工作臺(tái)面，并用紫外線燈照射過(guò)夜。5在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吃東西、喝飲料和吸煙，不可把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭面等部位。6進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后要保持安靜，禁止高聲談話，不準(zhǔn)打鬧嘻笑。7必須按照老師指定的方法，小心地處理傳染性材料、培養(yǎng)物和污染的物質(zhì)，要

3、正確地使用存放污染器材的各種消毒容器。8接種環(huán)使用前后必須進(jìn)行燒灼滅菌。9必須小心地避免任何有菌材料的濺出，若不慎污染了工作臺(tái)、手、眼、衣服和地面等處，應(yīng)立即報(bào)告老師，以便及時(shí)作適當(dāng)處理。10培養(yǎng)物和傳染性材料須放在工作臺(tái)的安全部位，盡可能保持臺(tái)面的清潔整齊。11愛(ài)護(hù)公物，合理使用實(shí)驗(yàn)材料和器材，如不慎損壞了某些器具，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師，聽(tīng)候處理。12實(shí)驗(yàn)完畢后值日生清理臺(tái)面，將需培養(yǎng)的標(biāo)本及時(shí)放入培養(yǎng)箱，并打掃地面，關(guān)閉水、電、煤氣和門窗，帶課教師檢查合格后方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。二、實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理辦法1皮膚破損 先除去異物，用蒸餾水或生理鹽水洗凈后，涂2%紅汞或2%碘酒。2燒傷 局部涂凡士林、5

4、%鞣酸或2%苦味酸。3化學(xué)藥品腐蝕傷 若為強(qiáng)酸，先用大量清水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌中和；強(qiáng)堿腐蝕傷時(shí)先以大量清水沖洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗滌中和。若受傷處是眼部，經(jīng)過(guò)上述步驟處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1一2滴。4菌液誤人口中 應(yīng)立即吐入消毒容器內(nèi)，并用1:1000高錳酸鉀溶液或3%雙氧水漱口；并根據(jù)菌種不同，服用抗菌藥物預(yù)防感染。 5菌液流灑桌面 將適量2%一3%來(lái)蘇爾或0.1%新潔兒滅倒于污染面，浸泡半小時(shí)后抹去。若手上有活菌，亦應(yīng)浸泡于上述消毒液3分鐘后，再用肥皂和水清洗。 6火警 如發(fā)生火警疫情時(shí)須沉著處理，切勿慌張，應(yīng)立即關(guān)閉電閘和煤氣閥門。如酒精、乙醚、汽油等有

5、機(jī)溶液起火，切忌用水撲救，可用沙土等撲滅火苗。三、實(shí)驗(yàn)時(shí)的注意事項(xiàng)(一)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)1在開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)以前，須仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，進(jìn)行獨(dú)立思考，并根據(jù)實(shí)際情況，作出實(shí)驗(yàn)的具體安排和打算。2.合理安排時(shí)間和實(shí)驗(yàn)材料，盡量避免出錯(cuò)，力求取得理想的結(jié)果。(二)認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)操作1認(rèn)真聽(tīng)取指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)前的講解。2細(xì)心操作，若發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，在獨(dú)立思考分析原因的基礎(chǔ)上找老師幫助。 3在自己的實(shí)驗(yàn)材料上作好標(biāo)記，包括班級(jí)、姓名、菌名、日期等。 4認(rèn)真觀察自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將其記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中（根據(jù)需要用彩色筆繪圖記錄)，并回答實(shí)驗(yàn)報(bào)告中所有的問(wèn)題。5遇到實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符的情況，應(yīng)仔細(xì)分析原因，培養(yǎng)自己獨(dú)立思考、分析

6、問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。 實(shí)驗(yàn)1 細(xì)菌涂片的制備和革蘭染色目的要求1掌握革蘭染色的原理、方法；2熟悉細(xì)菌涂片的制備。3學(xué)會(huì)在在顯微鏡下觀察和描述細(xì)菌。器材和試劑1菌種 葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌。2試劑 革蘭染色液、生理鹽水、擦鏡液。3、光學(xué)顯微鏡、載玻片步驟和方法 1涂片制備 (1)涂片:取一張潔凈載玻片，將大腸桿菌液體培養(yǎng)物直接涂布于載玻片?；蛳仍谳d玻片上放置一接種環(huán)生理鹽水，再取固體培養(yǎng)基上少許葡萄球菌或蠟樣芽孢桿菌與生理鹽水磨勻。涂成lcmlcm大小的區(qū)域，取菌量不可太多，使鹽水磨成灰白色為宜。 (2)干燥:涂片最好在室溫下自然干燥，或?qū)?biāo)本片接種面向上，置酒精燈火焰高處慢慢烘干，

7、切不可放在火焰上燒干。 (3)固定:干燥后的標(biāo)本片迅速通過(guò)火焰3次。這樣既可殺菌，又能將細(xì)菌固定在玻片上，以免玻片上的細(xì)菌在染色過(guò)程中被水沖洗掉。 2革蘭染色 （1）原理: 1)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)食量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入。2)革蘭陽(yáng)性菌等電點(diǎn)(pI23)比革蘭例性菌(pI45)低，在相同pH條件下，革蘭陽(yáng)性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固;不易脫色。3）革蘭陽(yáng)性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。

8、(2)方法:1）初染：滴加結(jié)晶紫23滴于涂布細(xì)菌處，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。2)媒染:滴加盧戈（Lugol）碘液數(shù)滴，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。3)脫色:滴加95%乙醇數(shù)滴。輕輕晃動(dòng)玻片;使玻片上流下的乙醇液無(wú)紫色為止，大約30秒左右(靈活掌握時(shí)間)，用流水沖洗，用于。 4）復(fù)染:滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液數(shù)滴，染色lmin后用細(xì)流水沖洗，甩干。待標(biāo)本片自然干燥或用吸水紙吸干后，在涂菌處滴加一滴香柏油。然后用油鏡觀察；染色結(jié)果:葡萄球菌染成紫色，為革蘭陽(yáng)性菌，呈葡萄狀排列的球菌；變形桿菌染成紅色，為革蘭陰性菌，單個(gè)散在分布的桿菌。影響因素：一是操作因素，涂片太厚或太薄，菌體分散不均

9、勻，可影響染色結(jié)果。固定時(shí)應(yīng)避免菌體過(guò)分受熱。二是染液因素;所有染液應(yīng)防止水分蒸發(fā)而影響濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脫色用的乙醇以95%濃度為宜，若瓶密封不良或涂片上積水過(guò)多，可使乙醇濃度降低而增強(qiáng)脫色能力。三是細(xì)菌因素，不同時(shí)間的細(xì)菌培養(yǎng)物，染色結(jié)果有差異，如葡萄球菌幼齡菌染成紫色。而老齡菌染成紅色。細(xì)菌染色一般用18一24h的細(xì)菌培養(yǎng)物。附錄革蘭染色液配制1結(jié)晶紫染液:稱取結(jié)晶紫48g，溶于100ml95%乙醇中制成飽和液。取20ml飽和液80ml 10g/L草酸銨溶液混合即成，過(guò)濾后備用。2.盧戈(Lugol)碘液:先將2g碘化鉀溶于I0ml蒸餾水中，再加1g碘，

10、待碘全部溶解后再加300ml蒸餾水即成。3.95%乙醇或丙酮乙醇溶液(70m195%乙醇加3Oml丙酮)。4.稀釋石炭酸復(fù)紅液:稱取4g堿性復(fù)紅溶解于100m195%乙醇內(nèi)，即成堿性復(fù)紅飽和酒精溶液，吸取lOml飽和液和90m50g/L石炭酸水溶液混勻即成石炭酸復(fù)紅液。量取10ml石炭酸復(fù)紅液加90ml蒸餾水混勻即成。 實(shí)驗(yàn)2 培養(yǎng)基制備技術(shù)目的要求1. 掌握培養(yǎng)基制備的基本過(guò)程。 2熟悉常用培養(yǎng)基的原理、種類及其用途。器材和試劑1.試劑 牛肉膏、氯化鈉、蛋白陳、瓊脂粉、抗凝綿羊血、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、葡萄糖、乳糖、甘露醇、檸檬酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫銨、硝酸鉀、硫代硫酸鈉、檸檬酸鐵、硫酸亞

11、鐵、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、中性紅、酚紅、lmol/LNaOH、lmol/LHCl。2.器材 5OOml錐形瓶、5OOml量筒、lOml、5ml和1ml吸管、精密pH試紙、華氏試管、硅膠塞、天平、高壓蒸氣鍋、血清凝固器、脫脂棉、濾紙、漏斗、無(wú)菌平皿。步驟和方法1.培養(yǎng)基制備的基本過(guò)程 包括調(diào)配成分、溶解、矯正pH、過(guò)濾澄清、分裝、滅菌、質(zhì)量檢查和保存。(1)調(diào)配成分:按培養(yǎng)基組成準(zhǔn)確稱取各成分用量，放人錐形瓶或大容量燒瓶中，加一定量蒸餾水，使其充分混合。應(yīng)注意染料、膽鹽和指示劑等應(yīng)在矯正pH后加入。(2)溶解:將調(diào)配好的混合物在沸水浴或流動(dòng)蒸氣滅菌器中，使其完全溶解。不可將培養(yǎng)基裝在銅鐵

12、容器中加熱，因培養(yǎng)基中含銅量超過(guò)0.3mg/L時(shí)，細(xì)菌不易生長(zhǎng)；含鐵量超過(guò)0.14mg/L時(shí)可抑制細(xì)菌毒素的產(chǎn)生。(3)矯正pH:一般將培養(yǎng)基的pH凋至7.27.6左右。經(jīng)高壓滅菌后其pH可發(fā)生0.10.2變動(dòng)。若用NaOH矯正，高壓滅菌后pH下降0.l0.2；若用NaCO3矯正，高壓滅菌后pH升高0.1一0.2。(4)濾過(guò)澄清:自配的培養(yǎng)基通常有一些混濁或沉淀，需濾過(guò)澄清后方可使用。液體或半固體培養(yǎng)基常用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基在熔化后趁熱以絨布或雙層紗布加脫脂棉過(guò)濾。(5)分裝:1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基:一般分裝于錐形瓶滅菌后備用，以便隨時(shí)分裝傾注平板或配制營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等；2）瓊脂斜面:通常在熔化后分裝于

13、試管，量約為試管高度的1/41/3，加塞后滅菌，趁熱擺成斜面，斜面長(zhǎng)度約為試管長(zhǎng)度的2/3，且保持試管下端有l(wèi)cm柱高；3）半固體培養(yǎng)基:分裝量為試管容量的1/41/3，加塞滅菌后趁熱直立凝固；4）瓊脂高層培養(yǎng)基:分裝量為管長(zhǎng)的2/3(接種厭氧菌用)，滅菌后趁熱直立凝固；5）瓊脂平板無(wú)菌分注:先將滅菌瓊脂熔化后冷卻至5O0C左右，以無(wú)菌操作傾注于滅菌平皿內(nèi)(內(nèi)徑90mm的平皿約1315ml)，水平旋轉(zhuǎn)平皿，待瓊脂凝固后將平皿翻轉(zhuǎn)，置40C保存?zhèn)溆谩?6)滅菌:1)由耐熱物質(zhì)配制成的培養(yǎng)基(如普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂等)常用高壓蒸氣滅菌，條件為103.43kPa，l52Omin；含糖培養(yǎng)基以68.95kPa

14、，l0l5min為宜，以免破壞糖類物質(zhì)。2)不耐高熱的物質(zhì)配制成的培養(yǎng)基，如糖類、明膠和牛乳等常用流通蒸氣滅菌，方法是加溫80100C3Omin，每天一次，連續(xù)3天。3)富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基(如含血清或雞蛋清的培養(yǎng)基需用血清凝固器滅菌，方法是將配制好的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)(一般做成斜面)，第一天750C3Omin，第二天800C3Omin，第三天850C3Omin。在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基取出置350C孵箱中過(guò)夜。(7)質(zhì)量檢驗(yàn):需做無(wú)菌試驗(yàn)和效果試驗(yàn)。1）無(wú)菌試驗(yàn):將滅菌后的培養(yǎng)基置350C孵育24h，無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)為合格；2）效果試驗(yàn):將已知的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株接種于待檢培養(yǎng)基中。檢查細(xì)菌的生

15、長(zhǎng)繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果相符合。(8)保存:制備好的培養(yǎng)基應(yīng)注明名稱、制作日期，如瓊脂平板應(yīng)將底(帶培養(yǎng)基的平面)朝上，蓋在下;用牛皮紙包裹或裝于保鮮袋內(nèi)，以減少水分蒸發(fā)。液體培養(yǎng)基應(yīng)直立放置。制作好的培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處或40C冰箱。2.常用培養(yǎng)基的制備(1)肉湯:將新鮮牛肉(去除筋和脂肪)5009絞碎加水。40C過(guò)夜。加熱45500Clh，用數(shù)層紗布或?yàn)V紙過(guò)濾，加水補(bǔ)充至1OOOml。再加入蛋白胨lOg和NaCl5g加熱熔化，冷至40500C。矯王pH至7.4一7.6。分裝于錐形瓶或試管內(nèi)，加塞后高壓蒸氣滅菌；103.43kPa 2Omin。冷后放陰暗處或40C備用。供作無(wú)糖基

16、礎(chǔ)培養(yǎng)基用。適用于營(yíng)養(yǎng)要求一般的細(xì)菌。(2)肉膏湯:將牛肉膏3g、蛋白陳lOg。NaCl5g、蒸餾水l0OOml置錐形瓶或大容量燒杯中，加熱熔化后矯證pH至7.6，煮沸35min，過(guò)濾后分裝，高壓滅菌103.43kPa2Omin后。40C貯存。供作無(wú)糖培養(yǎng)基用，適廟營(yíng)養(yǎng)要求一般的細(xì)菌。(3)普通瓊脂(營(yíng)養(yǎng)瓊脂):將肉湯或肉膏湯1000ml、瓊脂20g混合，加熱熔化，調(diào)pH 至7.6，趁熱分裝試管或錐形瓶，加塞后高壓滅菌103.43kPa 2Omin,取出試管擺成斜面，待瓊脂凝固后即成瓊脂斜面；錐形瓶中的瓊脂冷至5O0C左右傾注滅菌平皿，凝固后即成普通瓊脂平板。供一般細(xì)菌培養(yǎng)用，可作無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)

17、基。（4）半固體培養(yǎng)基:將肉湯或肉湯膏1000ml(已調(diào)pH至7.6，下同)，瓊脂5g混合,加熱熔化后凋pH至7.6，分裝小試管，每管2ml，加塞，高壓滅菌103.43kPa 2Omin，取出后直立待凝即成?？勺饔^察細(xì)菌動(dòng)力和保存菌種用。(5)血液和巧克力瓊脂培養(yǎng)基:將滅菌后的普通瓊脂培養(yǎng)基(pH7.6)加熱熔化，冷至5O0C左右。以無(wú)菌操作加入無(wú)菌脫纖維羊血(臨用前置370C水浴預(yù)溫30min)。輕輕搖勻(避免產(chǎn)生氣泡)，分裝于無(wú)菌試管和平皿內(nèi)，凝固后即成血液瓊脂斜面和血液瓊脂平板。 若在瓊脂溫度800C時(shí)加入血液。并在800C水浴中搖勻3Omin，傾注平板后即成為巧克力瓊脂平板。血液瓊脂用

18、于分離培養(yǎng)和保存營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌；巧克力瓊脂主要用于分離培養(yǎng)奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、肺炎鏈球菌等苛養(yǎng)菌。注意事項(xiàng)1培養(yǎng)基的澄清 如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法。其方法為:取一個(gè)蛋的卵蛋白加水2Oml，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入l0OOml液體或熔化的固體培養(yǎng)基中混勻。然后在流動(dòng)蒸氣中加熱306Omin，使培養(yǎng)基中不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后以紗布夾脫脂棉(固體培養(yǎng)基)或?yàn)V紙(液體或半固體培養(yǎng)基)過(guò)濾即可。 2平板的澆注 傾注培養(yǎng)基時(shí)，切勿將皿蓋全部開(kāi)啟，以免空氣中塵埃及細(xì)菌等微生物的落入。 傾注時(shí)若培養(yǎng)基溫度過(guò)高，冷凝水過(guò)多，易致污染。不易分離到菌落；若溫度過(guò)低，部分瓊脂凝固，傾

19、注平板表面高低不平。可在無(wú)菌室或接種罩內(nèi)傾注培養(yǎng)基后。將皿蓋稍開(kāi)一縫隙，在紫外燈照射下待凝。這樣便于蒸氣散發(fā)，減少平板內(nèi)冷凝水。傾注血液瓊脂時(shí)，由于加血時(shí)瓊脂表面容易產(chǎn)生氣泡，傾注時(shí)應(yīng)適時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)錐形瓶，使氣泡附于瓶壁，以減少血平板表面的氣泡。實(shí)驗(yàn)3 空氣中細(xì)菌的檢測(cè)與消毒劑消毒效果評(píng)價(jià)目的要求1.掌握沉降平板法的原理。2.掌握消毒效果的評(píng)價(jià)方法，了解常用消毒劑的使用范圍和適用濃度。器材和試劑1培養(yǎng)基及試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、50液態(tài)滅菌普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、1：500的84消毒液、無(wú)菌生理鹽水2其他 滅菌100ML三角燒瓶（含玻璃珠）、滅菌平皿、無(wú)菌1ml、10ml吸管、滅菌試管、消毒棉簽、滅菌

20、55空心規(guī)格板、火柴、蠟筆、試管架、噴霧器、酒精燈、恒溫水浴箱。步驟和方法一、空氣中細(xì)菌的檢測(cè)1.沉降平板法的原理：利用微生物氣溶膠粒子受重力作用沉降到敞開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，對(duì)空氣中細(xì)菌進(jìn)行采樣計(jì)數(shù)。2.方法：1）于室內(nèi)四角及中央各放營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（或血瓊脂平板）一個(gè)，于同一時(shí)間揭開(kāi)皿蓋，暴露20分鐘。置370C孵育24h。2）計(jì)數(shù)5各平板菌落總數(shù)并算出每立方米空氣中所含細(xì)菌數(shù)。參考表1作出評(píng)價(jià)。 50000N每立方米空氣中的細(xì)菌數(shù)= AtA:所用平皿面積（cm2）。T：暴露于空氣的時(shí)間（分鐘）。N：培養(yǎng)后，平皿上菌落數(shù)。表1 居室內(nèi)空氣衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn) 夏季標(biāo)準(zhǔn)（個(gè)/m3） 冬季標(biāo)準(zhǔn)（個(gè)

21、/m3）空氣評(píng)價(jià) 細(xì)菌總數(shù) 綠色和溶血性鏈球菌 細(xì)菌總數(shù) 綠色和溶血性鏈球菌清潔空氣 1500 16 4500 24污染空氣 1500 36 7000 36 二、物體表面消毒及效果評(píng)價(jià)：1.消毒前的采樣：選擇可能被污染的對(duì)象（如桌面、墻面）放上滅菌55空心規(guī)格板，取一支無(wú)菌棉簽用生理鹽水浸濕，在規(guī)格板的空心處，有順序的涂擦，然后將棉簽放入盛有25ml生理鹽水的三角燒瓶中，制成原液，充分混勻，備用。 2.消毒后的采樣：選擇與消毒前污染程度差不多的部位，用裝有84消毒液的噴霧器噴霧消毒，待干（20分鐘左右），用上述同樣方法采樣，并制成原液備用。3.將消毒前后的樣品用無(wú)菌生理鹽水做1：10、1：10

22、0、1：1000、1：10000的倍比稀釋4用無(wú)菌操作的方法取不同稀釋度液體1ml注于直徑90mm的無(wú)菌平皿，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行樣，做一個(gè)空白對(duì)照，然后加入已融化并冷卻至50的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15ml ,立即在平面上向同一方向平穩(wěn)轉(zhuǎn)動(dòng)，使之混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。1ml標(biāo)本中活菌數(shù)=全平板cfu稀釋倍數(shù)5.菌落計(jì)數(shù)方法：1）平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平板上的菌落數(shù)后，應(yīng)求出同一稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計(jì)算時(shí)應(yīng)用。2）在求同一稀釋度的平均數(shù)時(shí)，若其中一個(gè)平板有較大片狀菌落時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。3）若片狀菌落不足平

23、板一半，而其余中菌落數(shù)分布均勻，則計(jì)數(shù)后乘2代表全平板菌落數(shù)，然后再求該稀釋度的平均菌落數(shù)。6.不同稀釋度平均菌落數(shù)的確認(rèn)：1）應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表例1）。2）若有兩個(gè)稀釋度其生長(zhǎng)之菌落數(shù)均在30-300，則應(yīng)視二者之比如何來(lái)決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告平均數(shù)。 若其比值大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字（見(jiàn)表例2和3）。3）若所有平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表例4）。4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表例5）。5） 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-

24、300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之 （見(jiàn)表例6）。6）若所有稀釋度的菌落數(shù)均不可計(jì)數(shù)，則以最高稀釋倍數(shù)無(wú)法計(jì)數(shù)報(bào)告之（例7）。表2 稀釋度選擇及細(xì)菌總數(shù)報(bào)告方法例子 稀釋液及菌落數(shù) 相鄰稀釋度菌落數(shù)在 菌落總數(shù) 報(bào)告方式 10-1 10-2 10-3 30-300間的比值 （cfu/ml） （cfu/ml）1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.6*1042 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或3.8*1043 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或2.7*

25、1044 不可計(jì) 4，650 513 513，000 510，000或5.1*1055 27 11 5 270 270或2.7*1026 不可計(jì) 305 12 30，500 31，000或3.1*1047 不可計(jì) 不可計(jì) 不可計(jì) 10-3無(wú)法計(jì)數(shù)7)所有稀釋度均未見(jiàn)菌落：則報(bào)告小于10，而不報(bào)告0.6.菌落數(shù)報(bào)告方式： = 1 * GB3 菌落數(shù)100時(shí)按實(shí)數(shù)報(bào)告，未見(jiàn)菌落數(shù)者報(bào)告為小于10. = 2 * GB3 菌落數(shù)100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入法計(jì)算，也用10的指數(shù)表示。 = 3 * GB3 在報(bào)告菌落數(shù)為“無(wú)法計(jì)數(shù)”時(shí)，應(yīng)注明待檢標(biāo)本的稀釋倍數(shù)。具體報(bào)

26、告方式見(jiàn)表。根據(jù)消毒前后的菌落數(shù)，求出消毒前后細(xì)菌減少的百分比。 消毒前菌落數(shù)-消毒后菌落數(shù)消毒前后細(xì)菌減少的百分比= 100% 消毒前菌落數(shù)根據(jù)計(jì)算結(jié)果，評(píng)價(jià)該次消毒的效果。一般以90%以上為很好，80%為良好，70%為較好，60%為一般，60%以下為不合格。實(shí)驗(yàn)4 肉中沙門氏菌的檢測(cè)目的要求掌握沙門氏菌的形態(tài)、染色特性、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)及檢驗(yàn)程序掌握沙門氏菌的血清學(xué)鑒定方法器材和試劑1標(biāo)本 變質(zhì)肉2培養(yǎng)基及試劑 緩沖蛋白胨水、氯化鎂孔雀綠増菌液、亞硫酸鹽胱氨酸増菌液、伊紅美蘭瓊脂平板、SS瓊脂平板、動(dòng)力吲哚尿素培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、甲

27、基紅試劑、VP試劑、硝酸鹽培養(yǎng)基及A、B試劑、沙門菌O及H因子單價(jià)血清、3%過(guò)氧化氫溶液。3其他 高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、生理鹽水。步驟和方法標(biāo)本采集及運(yùn)送：（1）采樣是食品檢驗(yàn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，所采樣品應(yīng)具有代表性。（2）采樣必須用滅菌器具，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。（3）樣品可分為大、中和小樣三類。大樣指一整批食品；中樣指從樣品各部分隨機(jī)抽的混合樣品，以200g為準(zhǔn)；小樣指做分析用的檢樣，以25g為準(zhǔn)。食品微生物檢驗(yàn)一般取小樣。根據(jù)食品的種類采取不同的 采樣方法。如固體粉末和液體混合后取樣；袋、罐、瓶裝食品應(yīng)取未開(kāi)封的完整體；冷凍食品在冷凍狀態(tài)取樣，非冷凍食品需在

28、0-5保存。（5）樣品采集后應(yīng)立即送檢，一般不應(yīng)超過(guò)3h。2、檢驗(yàn)方法：食品中沙門菌的檢驗(yàn)方法有四個(gè)基本步驟：即前增菌或選擇性增菌；選擇性平板分離沙門菌；生化試驗(yàn)鑒定到屬；血清學(xué)分型鑒定。（1）增菌培養(yǎng)：將標(biāo)本25g加入裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣口瓶中。固體食品用均質(zhì)器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎；粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于361培養(yǎng)4h，移取10ml，轉(zhuǎn)接種在100ml氯化鎂孔雀綠増菌液或四硫酸鈉煌綠増菌液內(nèi)，361培養(yǎng)18-24h.鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必進(jìn)行前增菌。直接取樣25g（25ml）加入滅菌生理鹽水

29、25ml，按前述方法制成勻液，取25ml接種于100m亞硫酸鹽胱氨酸増菌液內(nèi)，361培養(yǎng)18-24h.（2）分離：取増菌液分別接種到伊紅美蘭瓊脂平板、SS瓊脂平板，361培養(yǎng)18-24h.（3）菌落觀察：由于本菌不分解乳糖并產(chǎn)堿，所以在SS瓊脂和麥康凱平板上形成無(wú)色或淡黃色、半透明、圓形、凸起、邊緣整齊的光滑濕潤(rùn)小菌落。產(chǎn)H2S的菌株可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。（4）生化反應(yīng)1）氧化酶試驗(yàn)：取氧化酶紙片，刮取SS瓊脂上的較大的菌落，觀察紙片顏色的變化，呈藍(lán)紫色為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮詾殛幮裕ㄈ缭噭辂}酸二甲基對(duì)苯二胺，陽(yáng)性者則為紅色）。沙門氏菌氧化酶試驗(yàn)為陰性。2）初步試驗(yàn)鑒定：將沙門氏

30、菌分別接種在克氏雙糖鐵瓊脂、動(dòng)力吲哚尿素培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水管和硝酸鹽培養(yǎng)基管中，經(jīng)35孵育18-24h后，加入相應(yīng)試劑，觀察結(jié)果。同時(shí)做觸酶試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1表1 沙門氏菌的基本生化反應(yīng)KIA MIU 硝酸鹽 氧化酶 觸酶 還原斜面 底層 產(chǎn)氣 H2S 動(dòng)力 吲哚 脲酶?jìng)抽T菌 K A - +/- + - - - + +甲型副傷寒 K A + -/+ + - - - + +乙型副傷寒 K A + + + - - - + +氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。甲基紅試驗(yàn)的原理

31、：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸等，使pH降至45以下，加入甲基紅試劑則呈紅色為陽(yáng)性。若分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，則pH 62以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。V-P試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧氧化為二乙酰，進(jìn)而與胍基起作用生成紅色化合物，則為V-P試驗(yàn)陽(yáng)性動(dòng)力靛基質(zhì)尿素酶培養(yǎng)基原理：制備的動(dòng)力靛基質(zhì)尿素酶培養(yǎng)基除加有200g/L尿素和酚紅指示劑外，其蛋白胨較原克利斯頓森尿素培養(yǎng)基提高10倍，并制成半固體培養(yǎng)基，以便觀察細(xì)菌的動(dòng)力。由于蛋白胨中含有豐富的色氨酸，產(chǎn)生色氨酸酶的細(xì)菌可以水解色氨酸形成靛基質(zhì)，當(dāng)加入靛基質(zhì)試劑后形

32、成玫瑰吲哚。產(chǎn)生玫瑰紅色為陽(yáng)性。產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將培養(yǎng)基中的尿素分解產(chǎn)堿，使酚紅指示劑顯桃紅色。因此，該試驗(yàn)可同時(shí)觀察細(xì)菌動(dòng)力、靛基質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)菌分解尿素的活性，故簡(jiǎn)稱為MIU試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過(guò)程：一是在合成過(guò)程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。但硝酸鹽還原的過(guò)程因細(xì)菌不同而異，有的細(xì)菌僅使硝酸

33、鹽還原為亞硝酸鹽有的細(xì)菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮。（5）沙門氏菌的血清學(xué)分型鑒定：待檢菌形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)疑為沙門菌，可選用沙門菌的多價(jià)診斷血清進(jìn)行玻片凝集。首先用A-F群多價(jià)診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，在試驗(yàn)時(shí)應(yīng)以生理鹽水作對(duì)照。血清凝集試驗(yàn)在5min內(nèi)不出現(xiàn)凝集者可確定為陰性。但若生化反應(yīng)比較典型，應(yīng)考慮選用Vi凝集試驗(yàn)（傷寒和丙型副傷寒沙門菌具有Vi抗原），若凝集，則用無(wú)菌生理鹽水將菌洗下，制成濃厚的懸液，100水浴15min（破壞Vi抗原），再與A-F群多價(jià)“O”診斷血清做凝集試驗(yàn)。若與A-F群多價(jià)“O”血清發(fā)生凝集，應(yīng)再與沙門菌”O(jiān)”單價(jià)

34、因子血清分別作玻片凝集試驗(yàn)，以確定該菌株屬于的群別。一般先選用本地區(qū)檢出率最高血清型的相應(yīng)血清作玻片凝集反應(yīng)。若已確定是何種血清型沙門菌，再分別用H因子血清先檢查第一相抗原，然后檢查第二相抗原，最后確定該菌種屬于哪一型沙門菌。結(jié)果報(bào)告：綜合上述生化和血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)食品中沙門菌做出菌型判斷，并報(bào)告結(jié)果。注意事項(xiàng)：1、嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范。2、采樣注意代表性、采樣后立即送檢。3、挑選典型菌落進(jìn)行生化反應(yīng)。4、血清學(xué)試驗(yàn)中取菌量要適宜，保證抗原-抗體的最佳比例。附錄1糖發(fā)酵培養(yǎng)基肉湯膏（pH7.47.6） 100ml糖 0.51g16g/L溴甲酚紫乙醇溶液 0.1m1將上述成分溶解后，分裝試管

35、。經(jīng)55.16kPa高壓滅菌l5min。如需觀察產(chǎn)氣，可于每試管中加小倒管一支；如加入的糖為雙糖必須滅菌后加入培養(yǎng)基內(nèi)。2尿素培養(yǎng)基蛋白陳 1g氯化鈉 5g葡萄糖 1g尿素 20g磷酸二氫鉀 2g2g/L酚紅液 6m1蒸餾水 1000m1以上各成分(除尿素外)加熱溶解，調(diào)整pH至6.8，以68.95kPa滅菌l5min后，以無(wú)菌操作加入已過(guò)濾除菌的尿素溶液，混勻后分裝試管，置40C冰箱保存?zhèn)溆谩?克氏雙糖鐵復(fù)合培養(yǎng)基蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g乳糖 10g 葡萄糖 1g 氯化鈉 5g檸檬酸鐵鉸 0.5g 硫代硫酸鈉 0.5g 瓊脂 1215g 49/酚紅水溶液 6m1 蒸餾水 100

36、0m1 除糖類和酚紅外，其他各成分均加熱溶解，矯正pH至7.47.6，再加入糖類和酚紅水溶液，混勻，過(guò)濾分裝，每管3m1，68.95kPa滅菌l5min，取出后制成斜面。實(shí)驗(yàn)5 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)目的要求掌握金黃色葡萄球菌檢測(cè)的基本程序熟悉金黃色葡萄球菌檢測(cè)的基本方法與步驟。器材和試劑1樣品 可疑奶粉 2培養(yǎng)基及試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板、卻普曼瓊脂平板、7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵管（微）、甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂平板、葡萄糖微量發(fā)酵管、新鮮抗凝血漿（人或兔）。3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、檢驗(yàn)程序1：10奶粉稀釋液 7.5%

37、NaCl肉湯增菌 直接計(jì)數(shù) 血平板和卻普曼瓊脂平板 觀察菌落特征，革蘭染色鏡檢 血漿凝固酶試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn) 耐熱核酸酶試驗(yàn)、腸毒素測(cè)定等二、檢驗(yàn)方法1、樣品的采取和送檢（1）散裝或大型包裝的乳品檢樣：用滅菌刀、勺取樣。在移采另一件樣品前，應(yīng)將用過(guò)的刀、勺清洗滅菌。采樣時(shí)應(yīng)注意不同的部位、使樣品有代表性。樣品仿品放入滅菌器內(nèi)，及時(shí)送檢。(2)小型包裝的乳品檢樣：應(yīng)采取整件包裝，奶粉1瓶或1包。采樣時(shí)應(yīng)注意包裝的完整性。（3）成批產(chǎn)品質(zhì)量的檢樣：采樣量一般以1的比率抽取，應(yīng)注意代表性，不足千件者抽取1件。2、檢樣處理（1）罐（瓶）裝乳粉：將罐或瓶表面先用溫水洗凈，再用點(diǎn)燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上表

38、面，然后用滅菌的開(kāi)罐器打開(kāi)罐或瓶面，以無(wú)菌手續(xù)稱取25g檢樣，放入裝有玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，然后徐徐加入225ml溫?zé)岬臏缇睇}水，（先加少許使乳粉調(diào)成糊狀，再全部加入，以免奶粉結(jié)塊）。振搖均勻，使充分溶解后即為1：10稀釋液。（2）袋裝乳粉：可用75%的酒精棉球擦拭消毒袋口后，以無(wú)菌手續(xù)開(kāi)封取樣。以后操作同罐（瓶）裝乳粉。增菌培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取上述稀釋液5ml加入7.5%NaCl肉湯或胰酪胨大豆肉湯45ml培養(yǎng)基內(nèi)，置37溫箱培養(yǎng)24h。再肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長(zhǎng)。分離培養(yǎng)：直接取可疑奶粉或增菌培養(yǎng)物劃線接種至血平板或卻普曼瓊脂平板，經(jīng)37孵育18

39、-24h后觀察菌落。取可疑菌落做革蘭染色鏡檢。根據(jù)形態(tài)染色特性，然后進(jìn)一步做生化反應(yīng)鑒定。生化反應(yīng)（1）觸酶試驗(yàn)：本試驗(yàn)用于初步區(qū)別葡萄球菌和鏈球菌，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。（2）血漿凝固酶試驗(yàn)：1）原理：致病性葡萄球菌產(chǎn)生的一種能凝固人和兔血漿的蛋白質(zhì)?？煞譃閮煞N： 結(jié)合型血漿凝固酶直接作用于血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細(xì)菌表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測(cè)出。 另一種是分泌至菌體外的游離型凝固酶，作用類似凝血酶原，可被人或兔血漿中協(xié)同因子激活變成凝固酶樣物質(zhì)，使液態(tài)的纖維蛋白原變成固態(tài)的纖維蛋白，進(jìn)而使血漿凝固，可用試管法測(cè)出。2）方法：玻片法：取人或兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的

40、破片上，挑取可疑菌落分別與血漿和鹽水混合；試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿和生理鹽水，挑取被檢菌分別加入血漿中并混勻，于370C水浴3-4小時(shí)3）結(jié)果判斷、解釋和報(bào)告：玻片法以血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性，反之，細(xì)菌在血漿中呈均勻混濁則為陰性；試管法以血漿凝固判為陽(yáng)性，反之，試管內(nèi)血漿不凝固仍流動(dòng)的，則為陰性。若陰性，應(yīng)繼續(xù)觀察到24h，仍不凝固者為陰性。4）臨床意義：血漿凝固酶試驗(yàn)被廣泛用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其它葡萄球菌，常作為鑒定葡萄球菌致病性的主要依據(jù)之一，金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（3）耐熱核酸酶測(cè)定：1）原理：致病性葡

41、萄球菌能產(chǎn)生一種耐熱核酸酶，能將DNA水解成由幾個(gè)單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。水解后的DNA短鏈與甲苯胺藍(lán)結(jié)合，使甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂顯示粉紅色。非致病性葡萄球菌雖然也能產(chǎn)生DNA酶，但不耐熱。因此耐熱DNA酶測(cè)定可作為鑒定致病性葡萄球菌的重要指標(biāo)。2）方法：玻片法：取融化好的甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂3ml均勻澆在載玻片上，待瓊脂凝固后打上68個(gè)孔徑25mm的小孔，各孔分別加1滴經(jīng)沸水浴3min處理過(guò)的待檢菌和陽(yáng)性、陰性對(duì)照葡萄球菌培養(yǎng)物，37孵育3h，觀察有無(wú)粉紅色圈及其大小。平板法：在已形成葡萄球菌菌落的 平板上挑選待檢菌并做好標(biāo)記，置60烤箱加熱2h（使不耐熱的DNA酶滅活），取出后平板上傾注10

42、ml已預(yù)先融化的甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂，37孵育3h，觀察菌落周圍有無(wú)粉紅色圈。劃線刺中法：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種劃線刺中于甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂平板上，371培養(yǎng)24小時(shí)，觀察刺中線周圍有無(wú)淡粉紅色出現(xiàn)。3）結(jié)果判斷、解釋和報(bào)告：玻片法孔外出現(xiàn)粉紅色圈的為陽(yáng)性；平板法葡萄球菌菌落周圍有無(wú)粉紅色圈的為陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（4）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：1）原理：致病性葡萄球菌多能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。2)方法：將待檢菌分別接種于兩支甘露醇發(fā)酵管，其中一支滴加滅菌的液體石蠟（不低于1cm ）, 35培養(yǎng)1824小時(shí)后觀察結(jié)果。3

43、）結(jié)果判斷、解釋和報(bào)告：兩支培養(yǎng)基均混濁，由紫色變?yōu)辄S色為甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，兩支都為紫色或只有一支變?yōu)辄S色為陰性。金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（5）腸毒素測(cè)定：1）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌腸毒素與腸毒素抗血清在瓊脂板上可形成白色沉淀線。2）ELISA法：利用雙抗體夾心法，測(cè)定標(biāo)本中金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素。3)動(dòng)物試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素是一種耐熱性蛋白質(zhì)，通常在10030min不被破壞，注入動(dòng)物后可產(chǎn)生食物中毒的癥狀。結(jié)果報(bào)告：綜合上述試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)食品是否污染金黃色葡萄球菌做出判斷，并報(bào)告結(jié)果。實(shí)驗(yàn)6 蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)目的要求掌握蠟樣芽孢桿菌檢

44、測(cè)的主要步驟和方法。掌握蠟樣芽孢桿菌菌落的觀察方法和生化反應(yīng)結(jié)果的判斷。器材和試劑1樣本：變質(zhì)剩米飯2培養(yǎng)基及試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板、卵黃瓊脂平板、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露醇微量發(fā)酵管、蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基。吲哚試劑、VP試劑、鞭毛染色液、3%過(guò)氧化氫3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法1.樣品的保存與送檢：待檢樣品應(yīng)保持在6以下運(yùn)送并盡可能不使其冷凍。送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)保存于4并盡快進(jìn)行檢驗(yàn)。如在4d內(nèi)不能進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)將樣品儲(chǔ)存在-20，檢驗(yàn)前再于室溫下解凍，脫水食品可在室溫下送檢和儲(chǔ)存。2.樣

45、品的制備（1）用無(wú)菌操作的方法稱取可疑食品50g放于無(wú)菌均質(zhì)杯中。（2）加450ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液于均質(zhì)杯中以18000-20000r/min離心，2min，制成1：10樣品稀釋液。（3）取1：10稀釋液10ml加到含有90ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的稀釋瓶中，充分混勻制成1：100的稀釋液。（4）每個(gè)稀釋度換用1支10ml滅菌吸管，按上述操作程序進(jìn)行10倍遞增稀釋直至10-6.3活菌計(jì)數(shù)取各稀釋度的懸液0.1ml接種于卵黃瓊脂平板上。以滅菌L形玻璃棒均勻涂布于整個(gè)瓊脂表面，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)卵黃瓊脂平板。置35培養(yǎng)6小時(shí)，本菌在此平板上產(chǎn)生乳光反應(yīng)，易于識(shí)別。選取菌落數(shù)在30左右的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

46、計(jì)數(shù)后從中挑取5個(gè)可疑菌落進(jìn)一步做證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計(jì)算出該平皿內(nèi)的蠟樣芽孢數(shù)，然后乘上稀釋倍數(shù)即得每克樣品中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)。如10-4稀釋液的 平皿內(nèi)菌落數(shù)為25個(gè)，取5個(gè)鑒定，其中4個(gè)證實(shí)為該菌，則1克檢樣中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)為：254510410=21062)傾注平板計(jì)數(shù)法：同消毒滅菌。一般認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌每毫升或每克食物中的活菌數(shù)大于105時(shí)，即有可能發(fā)生食物中毒。4.形態(tài)觀察：將平板上的可疑菌落進(jìn)行涂片革蘭染色可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性大桿菌、兩端稍鈍圓、多數(shù)呈鏈狀排列，少數(shù)有單個(gè)、成雙或不規(guī)則排列。卵圓形的 芽孢位于菌體中央或次極端，不突出菌體。鞭毛染色可見(jiàn)有周鞭毛，無(wú)莢

47、膜。5.菌落觀察：將可疑食物或培養(yǎng)物加適量生理鹽水研磨后劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上，經(jīng)35孵育18-24h后觀察菌落。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、凸起、表面粗糙、邊緣呈擴(kuò)散狀、不透明的菌落，應(yīng)光看呈白蠟狀；在血瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落呈淺灰色似毛玻璃狀外觀，并有明顯的草綠色或透明的溶血環(huán)。在卵黃瓊脂平板上由于產(chǎn)生卵磷脂酶分解培養(yǎng)基中的卵磷脂，菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)。6.生化反應(yīng)（1）碳水化合物試驗(yàn)：將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上的單個(gè)可疑菌落分別接種到葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、微量發(fā)酵管和葡萄糖蛋白胨水，枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，35孵育18-24h后觀察結(jié)果。該菌能分解葡萄

48、糖、麥芽糖、蔗糖，不分解乳糖、甘露醇、木糖，不產(chǎn)生吲哚，觸酶、VP試驗(yàn)陽(yáng)性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性。（2）含氮化合物試驗(yàn)：將可疑菌落分別接種到明膠培養(yǎng)基，經(jīng)35孵育18-24h后觀察結(jié)果。該菌可液化明膠。（3）乳光反應(yīng)：1）原理：本菌能產(chǎn)生卵磷脂酶，在有Ca2+存在時(shí)，能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和水溶性磷酸膽堿，故在菌落周圍出現(xiàn)乳白色混濁環(huán)，稱乳光反應(yīng)或卵黃反應(yīng)。2）方法：用接種針挑取可以菌落點(diǎn)種在10%卵黃瓊脂平板上，35孵育3h。3）結(jié)果和意義：3h無(wú)菌落生長(zhǎng)，但在點(diǎn)種處可出現(xiàn)混濁環(huán)，6h后混濁環(huán)直徑可擴(kuò)大至5-6mm。用于測(cè)定細(xì)菌能否產(chǎn)生卵磷脂酶，也可以此來(lái)計(jì)數(shù)菌落。（4）觸酶試驗(yàn)：陽(yáng)性

49、7.腸毒素測(cè)定：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本菌與枯草芽孢桿菌的不同點(diǎn)是不分解木糖，與炭疽芽孢桿菌的不同點(diǎn)是能迅速液化明膠，利用枸櫞酸鹽。附錄10%卵黃瓊脂（1）成分：50%卵黃鹽水20ml，pH7.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂100ml（2）配置方法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱熔化，待冷卻至55左右，以無(wú)菌技術(shù)加入50%卵黃鹽水懸液，混勻后傾注于無(wú)菌平皿內(nèi)，凝固后置4備用。（3）用途：用于測(cè)定蠟樣芽孢桿菌的脂酶。實(shí)驗(yàn)7 銅綠假單胞菌的檢測(cè)目的要求掌握銅綠假單胞菌檢測(cè)的主要步驟與方法。熟悉化妝品標(biāo)本的采集原則。掌握銅綠假單胞菌菌落的觀察和生化反應(yīng)結(jié)果的判斷。器材和試劑1樣本 可疑化妝品2培養(yǎng)基及試劑 SCDLP液體培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊

50、脂平板、血瓊脂平板、麥康凱平板、KIA、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、麥芽糖、木糖微量發(fā)酵管、硝酸鹽培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水、肉湯培養(yǎng)基等。1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺（氧化酶試劑）、硝酸鹽還原試劑、吲哚試劑、3%過(guò)氧化氫、氯仿、1mol/L的鹽酸3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、樣品的前處理1.親水性樣品（水包油型）：可取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，如樣品量少于10ml，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml則加45ml滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10稀釋液。2. 疏水性樣品（油包水型）：取樣品10g先加10ml

51、滅菌液體石蠟混勻，再加10ml滅菌的吐溫80，在40-44水中振蕩混勻10min，加入滅菌生理鹽水75ml，在40-44水浴中乳化，制成1：10懸液?；蛴镁|(zhì)器，將加有助溶劑、稀釋液的樣品放入均質(zhì)器，均質(zhì)3-5min后，取上清液待檢（上清液的稀釋倍數(shù)為1：10）。3.膏、霜、乳劑半固體狀樣品1）親水性樣品取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放30-32水浴中靜置15min，用其上清液作為1：10的稀釋液。2）疏水性樣品稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70ml滅菌生理鹽水，在40-44水

52、浴中充分混勻，制成1：10稀釋液。4.固體樣品：取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放30-32水浴中靜置15min后取出，充分振蕩混勻，再放到30-32水浴中靜置15min，取上清液作為1：10的稀釋液。如有均質(zhì)器，上述親水性膏、霜、乳劑等，可稱10g樣品加90ml的滅菌生理鹽水，均質(zhì)1-2mi；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品加90mlSCDLP液體培養(yǎng)基，或1g樣品加1ml滅菌液體石蠟、1ml滅菌吐溫80、7ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)3-5min。二、增菌培養(yǎng)：取1：10稀釋樣品10ml加入90mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)18-24h，進(jìn)行增

53、菌。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，則培養(yǎng)基表面有一薄層菌膜，培養(yǎng)液呈黃綠色或藍(lán)綠色。三、分離培養(yǎng)：從増菌液的菌膜處挑去培養(yǎng)物，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、十六烷三甲基溴化銨平板和血瓊脂平板上，經(jīng)35孵育18-24h后觀察菌落特征及色素等。本菌為專性需氧菌，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、大小不一、邊緣不整齊、扁平、光滑、濕潤(rùn)而常呈融合狀態(tài)的 菌落，瓊脂被染成藍(lán)綠色或黃綠色。在血瓊脂平板上形成大而扁平、濕潤(rùn)、有金屬光澤、有生姜味的 灰綠色或藍(lán)綠色菌落，菌落周圍出現(xiàn)的菌落呈有透明的溶血環(huán)。在麥康凱平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕綠色。十六烷三甲基溴化銨平板具有較強(qiáng)的選擇性，大腸

54、埃希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差而銅綠假單胞菌則生成無(wú)定型扁平菌落，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延、表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。四、形態(tài)觀察：將可疑菌落進(jìn)行涂片革蘭染色可見(jiàn)革蘭陰性球桿狀或長(zhǎng)絲狀，成雙或成鏈排列。不染色標(biāo)本動(dòng)力觀察，運(yùn)動(dòng)活躍；鞭毛染色，一端有1-3根紅色的鞭毛。五、生化反應(yīng)：將上述幾個(gè)平板上的可疑菌落接種到各種生化培養(yǎng)基中。1.氧化酶、觸酶試驗(yàn)、本菌均陽(yáng)性。2.綠膿菌素提取試驗(yàn)：本來(lái)應(yīng)該用專門的綠膿菌素培養(yǎng)基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化銨平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化銨平板，具體方法為在十六烷三甲基溴化銨平板中加入3-5ml氯仿，輕輕振搖2分

55、鐘左右，當(dāng)氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移至另一試管中，并加入1mol/L的鹽酸1ml左右，震蕩片刻后靜止，如上層鹽酸層液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色為陽(yáng)性，表明有綠膿菌素的存在。3.42生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑去純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放41-42培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48h。銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。4.其他生化反應(yīng)：銅綠假單胞菌的最后鑒定，主要根據(jù)生化反應(yīng)特征，與嗜麥芽窄食單胞菌的生化區(qū)別如下表1。銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌主要生化反應(yīng)結(jié)果 KIA 氧化酶 枸櫞酸鹽 硝酸鹽產(chǎn)氮 吲哚 色素 葡萄糖 麥芽糖 木糖細(xì)菌 底層 斜面 產(chǎn)氣 H2S銅綠假單胞菌 - - -

56、 - + + + - + + - +嗜麥芽窄食單胞菌 - - - - + - - - - + + -檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長(zhǎng)，經(jīng)證實(shí)為革蘭陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，可報(bào)告被檢樣品中檢出有銅綠假單胞菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性，而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。實(shí)驗(yàn)8 物體表面乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)目的要求熟悉和掌握對(duì)物體表面乙肝病毒HBsAg檢測(cè)的原理和方法，目的是調(diào)查和了解物體表面被HBsAg污染的范圍及程度，考核物體衛(wèi)生學(xué)及消毒效果等，對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查和保護(hù)人群健康具有重要意

57、義。器材和試劑1試劑 乙肝五項(xiàng)檢測(cè)試劑盒(包括預(yù)包被反應(yīng)條、酶結(jié)合物、HBsAg的陰陽(yáng)對(duì)照血清、濃縮洗滌液、顯色劑（A、B）、終止液、封口膠紙、稀釋液)2.其他 酶標(biāo)板、吸水紙、酶標(biāo)儀、微量移液器、移液頭、振蕩器、恒溫水浴箱等原理：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是一種固相酶免疫測(cè)定技術(shù)，先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，與待測(cè)樣品中的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，再加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度（A）值的大小進(jìn)行定性或定量分析。該試驗(yàn)的檢測(cè)類型有雙抗體夾心法、間接法、雙位點(diǎn)一步法、競(jìng)爭(zhēng)法和捕獲法等。雙抗體夾心法：屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，是檢測(cè)抗原最

58、常用的方法，適用于檢測(cè)含有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。其基本原理是先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；加入待測(cè)標(biāo)本并溫育，使標(biāo)本中的抗原與固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合物；然后加入酶標(biāo)抗體并溫育。使固相抗體抗原復(fù)合物與酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物（雙抗體夾心），洗滌除去未結(jié)合酶結(jié)合酶標(biāo)記抗體；加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量檢測(cè)。步驟和方法一、樣本采集：用棉拭子蘸1%血清磷酸鹽緩沖液（pH7.2-7.4），對(duì)醫(yī)院門把手、水龍頭和醫(yī)療器械等表面涂抹10次，對(duì)桌面、樣品臺(tái)、床頭柜等

59、用規(guī)格板涂抹采樣100cm2。將棉拭子浸入1.5ml磷酸鹽緩沖液中，帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣品置40C冰箱內(nèi)過(guò)夜，取浸出液用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBsAg。 二、檢測(cè)步驟1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時(shí)將濃縮洗滌液作1：20稀釋。2.加待測(cè)標(biāo)本：在反應(yīng)板中加入待測(cè)血清每孔50微升，注意應(yīng)同時(shí)做陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照。3.加酶結(jié)合物：每孔50微升，空白對(duì)照孔不加，充分混勻，置370C溫育30分鐘。4.洗板：1）手工洗板：取出反應(yīng)板，甩去孔內(nèi)液體，在濾紙上拍干。然后用洗滌液注滿每孔，靜置5-10秒，棄去孔內(nèi)洗滌液拍干，如此反復(fù)5次、拍干。2）洗板機(jī)洗板：選擇洗滌5次的程序洗板

60、，最后拍干。5.加顯色劑：先加顯色劑A，每孔50微升；再加顯色劑B，每孔50微升，充分混勻，放置370C避光孵育15分鐘。6.終止反應(yīng)：每孔加入終止液50微升，混勻。結(jié)果判定1.肉眼觀察結(jié)果：空白對(duì)照和陰性對(duì)照不顯色（或有顏色變化），陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯的顏色變化，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成立。受檢標(biāo)本顯色深于陰性對(duì)照者可判為陽(yáng)性。2.酶標(biāo)儀判定結(jié)果：采用反應(yīng)底物的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，本實(shí)驗(yàn)底物為TMB，最大吸收波長(zhǎng)為450nm，因此在450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。以樣本孔吸光度值（S）/陰性對(duì)照孔吸光度值（N）2.1時(shí)判定為陽(yáng)性。注意事項(xiàng)1.試劑使用前應(yīng)搖勻，并棄去1-2滴后垂直滴加，注意均勻用力。2.