重組生產(chǎn)膠原蛋白的研究進(jìn)展

1、重組生產(chǎn)膠原蛋白的研究進(jìn)展論文導(dǎo)讀：而且細(xì)胞培養(yǎng)過程中的費(fèi)用是其他細(xì)胞類型如酵母和大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程花費(fèi)的5-10倍。所以需要克隆和表達(dá)人源胃蛋白酶用于畢赤酵母商業(yè)生產(chǎn)重組膠原蛋白。關(guān)鍵詞：重組膠原蛋白，酵母，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物，脯氨酰羥化酶原膠原鏈在翻譯后立刻運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔被P4H羥基化，每條a 鏈大約有100個(gè)脯氨酸發(fā)生羥基化作用，每個(gè)發(fā)生羥基化的脯氨酸出現(xiàn)在GlyXY的Y位置。論文大全。例如, 在I型人源膠原蛋白中，羥基脯氨酸與脯氨酸總數(shù)的比率大約是0.46 【3】 。如果缺乏羥基化的脯氨酸, 在生理溫度下，膠原蛋白根本的螺旋構(gòu)象是熱不穩(wěn)定的 【4】 。所以生產(chǎn)熱穩(wěn)定性的重組膠原蛋白需

2、要高水平的表達(dá)膠原蛋白并且有足夠的P4H活性來催化其羥基化。重組膠原蛋白已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 、昆蟲細(xì)胞 、酵母 、大腸桿菌 、 轉(zhuǎn)基因煙草 、小鼠 和蠶 中得到表達(dá)。在各種重組表達(dá)系統(tǒng)中，只有哺乳動(dòng)物細(xì)胞在轉(zhuǎn)染膠原蛋白基因而不轉(zhuǎn)染P4H基因的情況下，可以表達(dá)充分羥基化的膠原蛋白 。膠原蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平從0.6到20 mg/l不等，在昆蟲細(xì)胞中最高可以到達(dá)40 mg/l 。然而, 這種表達(dá)水平對(duì)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)來說太低，而且細(xì)胞培養(yǎng)過程中的費(fèi)用是其他細(xì)胞類型如酵母和大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程花費(fèi)的5-10倍。而在其它的重組表達(dá)系統(tǒng)中, 遇到的一個(gè)普遍問題是宿主細(xì)胞不能提供足夠的P4H活

3、性來充分羥基化膠原蛋白。一種多基因表達(dá)技術(shù)已經(jīng)用來共表達(dá)膠原蛋白和P4H，并且已有利用多基因表達(dá)技術(shù)以畢赤酵母為宿主細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白的報(bào)道。2.2在酵母中的表達(dá)重組IIV, VII, IX, XIII,XV和 XVIII型膠原蛋白已經(jīng)在畢赤酵母中與P4H得到共表達(dá) 。在商業(yè)化生產(chǎn)中，初期III型膠原在畢赤酵母中的表達(dá)水平是15 mg/l 。論文大全。通過遺傳干預(yù)、發(fā)酵條件優(yōu)化、工藝過程開發(fā)等方面的研究，現(xiàn)在某些膠原蛋白類型的收率已超過1 g/l。畢赤酵母中表達(dá)的膠原并不分泌到細(xì)胞外基質(zhì)而是在細(xì)胞內(nèi)積聚 ，故需要從細(xì)胞中提取膠原前體，通過蛋白酶處理轉(zhuǎn)化為膠原蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 特異的細(xì)胞外金

4、屬蛋白酶催化去除膠原前體N-和C-前肽 ，從組織中別離的前膠原通常利用非特異性的蛋白酶如胃蛋白酶來催化完成這種反響?，F(xiàn)在生產(chǎn)中應(yīng)用的都是動(dòng)物來源的胃蛋白酶，同樣會(huì)帶來動(dòng)物來源材料的各種弊端，所以需要克隆和表達(dá)人源胃蛋白酶用于畢赤酵母商業(yè)生產(chǎn)重組膠原蛋白。 畢赤酵母采用在確定化學(xué)成分的根底培養(yǎng)基中，分批補(bǔ)料和空氣補(bǔ)氧攪拌的模式進(jìn)行發(fā)酵，并以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，可以得到很高的菌體密度 (500 g/l 濕菌重)。重組膠原和P4H基因在乙醇氧化酶啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)，所以當(dāng)生物量積累到一定量后，加甲醇以誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)菌體密度和前膠原都積累到最大量時(shí)，停止發(fā)酵，從培養(yǎng)基中收集菌體，并以物理方法打碎得到膠原前

5、體，再通過重組人源胃蛋白酶的處理，膠原前體轉(zhuǎn)化為膠原蛋白。通過沉降或過濾的方法將重組膠原蛋白與細(xì)胞碎片別離，其他的純化步驟用來除去可溶性的雜質(zhì)，最后得到的產(chǎn)物是溶解于0.01 M HCl 中高純度無菌的重組膠原蛋白。大多數(shù)畢赤酵母中表達(dá)的重組膠原蛋白是以單體形式存在的，某些蛋白類型中約510% 共價(jià)交聯(lián)成二聚體，在III型膠原蛋白中還有很少一局部以三聚體形式存在，這是重組膠原蛋白與動(dòng)物來源膠原蛋白的一個(gè)很重要的差異。天然膠原蛋白很大比例以二聚體、三聚體和其他高分子量聚體的形式存在，例如從牛皮中提取的I 型膠原蛋白大約54%是以聚體形式存在的。這樣畢赤酵母表達(dá)的膠原蛋白就有著更好的勻質(zhì)性。2.3

6、 轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)表達(dá)重組膠原蛋白3個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)煙草、小鼠和蠶已經(jīng)作為有潛力的大規(guī)模、低本錢生產(chǎn)重組蛋白的系統(tǒng)開發(fā)。在過去的10年中，利用遺傳改造的動(dòng)物和植物生產(chǎn)重組蛋白已經(jīng)成為事實(shí)。植物能夠生產(chǎn)和正確組裝哺乳動(dòng)物蛋白，比方包含5個(gè)亞基的分泌抗體和病毒顆粒 。利用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，結(jié)合常規(guī)的農(nóng)學(xué)實(shí)踐與傳統(tǒng)的制藥業(yè)，很小的栽培面積或者很少的動(dòng)物就能夠產(chǎn)生大量的重組蛋白。植物自身能夠合成包含羥基脯氨酸的蛋白 ，然而植物細(xì)胞中的脯氨酰羥化酶與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中P4H有著不同的底物序列特異性 。生產(chǎn)只在GlyXY的Y位置包含羥基脯氨酸的膠原蛋白還是需要共表達(dá)膠原蛋白和P4H基因。已經(jīng)有兩個(gè)研究小組報(bào)道在植物中表達(dá)了

7、I型和III型膠原蛋白同型三聚體。轉(zhuǎn)化膠原蛋白全長(zhǎng)cDNA序列的煙草細(xì)胞，在花椰菜花斑病病毒35S基因組成型啟動(dòng)子控制下，表達(dá)了羥基化的III型膠原蛋白 ，這個(gè)啟動(dòng)子過去用來調(diào)控轉(zhuǎn)染的P4H亞基和亞基cDNAs序列的表達(dá)。表達(dá)膠原蛋白和P4H的細(xì)胞株通過Northern和Western blotting篩選，選擇出的煙草細(xì)胞在搖瓶中培養(yǎng), 氨基酸分析重組煙草中獲得的III型膠原蛋白含有8.1%的羥基脯氨酸，是組織中純化的膠原蛋白羥基脯氨酸含量的75%。轉(zhuǎn)化人源pro a1(I) 或者 pC a1(I) cDNA的轉(zhuǎn)基因煙草可以表達(dá)和組裝全長(zhǎng)的三股的膠原蛋白分 。這種未完全羥基化的膠原蛋白從原膠

8、原通過植物自身蛋白酶的作用轉(zhuǎn)化為成熟的膠原蛋白，而且不用胃蛋白酶蛋白水解除去前膠原的N-和C-端前肽。論文大全。這種生產(chǎn)未完全羥基化的膠原蛋白的系統(tǒng)可用來研究三股螺旋的折疊和重組膠原蛋白的物理特性 。在缺少羥基脯氨酸的條件下，三股螺旋也可正確折疊，但是比率非常低。沒有羥基脯氨酸的膠原蛋白分子非常柔軟，而且溶解溫度是30，形成膠原纖維結(jié)構(gòu)也需要不同的條件。已經(jīng)有報(bào)道利用轉(zhuǎn)化37-kb膠原蛋白基因片段和a S1-乳腺酪蛋白特異性啟動(dòng)子基因片段的小鼠的分泌型乳腺產(chǎn)生全長(zhǎng)的I型原膠原同型三聚體。鼠乳中有很高含量 (8 mg/ml) 的可溶性原膠原，在胃蛋白酶的處理下轉(zhuǎn)化為I型膠原蛋白同型三聚體(a1)

9、3，但是氨基酸分析發(fā)現(xiàn)其中的羥基脯氨酸只有正常水平的50% 。作者推測(cè)乳腺上皮組織中P4H 的水平是其羥基化的限速步驟，并且設(shè)想再轉(zhuǎn)入編碼P4H的a亞基的基因就能克服這種限制。在理論上共轉(zhuǎn)化膠原蛋白和P4H基因的動(dòng)物能夠產(chǎn)生大量的作為重組膠原來源的乳汁，但是這仍然具有動(dòng)物來源膠原蛋白的種種弊端，其中的隱患依舊沒有消除。日本科學(xué)家將編碼Bombyx mori絲心蛋白L鏈和人III型膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)域基因片段的融合cDNA，置于絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。通過Western blot和膠原蛋白酶酶切實(shí)驗(yàn)鑒定，繭中萃取的蠶絲蛋白含有這種融合蛋白。然而，胃蛋白酶消化顯示絲腺中并沒有組裝三股螺旋膠原

10、分子。據(jù)推測(cè)這是因?yàn)橄偌?xì)胞中內(nèi)源的P4H的活性偏低造成的。理論上講，這個(gè)問題可以通過共表達(dá)膠原蛋白和P4H亞基來解決，就像酵母、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因小鼠中所作的一樣。在絲腺中合成膠原蛋白有著很大的開發(fā)潛力。據(jù)文獻(xiàn)，一個(gè)蠶繭可以產(chǎn)生大約70mg總蛋白，包含膠原蛋白序列的融合蛋白在抽取的總蛋白中約占3.6% ，這樣一個(gè)可以養(yǎng)1,500,000條蠶的約300m2的產(chǎn)房一季可以生產(chǎn)5 kg重組膠源蛋白。3小結(jié)雖然利用重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)膠原蛋白的研究取得了一些進(jìn)展，但是還有很多問題亟需解決，比方對(duì)P4H的共表達(dá)技術(shù)。相信隨著技術(shù)水平的進(jìn)步，新技術(shù)平臺(tái)的不斷出現(xiàn)，這些問題也會(huì)迎刃而解。在不久的將來，有很大一局部

11、的人源性的藥用或食用蛋白會(huì)在重組表達(dá)系統(tǒng)中得到生產(chǎn)。參考文獻(xiàn)【2】Myllyharju J, Kivirikko K I.Identification of a novel proline richpeptide-binding domain in prolyl 4-hydroxylase.EMBO J.1999(18) :306312.【3】Miller E J, Gay S.The collagens: an overview and update.Methods Enzymol.1982(82):3 32.【4】Berg R A, Prockop D J. Thermal transit

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