醫(yī)學微生物學實驗指導(dǎo)

1、.：.；醫(yī)學微生物學實驗指點皖南醫(yī)學院微生物學和免疫學教研室2006年5月微生物學實驗的目的與要求醫(yī)學微生物學的實驗課是本課程學習中的重要環(huán)節(jié)。醫(yī)學微生物學實驗課的目的：在于使學生加深和穩(wěn)定對講課內(nèi)容的了解和領(lǐng)會，并在系統(tǒng)學習實際的根底上，使學生學習并掌握微生物學的根本操作技術(shù)，培育獨立思索的才干，為今后的臨床實際及科學研討任務(wù)打下良好的根底。為了提高實驗課的效果，應(yīng)做到以下幾點：一、每次實驗前作好預(yù)習，明確實驗?zāi)康?，?nèi)容，操作中留意點及其實際根據(jù)，防止或減少錯誤發(fā)生。二、在實驗過程中，應(yīng)持嚴肅仔細的科學態(tài)度，并要留意合理地分配和利用時間。三、在微生物學的整個實驗過程中，應(yīng)嚴厲加強“無菌觀念的

2、培育和訓(xùn)練。四、實驗結(jié)果須真實記錄，進展分析，得出結(jié)論。照實驗結(jié)果與實際不符，應(yīng)討論緣由，訓(xùn)練科學思想的才干。實驗完成后，要寫出實驗報告。微生物學實驗室規(guī)那么微生物學實驗的對象大多是病原微生物，因此必需嚴厲貫徹“無菌觀念，防止實驗中本身感染和環(huán)境污染是微生物學實驗室的最重要原那么。一、盡量不帶個人生活、學慣用品入實驗室，必要的器具帶入后，應(yīng)放在遠離操作的位置。二、進入實驗室后穿上任務(wù)衣，離室時脫下反疊帶走。在實驗室內(nèi)應(yīng)堅持安靜、整潔、有次序，不得高聲談笑，隨意走動或裝配儀器、搬弄標本。三、實驗室內(nèi)嚴禁吸煙、進食、飲水，嚴禁用嘴吸移液及潤濕標簽，盡量不要用手觸摸頭面部及身體其他暴露部位。四、如遇

3、不慎而突破菌種管或使有菌資料污染皮膚、衣物、桌面等情況，應(yīng)立刻報告指點教師，切勿隱瞞或自行處置。五、被污染過且需求回收的吸管、滴管、試管、玻片等物運用完后立刻投入已預(yù)備的消毒液中，不得放在桌面上或水槽內(nèi)。六、維護公物，節(jié)約試劑資料，不得將實驗室任何物品私自帶走。如遇儀器、用品損壞，應(yīng)報告指點教師并按規(guī)定予以賠償。七、實驗終了，整理桌面，值日生清掃室內(nèi)衛(wèi)生，最后分開的同窗應(yīng)留意關(guān)好水電、門窗，洗手后離室。實驗一 自然界與人體的微生物檢查實驗?zāi)康模毫私馕⑸镌诳諝?、物體外表及正常機體外表的分布，加強消毒及無菌操作的觀念。實驗資料：普通瓊脂平板、無菌棉棒、無菌生理鹽水、蠟筆、酒精燈。實驗內(nèi)容：一、空

4、氣中微生物的檢查：取無菌普通瓊脂平板一只，翻開后暴露在空氣中，30分鐘后蓋好，置37溫箱孵育24小時，察看各種菌落的特征。二、皮膚、粘膜及其它物品外表微生物的檢查：取普通瓊脂平板一只，用蠟筆在皿底玻璃上劃分四區(qū)，將標簽紙貼于正中，分別注明皮膚、粘膜、硬幣或鋼筆等字樣。然后反轉(zhuǎn)，翻開平板：1、 用手指在注明“皮膚處瓊脂上悄然擦拭。2、 把沾取了無菌生理鹽水的濕棉棒在管壁上擠干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后悄然抹在“粘膜處瓊脂上。3、分別取硬幣或鋼筆等物在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)抹擦。蓋好平板，置37溫箱內(nèi)孵育24小時后，察看菌落的生長情況。實驗報告： 察看與記錄結(jié)果。實驗二 油鏡的運用實驗?zāi)康模菏炝曪@微鏡的運用

5、方法。實驗資料：標本片、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、二甲苯。實驗原理：運用油鏡時，需在玻片上滴加香柏油。這是由于油鏡的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線經(jīng)過不同密度的介質(zhì)物體玻片空氣透鏡時，部分光線會發(fā)生折射而散失，進入鏡筒的光線少，視野較暗，物體察看不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率n=1.52相仿的香柏油n=1.515，那么使進入油鏡的光線增多，視野亮度加強，物象明晰。 D C B A 油 空 氣 玻璃 空氣 A B C D圖1 油鏡的原理表示圖實驗方法：1、用油鏡時，勿將鏡臂彎曲傾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影響察看呵斥污染。2、用低倍鏡對光，自然光線用平面鏡光源不宜采用直射日光，因直射日

6、光的強度太大容易刺激眼睛，人工光源用凹面鏡，同時調(diào)理集光器和光圈以獲得最適亮度。染色標本油鏡檢查時，應(yīng)將光圈完全翻開，集光器上升至載物臺相平，使光亮度很強。3、標本片放在載物臺上，用標本推進器或壓片夾固定。4、低倍鏡找出標本的范圍，然后在待檢部位上加一滴香柏油，轉(zhuǎn)動鏡頭轉(zhuǎn)換器，將油鏡頭置于任務(wù)位置，從側(cè)面察看并緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)理器，使油鏡頭浸沒在油滴內(nèi)，當油鏡頭幾乎接觸玻片時停頓轉(zhuǎn)動，然后眼睛移至目鏡，緩慢向上挪動粗調(diào)理器只應(yīng)上升，不能下降，以免壓碎標本和損壞鏡頭，待看到模糊物象時，再用細調(diào)理器轉(zhuǎn)動至物象完全明晰為止。5、察看終了，取下標本片，立刻用擦鏡紙順一個方向旋轉(zhuǎn)擦拭鏡頭上的油。假設(shè)油已干，

7、應(yīng)先用二甲苯滴在擦鏡紙上擦凈鏡頭，再用另一干凈擦鏡紙拭去鏡頭上沾有的二甲苯。6、顯微鏡擦凈后，降低物鏡并將其轉(zhuǎn)成八字形，集光器下降，反光鏡推平，光圈關(guān)上，歸還顯微鏡室。實驗三 細菌的根本形狀和特殊構(gòu)造實驗?zāi)康模赫莆占毦母拘螤詈吞厥鈽?gòu)造。資料及方法：一、細菌的根本形狀示教1、球菌：葡萄球菌，革蘭氏染色陽性。2、桿菌：大腸桿菌，革蘭氏染色陰性。3、弧菌：霍亂弧菌，革蘭氏染色陰性。二、細菌的特殊構(gòu)造示教1、莢膜：肺炎球菌，成雙陳列，菌體周圍不著色的透明圈即是莢膜所在處。經(jīng)莢膜染色后，菌體與背景呈現(xiàn)紫色，莢膜為無色。2、鞭毛：傷寒桿菌，菌體周圍有周鞭毛。經(jīng)鞭毛染色后，菌體和周鞭毛均呈紫色。3、芽胞

8、：破傷風桿菌，菌體細長，頂端可見一正圓形芽胞。經(jīng)芽胞染色后，菌體為藍色，芽胞為紅色。實驗報告：1、繪圖闡明各種形狀細菌的大小、形狀、陳列方式，并注明染色性及放大倍數(shù)。2、繪圖闡明細菌的特殊構(gòu)造，并注明染色性及放大倍數(shù)。實驗四 根底培育基的制備培育基是根據(jù)微生物生長繁衍時對營養(yǎng)物質(zhì)的需求而配制的營養(yǎng)制品，含有營養(yǎng)物質(zhì)及適宜的酸堿度，經(jīng)滅菌后運用。常用的培育基按用途分為：根底培育基、營養(yǎng)培育基、鑒別培育基、選擇培育基及厭氧培育基。按物理性狀分為固體、半固體和液體三種。實驗?zāi)康模毫私獬Ｓ玫囊后w、固體、半固體培育基的成分、制備方法和用途。實驗資料：牛肉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、0.1mol/lNaOH溶

9、液、酚紅指示劑、蒸餾水等。實驗方法：一、肉湯培育基將鮮牛肉除去筋膜和脂肪，切成小塊后用絞肉機絞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸餾水的比例混合后，置4冰箱過夜。次日取出浸泡物倒入容器內(nèi)煮沸半小時，使肉渣凝固，也可煮沸一小時不經(jīng)冰箱過夜。用紗布和脫脂棉過濾，除去肉渣，即成肉浸汁。參與1%蛋白胨及0.5%氯化鈉，加熱溶解并用蒸餾水補足蒸發(fā)失去的水分。待冷至50左右時，調(diào)該溶液的pH至7.47.6。校正pH的方法為：取三支與規(guī)范比色管pH7.6一樣的空比色管，其中一管內(nèi)盛放蒸餾水5ml；另外兩管各參與欲測的肉湯培育基5ml，其中一管內(nèi)加0.02%酚紅指示劑0.25ml滴定管，搖勻。按圖2所示陳列

10、，舉起比色架，對光察看。假設(shè)滴定管顏色較淡或為黃色，即表示培育基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矯正；假設(shè)呈深紅色，即表示偏堿性，應(yīng)滴加0.1mol/L HCl矯正；使之與規(guī)范比色管色澤一樣為止。通常未矯正前的肉湯均呈酸性。記下用去的NaOH或HCl溶液量，由此計算出矯正全量培育基時所需NaOH或HCl溶液量。圖2 pH比色架酸堿度矯正后，加熱煮沸10分鐘，用濾紙過濾，補足水分，再調(diào)一次pH值。分裝肉湯于三角燒瓶或試管，瓶口、管口加棉塞并用紙包扎。置高壓滅菌器內(nèi)103.43Kpa20分鐘滅菌備用?？捎檬惺鄣呐Ｈ飧嗵娲Ｈ猓昧繛?.3%，其他成分一樣如蛋白胨、氯化鈉等加熱溶解，調(diào)理pH

11、至7.6左右，煮沸10分鐘，補充失水、過濾、分裝，滅菌后備用。二、固體培育基1、在上述制備的肉湯中參與2-3%的瓊脂。瓊脂為海藻中提取的一種多糖類物質(zhì)，本身無營養(yǎng)作用，不能被細菌利用。因其加熱到100后可溶化，冷卻至40左右又可凝固，故可作為賦形劑。加熱溶化，脫脂棉過濾，補足失水，分裝三角燒瓶和試管。2、置高壓滅菌器內(nèi)103.43Kpa滅菌20分鐘，取出后趁熱將試管傾斜一定角度放置，待瓊脂凝固即成瓊脂斜面培育基圖3。三角燒瓶內(nèi)培育基冷至50-60時在超凈臺或無菌室內(nèi)將其傾注于滅菌平皿內(nèi)15-20ml，凝固后即成瓊脂平板。圖3 瓊脂斜面培育基另外，實踐任務(wù)中現(xiàn)多運用合成營養(yǎng)瓊脂枯燥粉末制劑。其方

12、法為：稱取41克營養(yǎng)瓊脂枯燥粉末參與1000ml冷蒸餾水中混合放置10分鐘，隔石棉鐵絲網(wǎng)微火煮沸使其完全溶解，分裝于中試管中約57ml或三角燒瓶，103.43kPa121滅菌15分鐘，即可備用。三、半固體培育基1、操作方法同固體培育基，但瓊脂參與量較少，僅0.3-0.5%。2、分裝試管，滅菌后使試管直立，冷凝后即成半固體培育基。實驗五 細菌的分別與培育實驗?zāi)康模赫莆赵诟鞣N培育基上的接種方法并察看生長景象。實驗資料：菌種、普通瓊脂平板、肉湯培育基、半固體培育基、斜面培育基、接種環(huán)、接種針、酒精燈。實驗內(nèi)容：一、平板劃線接種法分別培育法原理：經(jīng)過在平板上劃線，將混雜的細菌在瓊脂平板外表充分的分散開

13、，使單個細菌能固定在一點上生長繁衍，構(gòu)成單個菌落，以到達分別純種的目的。假設(shè)需從平板上獲取純種，那么挑取一個單個菌落作純培育。用途： 分別出純種細菌，以利作純培育。操作方法三區(qū)劃線法：1、右手拿接種環(huán)，燒灼冷卻后，取菌液一環(huán)。2、左手抓握瓊脂平板讓皿蓋留于桌上，在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂外表密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個平板的1/5-1/6，此為第一區(qū)。劃線時接種環(huán)與瓊脂呈30-40度角悄然接觸，利用腕力滑動，切忌劃破瓊脂。3、接種環(huán)上多余的細菌可燒灼每劃完一個區(qū)域能否需求燒灼滅菌視標本中含菌量多少而定，待冷后，在劃線末端反復(fù)2-3

14、根線后，再劃下一區(qū)域約占1/4面積，此為第二區(qū)。4、第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán)，用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個平皿。5、劃線終了，將平板扣入皿蓋并作好標志，置37溫箱孵育18-24小時察看瓊脂外表菌落分布情況，留意能否分別出單個菌落，并記錄菌落特征如大小、外形、透明度、色素等。圖4-1 平板分區(qū)劃線法圖4-2 培育后菌落分布情況二、液體培育基接種法用途：凡肉湯、蛋白胨水，各種單糖發(fā)酵均用此法接種。可以察看細菌不同的生長性狀、生化特性以供鑒別之用。操作方法：右手執(zhí)筆式握住接種環(huán)，滅菌冷卻后取單個菌落。左手拇指、食指、中指托住液體培育基之下端，右手小指和無名指或手掌拔取試管塞，將管口移至火焰上旋轉(zhuǎn)燒

15、灼。將沾菌的接種環(huán)移入培育基管中，在液體偏少側(cè)接近液面的管壁上悄然研磨，沾取少許液體與之調(diào)和，使菌液混合于培育基中圖5。管口經(jīng)過火焰，塞好試管塞，將接種環(huán)滅菌后放下，經(jīng)37溫箱孵育18-24小時，取出察看生長情況。三、半固體穿刺接種法用途：察看細菌動力，保管菌種。方法：1、以無菌操作用接種針挑取單個菌落，立刻垂直插入培育基中心至接近管底處循原路退回。2、管口經(jīng)過火焰，塞上棉塞，接種針滅菌后放下。試管置37溫箱孵育18-24小時，取出后對光察看穿刺線上細菌生長情況：細菌有無向周圍分散生長，穿刺線能否明晰等。 圖5 液體左及半固體右培育基接種法四、斜面培育基接種法用途：常用于擴展純種細菌及實驗室保

16、管菌種。操作方法：以無菌操作法用接種環(huán)挑取單個菌落，自斜面底向上劃不斷線，然后再從底向上悄然來回作蜿蜒劃線。管口經(jīng)過火焰，塞上棉塞，接種環(huán)燒灼后方可放下。置37溫箱孵育18-24小時，取出察看斜面上菌苔生長情況。 圖6 斜面培育基接種法實驗報告：詳細記錄細菌在各種培育基中生長后的表現(xiàn)。實驗六 病原性球菌的檢查一實驗?zāi)康模?了解病原性球菌的檢查程序。2掌握細菌涂抹標本制備和革蘭氏染色法。3掌握病原性球菌的形狀和分別培育法。實驗資料：病原性球菌的形狀、膿汁標本、革蘭氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接種環(huán)、酒精燈、光學顯微鏡、香柏油、吸水紙、擦鏡紙、標志筆。實驗內(nèi)容：一、病原性球菌的檢查程序病原性

17、球菌常引起化膿性疾病，分別用標本多采用膿、痰液，但也可從分泌物、血液及穿刺液中取材。1、標本采集1膿液：用無菌棉拭挑取患部深處膿液或分泌物，放入無菌試管內(nèi)。2痰液：用消毒過的容器搜集病人痰液，以無菌棉拭挑取濃稠痰塊，放入無菌試管。3咽部分泌物：囑病人張開口，用壓舌板輕壓舌根部，以無菌棉拭從鼻咽部位擦拭取材，然后將其放入無菌試管。4血液：高熱、敗血癥患者作血液檢樣時，最好在發(fā)熱時，抗菌藥物治療前采取，這時培育陽性率最高。取血35毫升，立刻以無菌手續(xù)注入3050毫升使血與培育基之比約等于110的葡萄糖酚紅肉湯增菌培育基中。5腦脊液：對疑患流腦的患者作腰椎穿刺取腦脊液CSF，腦脊液取出后應(yīng)盛于無菌容

18、器內(nèi)，立刻送檢。6尿道、陰道分泌物：對淋病可疑患者，男性可從尿道取材，取材時應(yīng)進入尿道12cm，如剛排尿，應(yīng)等待1小時左右。女性那么可從宮頸口取分泌物，當插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)12分鐘拿出，取材應(yīng)立刻送檢，不可放置冰箱。2、分別與鑒定待檢標本可直接作涂片染色檢查鑒定，必要時可作分別培育及生化反響，致病性鑒定。常見致病性球菌的檢查程序如下。 直接涂片、革蘭氏染色、鏡檢形狀、陳列、染色性 察看菌落性狀、溶血性、色素膿、痰、分泌物 涂片、染色、鏡檢穿刺液、腦脊液 生化反響 血瓊脂平板 挑取可疑菌落 純分別 致病性測定 藥敏實驗血液、尿、膽汁肉湯增菌培育3717天 培育液混濁或溶血時，涂片、染

19、色、鏡檢 二、涂片染色鏡檢 一涂抹標本制備方法：1、涂片：取干凈的載玻片一張，用蠟筆標志，接種環(huán)滅菌后，以接種環(huán)取濃汁標本1-2環(huán)，置于玻片的中央，涂成直徑約1cm的均勻薄膜涂片。如用固體培育物，須先加生理鹽水，再將細菌少許與生理鹽水混勻。2、枯燥：涂片最好在室溫下自然枯燥，必要時可將涂片膜面向上，小心延續(xù)地在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢測。3、固定：涂片枯燥后，手持玻片一端涂膜面向上在酒精燈上快速地來回經(jīng)過三次，共約23秒鐘，留意溫度不可太高，以玻片涂膜的反面觸及皮膚覺燙而尚能忍受為度。固定的目的一是殺死細菌；二是使菌體與玻片粘附較牢，在染色時不致被

20、染液和水沖掉；三是使菌體蛋白變性易著色見圖142二革蘭氏染色法革半氏染色法Gramstain是丹麥細菌學家革蘭Christain Gram于1884年發(fā)明的，至今已逾百年，但仍在廣泛運用，是細菌學中最為經(jīng)典的染色法。其根本過程是標本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫初染，再用革蘭氏碘液媒染，然后用95%酒精脫色，最后用石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染。此法可將細菌染成兩大類：不被酒精脫色仍保管紫色的為革蘭氏陽性菌，被酒精脫色后復(fù)染成紅色的為革蘭氏陰性菌。1、原理：革蘭氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三種學說：等電學說：革蘭氏陽性菌等電點Ph23比革蘭氏陰性菌Ph45低，普通染色時染液的酸堿度在Ph7.0左右，電離后陽

21、性菌帶的負電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合結(jié)實，不易脫色。通透性學說：革蘭氏陽性菌細胞壁構(gòu)造比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入，反而可使細胞壁脫水而構(gòu)成一道屏障，阻止染料向細胞外滲。革蘭氏陰性細菌細胞壁疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，致使細胞壁通透性增高，細胞內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物容易被乙醇溶解而脫出。化學學說：革蘭氏陽性菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學成分，普通以為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它和染料-媒染劑復(fù)合物相互結(jié)合，使已著色的細菌不易脫色。2、革蘭氏染色液的配制：結(jié)晶紫染液：結(jié)晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成結(jié)

22、晶紫酒精飽和液。取出此飽和液20ml與1%草酸銨水溶液80ml混勻。碘液：先將碘化鉀2.0溶于約2ml蒸餾水中，再加碘片1.0g，略加振搖，待碘片完全溶解后，再加蒸餾水至總量為300ml。稀釋石炭酸復(fù)紅染液：取堿性復(fù)紅10.0g或堿性復(fù)紅新4.0g溶于95%酒精100ml中，配成堿性復(fù)紅酒精飽和液；取此飽和液10ml與5%石炭酸水溶液90ml混勻，配成石炭酸復(fù)紅原液；取此原液10ml參與蒸餾水90ml中混勻，即成稀釋石炭酸復(fù)紅染液。3方法：初染：在已固定的細菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴室溫作用一分鐘后，用細流水悄然沖洗。媒染：滴加媒染劑碘液數(shù)滴，室溫作用一分鐘，用細流水沖洗。脫色：滴加95%酒精

23、數(shù)滴，悄然搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止約需30s，立刻用細流水將酒精沖掉。復(fù)染：滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30秒鐘后用細流水沖洗。鏡檢：標本染色后，涼干，滴香柏油，用油鏡察看，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。三、平板劃線接種法分別培育法見細菌分別與培育。實驗報告：記錄革蘭氏染色結(jié)果；記錄三區(qū)劃線結(jié)果。實驗七 病原性球菌檢查二實驗?zāi)康?掌握病原性球菌培育物性狀。2掌握血漿凝固酶實驗原理方法。3掌握密集接種法，熟習藥物如抗生素抑菌殺菌原理并了解紙片法、試管法的實驗方法及運用。實驗資料1、菌種：金黃色葡萄球

24、菌、痢疾桿菌68小時肉湯培育物。2、培育基：普通瓊脂平板、肉湯培育基。3、藥品：青霉素溶液50u/ml、抗生素濾紙片。4、器具：恒溫箱、接種環(huán)、酒精燈、試管、無菌棉拭、無菌小鑷子、無菌吸管、玻片、血漿。實驗內(nèi)容一、病原性球菌的培育物察看肉眼察看葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌在血瓊脂平板上的生長情況及腦膜炎球菌在巧克力色瓊脂平板上的生長情況，比較菌落的形狀特征。1葡萄球菌：在血瓊脂平板上培育1824小時，構(gòu)成圓表凸起，外表光滑、潮濕、邊緣整齊，菌落不透明。金黃色葡萄球菌金黃色，可產(chǎn)生透明溶血環(huán)；表皮葡萄球菌白色、無溶血環(huán)，腐生葡萄球菌白色或檸檬色，無溶血環(huán)。2鏈球菌：在血瓊脂平板上培育1824小時，

25、構(gòu)成灰白色、圓形凸起、半透明或不透明的細小菌落。甲型溶血性鏈球菌不完全溶血，在菌落周圍構(gòu)成草綠色溶血環(huán)，乙型溶血性鏈球菌完全溶血、構(gòu)成透明溶血環(huán)，丙型鏈球菌不發(fā)生構(gòu)成圓形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血瓊脂平板上不發(fā)生溶血溶血、無溶血環(huán)。3肺炎球菌：血瓊脂平板上培育1824小時，構(gòu)成細小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周圍有草綠色溶血環(huán)，其與甲型溶血性鏈球菌類似，培育23天后，因菌體發(fā)生自溶，菌落中央下陷呈“臍狀。4腦膜炎球菌：在巧克力色瓊脂平板上加5%CO237培育24小時，構(gòu)成圓形光滑隆起透明似露珠的菌落，無溶血環(huán)。 二、血漿凝固酶實驗1、原理致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動物血漿發(fā)

26、生凝固，因此，測定血漿凝固酶的有無是鑒定葡萄球菌致病性的重要根據(jù)。2、方法及結(jié)果玻片法：取干凈玻片一塊，用記號筆將玻片劃成兩格，其中一格加2接種環(huán)的生理鹽水，另一格加1：2人血漿或免血漿1接種環(huán)。用接種環(huán)取上次培育物葡萄球菌之菌落少許在生理鹽水內(nèi)研磨成細菌懸液，然后取此懸液1環(huán)與血漿混勻。5分鐘以內(nèi)察看結(jié)果，假設(shè)有凝塊出現(xiàn)，即為陽性；假設(shè)無凝塊出現(xiàn)，那么為陰性。試管法：按表24-1參與1：4血漿及葡萄球菌肉湯培育液。將各管置37水浴中，每隔30分鐘察看一次結(jié)果。在3小時內(nèi)，假設(shè)第一管及第二管出現(xiàn)凝固，而第三管不出現(xiàn)凝固那么為陽性。表24-1 血漿凝固酶實驗試管法試管血漿1：4待檢葡萄球菌肉湯培

27、育物金黃色葡萄球菌肉湯培育物肉湯結(jié)果10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml三、藥物敏感性實驗實驗原理 治療細菌感染的藥物如磺胺類、異煙肼、抗生素等殺菌具有抑菌和殺菌作用，其作用機制主要是干擾細菌的代謝，妨礙和影響細菌細胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，不同的細菌種類或菌株，對同一藥物的敏感性不同，因此測定病原菌對抗菌類藥物的敏感性，對于合理用藥和提高臨床療效具有重要意義。本實驗經(jīng)過兩種方法測定細菌對抗生素的敏感程序。 內(nèi)容與方法一、紙片法1、密集接種法接種細菌：用無菌接種環(huán)挑取已培育好的金黃色葡萄球菌培育物少許，先在平板瓊脂外表中央劃一條線，垂直該線作

28、平行密集劃線，劃滿平板。再將平板轉(zhuǎn)動90度，作平行密集劃線，劃滿平板。2、用無菌注射針頭挑取抗生素青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素等濾紙片，貼在平板瓊脂外表。濾紙片之間間隔 應(yīng)根本相等，普通每個平板貼四到五個濾紙片為宜。留意每次取濾紙片之前，針頭須燒灼滅菌冷卻。3、將平板置37溫箱培育24小時后取出察看濾紙片周圍的抑菌圈見圖201，用尺子丈量其直徑并對照細菌對抗生素敏感度判別表做出結(jié)果判別。二、試管法1、金黃色葡萄球菌菌液制備取金黃色葡萄球菌68小時肉湯培育物0.1ml加于2ml肉湯培育基中，置37溫箱培育68小時后備用。2、方法1取10支無菌小試管標號后，除第一管外其它每管參與肉湯

29、培育基1ml。2在第一、二管中各參與青霉素50u/ml溶液1ml，混勻。3從第二管中汲取1ml參與第三管中，混勻，然后依此法加樣稀釋至第九管，再從第九管中抽取1ml棄去。第十管不加青霉素作為對看管。4于每管中參與金黃色葡萄球菌菌液各0.1ml，混勻。5置37溫箱培育24小時后察看結(jié)果，以培育基混濁程度來判別細菌對青霉素的敏感程度，最高稀釋度的抗菌藥物仍能抑制細菌生長者為最低抑菌濃度MIC可用單位/ml表示之。 常用藥敏實驗紙片判別規(guī)范與其相應(yīng)的MIC近似值抗菌藥物 紙 片 抑菌圈直徑毫米 最低抑菌濃度微克/毫升 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 耐藥 敏感 青霉素葡萄球菌 10單位 20 21-2

30、8 29 0.20.1 其它細菌 10單位 1112-2122321.5鏈 霉 素 10微克 1112-1415 156氯 霉 素 30微克 1213-17182512.5 紅 霉 素 15微克 1314-171882慶 大 霉 素 10微克 1213-141584卡 那 霉 素 30微克 1314-1718256四 環(huán) 素 30微克 1415-1819124多 粘 菌 素 300單位 89-111250單位磺 胺 300微克 1213-1617350 100 甲氧苯青霉素 5微克 910-1314-3萘 啶 酸 30微克 1314-1819 3212實驗報告：記錄血漿凝固酶實驗結(jié)果；記錄藥敏

31、實驗結(jié)果。 結(jié)合系列實驗結(jié)果，對病原性球菌鑒定作出結(jié)論。實驗八 腸道桿菌的鑒定一 腸道桿菌是一群寄居于人或動物的腸道內(nèi)的細菌，多數(shù)為非致病菌或條件致病菌，少數(shù)為致病菌。其生物學性狀類似，但生化反響、抗原構(gòu)造有差別，據(jù)此可將它們分類、鑒定。實驗?zāi)康模?熟習腸道桿菌未知標本分別和鑒定方法；2掌握肥達式反響的原理及結(jié)果分析，熟習其操作過程；3了解大腸桿菌、痢疾桿菌及傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片4了解腸道桿菌常見的一些生化反響及其在鑒定上意義、實驗資料：1. 大腸桿菌或痢疾桿菌或傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片大腸桿菌、痢疾桿菌或傷寒桿菌在SS培育基上的培育物示教；大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒甲或

32、乙等在雙糖鐵培育基上的 培育物示教；大腸桿菌與痢疾桿菌或傷寒桿菌的混合菌液模擬糞便標本；痢疾桿菌及傷寒桿菌診斷血清，生理鹽水，玻片；診斷用肥達式菌液、肥達式平板、小試管、吸管、無菌滴管、傷寒患者血清經(jīng)5630分鐘滅活、水浴箱等；7. 單糖發(fā)酵管、蛋白胨水培育基、醋酸鉛培育基、葡萄球菌和綠膿桿菌在普通瓊脂平板上的培育物。實驗內(nèi)容： 1肥達氏反響原理：人體感染傷寒桿菌或副傷寒桿菌后，能產(chǎn)生與這些細菌起特異性反響的抗體，這種抗體及其量可以用知的抗原來測得。本實驗用知的傷寒桿菌H、0抗原和甲型、乙型副傷寒桿菌的H抗原與可疑病人血清做定量凝集實驗，可測定患者血清中相應(yīng)抗體的含量及其增減情況，以協(xié)助傷寒或

33、副傷寒病的診斷。方法：取一有205*4孔的有機反響板2塊，延續(xù)標號，每行分別標號110。取中試管1支，參與3.9ml生理鹽水，再換一支吸管，汲取患者血清0.1ml經(jīng)5630分鐘滅活放入中試管內(nèi)，吸打混勻；此時血清稀釋度為1：40。汲取1：40的血清2ml，在每列的第一孔中各參與0.5ml。在中試管余下2ml血清中，再參與2ml生理鹽水，混勻血清稀釋度為1：80。然后汲取此1：80的血清2ml，在每列第2管中各參與0.5ml。按上述倍比稀釋，并依次參與各管，直至每行第9管見表7-1。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10HOPAPB140 180 1160 1320 1640 11280 12

34、560 15120 110240 - 表7-1 肥達氏反響的加樣表示圖另取吸管1支，汲取生理鹽水向每行第10管中各參與0.5ml對看管按10、9、81列的順序，分別對第1行各孔參與0抗原1滴；第2行各孔參與H抗原1滴；同樣對第3行各孔加甲型副傷寒PAH抗原1滴；第4行各孔加乙型副傷寒PBH抗原1滴。由于抗原菌液的參與量少，可忽略不計。 將各孔混勻，置37水浴箱中2小時，取出置室溫過夜，次日察看，判別并分析結(jié)果。結(jié)果察看見圖7-1：根據(jù)凝集反響的強弱，分別以“+、+、+、+記錄：+：液體清澈透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。+：液體較透明，大部分菌體被凝集而沉于管底。+：液體稍透明，管底有少量凝

35、集沉淀物。+：液體較混濁，可見極少量凝集物。-：液體混濁，細菌因重力下降于管底呈邊緣光滑圓點與對看管類似。管底景象記錄方式圖7-1 肥達氏反響的結(jié)果斷定血清效價或滴度：能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的明顯凝集即“+凝集的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為血清的效價。血清的效價代表著血清中抗體的含量，其效價愈高，所含抗體的量愈多。如血清最低稀釋倍數(shù)140仍無凝集，那么視為陰性或效價低于140；如血清的最高稀釋倍數(shù)11280仍完全凝集，那么示血清效價高于11280。結(jié)果分析：首先應(yīng)思索當?shù)卣Ｈ诵r正常效價。普通以單份血清凝集效價：0效價應(yīng)達1：80以上、H效價應(yīng)在1：160以上，PA和PB應(yīng)達1：40以上方有

36、診斷價值；假設(shè)病程中第2次血清效價比第1次高4倍以上亦有診斷價值。由于H凝集素在血內(nèi)堅持時間較久，0凝集素較短暫，所以曾接種過傷寒、副傷寒菌苗者，0凝集效價在診斷上較重要。真正的傷寒病人，0凝集素常較H凝集素出現(xiàn)早、但維持時間較短；H凝集素出現(xiàn)較晚、但效價較高且繼續(xù)時間較長?；叵敕错懀哼^去曾接種過傷寒、副傷寒菌苗或患過傷寒、副傷寒病，近期又發(fā)生感染如流感、肝炎、結(jié)核病等，可非特異地產(chǎn)生較高的H凝集素和較低的0凝集素，此景象稱為回想反響。假設(shè)0效價高而H不高對正常效價而言，那么能夠是感染早期或與傷寒桿菌0抗原有交叉反響的其他沙門菌感染。確診為傷寒的患者中，約有10%的患者該實驗一直陰性或效價不高

37、，故陰性結(jié)果不能排除傷寒的診斷。采血時間不同，肥達式反響的陽性率也不同。發(fā)病第1周約為50%；第2周80%；第4周90%以上。恢復(fù)期效價最高，以后逐漸下降，直至轉(zhuǎn)陰。普通以雙份血清急性期和恢復(fù)期對比，效價有明顯上升者作為新近感染的指征。察看大腸桿菌或痢疾桿菌/傷寒桿菌革蘭氏染色形狀示教片腸道致病菌的分別鑒定一1引見腸道致病菌的分別鑒定程序圖7-22分別培育與鑒定詳細方法取材：挑取黏液膿血樣糞便置清潔容器內(nèi)立刻送檢。假設(shè)不能及時送檢，運用甘油緩沖鹽水保管。假設(shè)無法獲取糞便時，用肛拭子檢查用無菌棉拭子經(jīng)生理鹽水潮濕后，插入肛門45cm處悄然沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油緩沖鹽水的無菌試管中送

38、檢。糞便標本或肛拭子可直接在SS瓊脂平板上劃線分別培育常用三區(qū)劃線法，詳見實驗五 細菌的分別與培育。對血、骨髓、尿等標本可先做增菌培育，然后取增菌培育物在上述平板上劃線分別，經(jīng)37培育1824小時。 2SS平板分別培育方法同前三區(qū)劃線時留意：無菌操作; 劃線角度準確，輕而快; 分區(qū)合理； 接種環(huán)適時處置；培育基正確放置，作好標志.。血清學鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培育基其他生化鑒定雙糖鐵培育基半固體培育基糞便標本血清學鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培育基增菌培育血、骨髓、尿其他生化鑒定雙糖鐵培育基半固體培育基糞便標本圖7-2 腸道致病菌的分別鑒定程序附. 有關(guān)培育基及試劑的

39、配制：1肉湯培育基：新穎肉浸液1000ml、蛋白胨10mg、氯化鈉5g，上述各成分混合后調(diào)PH7.27.4，分裝于100ml疫瓶中，每瓶50ml，高壓滅菌后備用。該培育基適宜于各類細菌的增菌培育。2SS瓊脂平板：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、膽鹽8.5g、枸櫞酸鈉8.5g、硫代硫酸鈉8.5g、瓊脂20g、枸櫞酸鐵1g、0.1%煌綠溶液0.33ml、1%中性紅溶液2.5ml、蒸餾水1000ml。除了煌綠、中性紅以外，將其它各成分混合于蒸餾水中，加熱溶化，調(diào)PH至7.0，再參與煌綠和中性紅，分裝于三角燒瓶中，以68.95kPa高壓滅菌10分鐘，待冷至50左右，傾注于無菌平板中，冷后備用。適宜

40、于糞便標本中腸道致病菌的分別。實驗報告：1. 察看示教片并繪圖。2記錄腸道桿菌的分別鑒定程序。 3. 記錄肥達氏反響的結(jié)果，并判別效價和作出分析。實驗九 腸道桿菌的鑒定二實驗內(nèi)容： 1. 察看上次實驗結(jié)果在SS平板上的23區(qū)可看見散在的沿劃線分布的大小不同、兩種顏色的菌落。一種是較大的紅色菌落，另一種是較小的半透明的淡黃色或無色的菌落。較大的紅色菌落是腸道致病菌，較小的半透明的淡黃色或無色菌落是腸道致病菌。詳見表8-1。表8-1 大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌的生物學特征特性菌名形狀、陳列及染色性在SS平板上的菌落表現(xiàn)生化反響動力吲哚乳糖葡萄糖H2S大腸桿菌桿狀，散在陳列，G菌落較大，不透明，呈

41、紅色+痢疾桿菌同上菌落小，半透明，無色或淡黃色+/傷寒桿菌同上菌落較小，半透明，無色或淡黃色+/+注：產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“+產(chǎn)酸或陽性，“陰性 2雙糖鐵培育基的接種從SS培育基上挑取較小的無色或淡黃色菌落，可先做革蘭氏染色鏡檢，然后再接種于雙糖鐵培育基中為察看比較，同組四人應(yīng)取大小或顏色不同的兩個菌落分別接種于兩支雙糖鐵，并作好標志。方法：即實驗五引見的半固體接種法和斜面接種法的結(jié)合用接種針以無菌操作技術(shù)挑取標本，立刻垂直插入培育基中心至接近管底處，再循原路退出到斜面上； 接種針自斜面最低處向上劃不斷線要求經(jīng)過試管培育基的中心點，然后再從斜面低處向上悄然來回作蜿蜒劃線；接種終了，蓋好試管塞。貼上標簽紙

42、。37培育1824小時，取出察看結(jié)果并分析參照表8-1附：雙糖鐵培育基：蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化鈉5g，檸檬酸鐵銨0.5g，硫代硫酸鈉0.5g，瓊脂1215g，4g/L酚紅水溶液6ml，蒸餾水1000ml。除糖類和酚紅外，其他各成分均加熱溶解，矯正pH至7.47.6，再參與糖類和酚紅水溶液，混勻，過濾分裝，每管3ml，68.95kPa滅菌15min，取出后制成斜面，斜面和底層各占1/2。3半固體培育基的接種另從SS培育基上挑取較小的無色或淡黃色菌落，可先做革蘭氏染色鏡檢,然后再接種于半固體培育基中為察看比較，同組四人應(yīng)取大小或顏色不同的兩個菌落分別接種

43、于兩支半固體培育基，并作好標志。方法：詳見實驗五細菌的分別和培育中的半固體接種法。 實驗報告： 記錄上次SS培育基中出現(xiàn)的結(jié)果繪圖；實驗十 腸道桿菌的鑒定三實驗內(nèi)容： 1. 察看雙糖鐵培育基上細菌的生化反響情況腸道致病菌： 斜面紅色， 底層黃色 ，假設(shè)構(gòu)成硫化氫，培育基變黑。 腸道非致病菌： 斜面黃色， 底層黃色，能夠有氣泡。原理：培育基的指示劑為酚紅，酸性時呈黃色，堿性時呈紅色。發(fā)酵乳糖的細菌使斜面和底層均呈黃色，可有氣泡產(chǎn)生；假設(shè)只發(fā)酵葡萄糖，那么因葡萄糖含量少，生成少量的酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，并因細菌生長繁衍利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面呈紅色，底層由于缺氧，細菌發(fā)酵葡萄糖生成酸

44、類物質(zhì)不氧化而堅持黃色；如細菌分解蛋白質(zhì)中的胱氨酸產(chǎn)生硫化氫，那么與硫酸亞鐵作用生成黑色的硫化亞鐵沉淀，使培育基變黑。2.察看半固體培育基上的細菌生長景象假設(shè)細菌沿穿刺線生長，穿刺線周圍的培育基明晰，那么細菌沒有動力即無鞭毛；假設(shè)細菌沿穿刺線向周圍分散生長，穿刺線周圍的培育基呈云霧狀混濁，闡明細菌有動力即有鞭毛。結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果、SS平板的培育結(jié)果、雙糖鐵培育結(jié)果、半固體培育結(jié)果作出初步診斷。3. 血清學鑒定玻片凝集實驗鑒定菌種目的 察看細菌在玻片上與其相應(yīng)抗體結(jié)合所出現(xiàn)的細菌凝集景象，了解抗原抗體反響的特異性。原理 將知細菌抗體與待測細菌混合，假設(shè)抗原與抗體相對應(yīng)，那么引起細菌凝集，反之那

45、么不凝集，據(jù)其凝集景象可判別細菌種類。資料 1、 1：20痢疾桿菌免疫血清，1：20傷寒桿菌免疫血清。 2、 待檢菌培育物。 3、 生理鹽水、玻片、記號筆、接種環(huán)、酒精燈、消毒缸等。方法 1、 取干凈玻片1張，用記號筆劃分三等份，如以下圖所示：2、 用接種環(huán)分別取生理鹽水、1：20傷寒桿菌免疫血清、1：20痢疾桿菌免疫血清各3-4環(huán)按圖示位置放在玻片上，留意在換取另一種血清時要燒灼接種環(huán)，以免混淆血清產(chǎn)生錯誤結(jié)果。3、 用接種環(huán)挑取少量待檢菌參與玻片的生理鹽水中，充分混勻，再挑取少量待檢菌加人1:20傷寒免疫血清中混勻，同法挑取待檢菌參與1：20痢疾桿菌免疫血清中，混勻。留意無菌操作。4、 輕

46、搖動玻片，12分鐘后察看NS 傷寒桿菌免疫血清 痢疾桿菌免疫血清+ + +待檢菌 待檢菌 待檢菌結(jié)果察看陽性：液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)。陰性：液體依然混濁，無凝集塊出現(xiàn)。 -+陰性陽性記錄結(jié)果之后，將玻片放入含消毒液的指定容器內(nèi)，切勿恣意放置或沖洗。留意 取細菌培育物時不宜過多，與免疫血清混合時，必需將細菌涂散、涂均勻，但不宜將面積涂得過大，以免很快干涸而影響結(jié)果察看。4. 細菌代謝產(chǎn)物的察看察看細菌在培育基中的生長情況，參照前表腸道桿菌生物學性狀分析并作出初步鑒定，按照此結(jié)果，再用其他生化反響來作最后鑒定。1單糖發(fā)酵實驗：原理：各種細菌含有不同的糖醇分解酶，分解糖醇的才干不同，代謝產(chǎn)物

47、也不同，有的產(chǎn)酸、有的尚有氣體構(gòu)成。因此可協(xié)助鑒別細菌，尤其是腸道細菌；單糖發(fā)酵管的制備：將1.6%的溴甲酚紫水溶液1ml參與PH7.6的蛋白胨水1000ml中搖勻。每200ml為一份，分裝到已標好葡、乳、麥、甘、蔗等字樣的五個錐形瓶中。在五瓶液體中分別參與五種糖，糖的最終濃度為1%。將五種糖培育基分別裝入已備有小倒管的試管中，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。方法與結(jié)果：用滅菌接種環(huán)分別取大腸桿菌和傷寒桿菌少許，分別接種于五種糖發(fā)酵管，經(jīng)37培育1824小時，察看結(jié)果；.糖不分解，指示劑仍為紫色，記錄方式；.糖分解產(chǎn)酸不產(chǎn)氣指示劑變黃，小倒管中無氣泡，記錄方式+；.

48、糖分解產(chǎn)酸且產(chǎn)氣指示劑變黃，小倒管中有氣泡，記錄方式 + 氣泡 黃色單糖發(fā)酵實驗2靛基質(zhì)吲哚實驗：原理：各種細菌分解氨基酸的才干不同，借此可鑒別菌種。有些細菌如大腸桿菌、變形桿菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成無色的吲哚即靛基質(zhì)，當參與靛基質(zhì)試劑對二甲基氨基苯甲醛，構(gòu)成玫瑰色吲哚，可用肉眼察看。蛋白胨水培育基的制備：將蛋白胨1g、NaCl0.5g參與蒸餾水100ml，調(diào)pH值為7.6，分裝試管，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。 方法與結(jié)果：用滅菌接種環(huán)分別取大腸桿菌、傷寒桿菌少許接種于蛋白胨水培育基中，經(jīng)37培育2448小時。取出培育物后，參與23滴乙醚

49、，混勻靜置使無色吲哚和乙醚一并上升至液體外表，再沿管壁參與23滴靛基質(zhì)試劑于培育物外表，在兩者接觸面上呈玫瑰紅色為陽性，黃色為陰性。3硫化氫實驗： 原理：有些細菌如變形桿菌、副乙型傷寒桿菌等能分解含硫氨基酸胱氨酸等生成硫化氫，如培育基中含有鉛鹽如醋酸鉛或者鐵鹽如硫酸亞鐵，硫化氫可與之結(jié)合生成黑褐色的沉淀物。 醋酸鉛培育基的制備：將醋酸鉛0.5g、硫代硫酸鈉0.25g等參與到500ml2%的肉湯瓊脂中，調(diào)PH值為7.47.6, 分裝試管，每管約34ml。經(jīng)68.95kPa高壓滅菌15分鐘后備用。方法與結(jié)果：用滅菌接種針分別取大腸桿菌、變形桿菌少許穿刺接種于醋酸鉛培育基中, 經(jīng)37培育24小時。沿

50、穿刺線部位呈現(xiàn)黑色為陽性，無黑色出現(xiàn)為陰性。4色素的產(chǎn)生：原理：有些細菌在代謝過程中，可合成不同顏色的色素，有利于細菌的鑒定。色素分為兩類：脂溶性色素：僅菌落本身著色，培育基不染上顏色。水溶性色素：色素本身可溶解，浸透到周圍的的培育基中。細菌的色素，在室溫、有氧、含血清、牛乳等培育基中產(chǎn)生豐富。 方法：察看兩種細菌的色素，其顏色、特性等。實驗報告：1記錄上次雙糖鐵培育基、半固體培育基接種的結(jié)果繪圖并分析；2記錄玻片凝集實驗的結(jié)果繪圖并分析；3結(jié)合腸道致病菌的系列檢查結(jié)果作出最后鑒定。4. 記錄細菌代謝產(chǎn)物的察看結(jié)果繪圖并簡要分析： 單糖發(fā)酵實驗、硫化氫實驗、吲哚實驗。實驗十一 厭氧性細菌厭氧性

51、細菌是一大類專性厭氧，必需在無氧的環(huán)境下才干生長的細菌。一類是革蘭氏染色陽性有芽胞的厭氧芽胞梭菌；另一類是無芽胞的革蘭氏染色陽性及革蘭氏染色陰性的球菌與桿菌。前者致病菌主要有破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒桿菌等；后者臨床上以革蘭氏陰性桿菌多見，尤其是脆弱類桿菌。實驗?zāi)康模赫莆掌苽L桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的形狀特點。熟習重要的厭氧菌的培育特性。了解常用的厭氧培育方法。實驗資料：1破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的庖肉培育物。2產(chǎn)氣莢膜桿菌的牛乳培育基培育物。3高層培育基中的破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的培育物。破傷風桿菌芽胞染色、產(chǎn)氣莢膜桿菌莢膜染色示教片。實驗內(nèi)容：破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的形狀特征 1破傷風

52、桿菌細長桿菌，長48微米，寬0。30。5微米。有周鞭毛，可運動。無莢膜，芽胞球形，位于菌體頂端，直徑大于菌體，呈鼓槌或火柴棒狀，為本菌鑒定特征之一。早期芽胞和菌體染色一致，以后芽胞不易著色呈空泡狀。用芽胞染色法菌體染成藍色，芽胞染成紅色。繁衍體為革蘭氏染色陽性，但37攝氏度48小時后易變陰性。2產(chǎn)氣莢膜桿菌 兩端鈍圓，長48微米，寬11.5微米的粗大桿菌。散在或短鏈狀陳列。莢膜染色法可見肥厚莢膜；芽胞呈卵圓形，與菌體等寬，位于中央或次極端。無鞭毛，不運動，在人體后動物體內(nèi)可以構(gòu)成莢膜，自然界中以芽胞方式存在。繁衍體革蘭氏染色陽性。2. 破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的庖肉培育物。1破傷風桿菌：在庖肉

53、培育基中生長緩慢，厭氧培育27天后，培育基變混濁，產(chǎn)酸，肉渣部分消化微變黑，有少量氣體。生成的甲基硫醇、H2S等使培育物變臭。2產(chǎn)氣莢膜桿菌：在庖肉培育基中生長后，肉湯渾濁，肉渣不被消化，變成粉紅色，產(chǎn)生大量氣體，使液面固體石蠟推向上方。3. 產(chǎn)氣莢膜桿菌在牛乳培育基中的生長景象產(chǎn)氣莢膜桿菌在牛乳培育基中的生長時，能分解糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。產(chǎn)生的酸能把酪蛋白凝固，產(chǎn)生的大量氣體使凝固的酪蛋白呈蜂窩狀，大量氣體構(gòu)成的高壓使酪蛋白和隔絕氧氣的凡士林石蠟沖向試管口，氣勢洶涌，稱為“洶涌發(fā)酵景象，為本菌的特點之一。3破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒桿菌在高層瓊脂培育基中的生長景象分別把破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌

54、參與內(nèi)融化60攝氏度了瓊脂的試管中，冷凝、培育后察看結(jié)果：1破傷風桿菌：在高層瓊脂中生長后，產(chǎn)生少量氣體，瓊脂中下層有少量氣泡。2產(chǎn)氣莢膜桿菌：在高層瓊脂中生長后，產(chǎn)生大量氣體，沖散凝固的瓊脂，將瓊脂推向試管口。4. 常用厭氧培育方法的引見厭氧培育的方法很多，主要利用氣體交換、復(fù)原劑、催化劑等方法使培育基堅持無氧的環(huán)境和復(fù)原的形狀。1庖肉培育基培育法原理：庖肉培育基內(nèi)含肉渣、不飽和脂肪酸、谷胱甘肽等物質(zhì)，外表由凡士林隔絕空氣。其中，不飽和脂肪酸在氧化時可以耗費試管內(nèi)的氧氣，谷胱甘肽作為一種復(fù)原劑可以使培育基中的氧化復(fù)原電勢降低，有利于厭氧菌的生長。方法：取置備好的庖肉培育基在火焰上微加熱，使凡

55、士林熔化，在無菌條件下將厭氧菌接種，終了后再微加熱，最后將培育基直立于試管架上，使凡士林密封后，在37溫箱中培育。2焦性沒食子酸法原理：焦性沒食子酸與堿性溶液能迅速大量的吸收氧氣，生成棕色的焦性沒食子，它可以在任何密閉容器中快速呵斥無氧的環(huán)境。100毫升容器中：1克焦性沒食子酸+2毫升0。5克/毫升碳酸氫鈉方法：平皿法：在血平板上接種好厭氧菌，在皿蓋上鋪好薄紗布，將焦性沒食子酸0，5克置于紗布上，滴1毫升碳酸氫鈉，立刻將接種好的血平板扣在上面，并用熔化的石蠟密封周圍，置37攝氏度溫箱中培育。試管法：將厭氧菌接種于小試管內(nèi)，并在一大試管內(nèi)放入有焦性沒食子酸的玻璃珠，滴入碳酸氫鈉，迅速把小試管放入

56、大試管中去，并用橡膠塞塞緊，石蠟封口，置37攝氏度溫箱中培育。3厭氧罐法原理：厭氧罐是有塑料、有機玻璃或金屬構(gòu)成的圓描畫器，安裝有壓力表和通氣閥，可以抽換氣體，適宜于厭氧菌的培育。方法：抽氣換氣法：適宜于實驗室運用。將接種好細菌的平板或試管放入?yún)捬豕拗?，同時放入催化劑鈀和指示劑美蘭。擰緊蓋子，用真空泵抽氣，當指針到零時，灌入高純氮氣，如此反復(fù)23次，最后一次參與氫氣和二氧化碳的混合氣體。封鎖，37攝氏度培育。氣袋發(fā)生袋法：適宜于床邊接種和野外厭氧菌培育。除不需真空泵和氣體瓶外，其他設(shè)備與抽氣法一樣。利用兩種藥片：一種是枸櫞酸和小蘇打，另一種是硼氫化鈉。前者遇水釋放二氧化碳，后者遇水釋放氫氣。4

57、厭氧袋法將接種好的平板放入裝有發(fā)生管和美蘭指示劑管的透明不透氣塑料袋內(nèi)，擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎緊，然后折斷發(fā)生管，產(chǎn)生的二氧化碳和氫氣使氣袋膨脹，出現(xiàn)水滴。半小時后，袋內(nèi)化學反響完成，袋內(nèi)已無游離氧，此時折斷美蘭指示劑管，美蘭仍為無色，闡明厭氧環(huán)境構(gòu)成，可以人工厭氧培育。 實驗十二 結(jié)核桿菌結(jié)核桿菌為細長分枝桿菌，有分枝生長趨勢，不易著色，經(jīng)加溫或延伸時間后著色。一旦著色后又能抵抗鹽酸酒精的脫色，故又稱為抗酸桿菌。實驗?zāi)康模?. 掌握結(jié)核桿菌的形狀和染色特點。2. 了解結(jié)核桿菌的培育特性。3. 掌握抗酸染色法的操作和結(jié)果判別。實驗資料：1. 結(jié)核桿菌抗酸染色示教片，結(jié)核桿菌在改良羅氏培育基的培

58、育物，含結(jié)核桿菌的痰液。2試劑：石炭酸復(fù)紅染液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭3器具：顯微鏡、載玻片、酒精燈、試管夾、接種環(huán)實驗內(nèi)容：1. 結(jié)核桿菌的形狀和染色特性油鏡下：結(jié)核桿菌為細長或略帶彎曲的桿菌，有的呈分枝狀。單個存在或聚集成團。菌體被復(fù)紅染成紅色，其他細菌及背景物質(zhì)呈藍色。2. 結(jié)核桿菌的培育特性固體培育基的形狀：結(jié)核桿菌在接種的羅氏培育基上，37攝氏度培育46周，可出現(xiàn)乳白色或米黃色顆粒，外表粗糙，邊緣不整齊，較為枯燥鞏固，形似花菜狀的菌落。液體培育基內(nèi)的生長情況：結(jié)核桿菌為專性需氧菌，在液體培育基中呈皺襞狀表皮生長。3. 抗酸染色法1涂抹標本的制備在無菌條件下，用接種環(huán)取含有結(jié)核桿菌的少

59、許痰液，均勻涂抹于載玻片上；自然枯燥后；經(jīng)過火焰固定。2抗酸染色初染：將石炭酸復(fù)紅滴于方框中，使標本被充分浸潤，置于酒精燈火焰上方7、8厘米處，悄然加熱，當有水蒸氣冒出時，可再加少許石炭酸復(fù)紅，防止干涸，但也不能沸煮，如此加熱繼續(xù)5分鐘。冷卻后用水沖洗，甩干。脫色：用3%的鹽酸酒精數(shù)滴浸潤脫色，直至涂片無紅色染液脫下為止。繼續(xù)0.5分鐘左右。然后用水悄然沖洗，甩干。復(fù)染：加美蘭12滴，染色1分鐘，水洗，甩干，吸干。油鏡察看：結(jié)果見上節(jié)形狀描畫。附：改良羅氏培育基：磷酸二氫鉀1.2g，硫酸鎂0.12g，枸櫞酸鎂0.3g，天門冬素1.8g味精3.6g，甘油6ml，溶于300ml蒸餾水中。再參與馬鈴薯淀粉15g，沸水內(nèi)加熱，邊熱邊攪拌成糊狀。無菌操作將卵白、卵黃一同打成全卵液，取500ml參與。最后加2%孔雀綠溶液10ml，充分混合。分裝于滅菌的中試管內(nèi)，8560分鐘間歇滅菌2次。實驗報告：繪破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌形狀圖，并注明染色性和放大倍數(shù)。記錄抗酸染色的步驟和繪染色結(jié)果圖，注明染色性和放大倍數(shù)。實驗十三