實(shí)時(shí)熒光定量PCR概述課件

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR盧瑤瑤、黃志聰佘碧芳、李家威實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究概述問題誕生方法應(yīng)用原理誕生 實(shí)時(shí)熒光定量PCR( real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction, RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，即通常所說RT-PCR技術(shù)。原理1、非探針類（SYBR Green I 法） SYBR Green I 是一種結(jié)合于雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green

2、I 的最大吸收波長約為 497nm ，發(fā)射波長最大約為 520nm 。 在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。2、探針類（TaqMan探針法）方法熒光定量PCR方法的確定目的基因的查找和比對(duì)引物、探針的合成1.反應(yīng)體系的配置2.反應(yīng)條件的設(shè)定3.反應(yīng)體系條件的 優(yōu)化待測品的制備熒光曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析標(biāo)準(zhǔn)品的制備引物、探針 的設(shè)計(jì)按熒光產(chǎn)生的原理有兩種方法：熒光探針法和熒光染料法。染

3、料法 利用SYBR Green分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)來進(jìn)行樣品定量。與常規(guī)PCR類似，唯一區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBR Green染料分子。探針法：與常規(guī)PCR的不同之處在于：在上下游引物外還加入了讓具有序列特異性的探針（探針本身具有熒光標(biāo)記），該探針根據(jù)需要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)因此只能與待檢測序列結(jié)合，與染料法相比，提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。目前市場上探針多樣，其中以TaqMan探針應(yīng)用最為廣泛。 熒光素：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705 等1、熒光定量PCR方法和熒光標(biāo)記素的選擇與確定2、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對(duì)從/Genbank中查找并下載所需要的

4、序列。通過BLAST對(duì)該目的基因進(jìn)行對(duì)比，找出保守序列。3、引物的設(shè)計(jì)與合成：Primer Premier 5.0軟件 成 功4、探針的設(shè)計(jì)與合成：DNAstar軟件中的Seqman軟件 選擇高品質(zhì)的引物探針合成商。5、標(biāo)準(zhǔn)品的制備(1）選擇一個(gè)已知起始拷貝數(shù)（起始模板數(shù)）的樣品(2）反應(yīng)體系的配置(3）反應(yīng)條件的設(shè)置(4）反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化(1)、反應(yīng)體系的配置2022/8/20(2)、反應(yīng)條件的設(shè)定 95 預(yù)變性 2min 94 變性 30s 55-65退火 30s 72 延伸 30s 72 終延伸 5min擴(kuò)增30-40個(gè)循環(huán)(3)、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 酶濃度 Mg+濃度 dNTP濃

5、度 上、下游引物濃度 探針濃度 退火溫度、退火時(shí)間和循環(huán)數(shù) DNA模板濃度6、熒光曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作通過原理可知：總的熒光信號(hào)=本底信號(hào) + 分子數(shù) 單位信號(hào)強(qiáng)度 Rn = RB + X0(1+E) RS CTRn = RB+ X0(1+E) RS 當(dāng)n=CT值時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度 的變化的對(duì)數(shù)全部一致，都達(dá) 到了閾值。RT-RB = X0(1+E) RS lgX0 CTlg(1+E) =-lgX0 + lg(RT-RB)-lgRS CT a =-lgX0 + b2022/8/207、待測品的制備 將待測樣品放置在與標(biāo)準(zhǔn)品相同優(yōu)化后的體系、條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。8、通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

6、待測樣品的CT值可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程CTa=-lgX0+b求得待測樣品的起始模板數(shù),從而達(dá)到通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的效果。熒光PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)的研究2.基因表達(dá)差異分析 比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。 1.核酸定量分析 對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。3.SNP 檢測 檢測單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不

7、同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測將會(huì)變得簡單而準(zhǔn)確。4.甲基化檢測 甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報(bào)道了一種稱作 Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。 醫(yī)學(xué)研究1.產(chǎn)前診斷 人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連

8、鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。 2.病原體檢測 采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。 3.藥物療效考核 對(duì)乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過

9、程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。 4.腫瘤基因檢測 盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相關(guān)問題 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)于1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出后

10、, Heid等首先就其原理及方法進(jìn)行了報(bào)道。由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍, 而且與常規(guī) PCR 相比, 具有很多優(yōu)點(diǎn)，目前已在動(dòng)植物基因工程, 微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。但不可否認(rèn)，這種還算“年輕”的技術(shù)仍有需要改進(jìn)的地方。優(yōu)點(diǎn)特異性高：熒光探針的使用相當(dāng)于在PCR的過程中自動(dòng)完成了Southern印跡雜交，進(jìn)一步提高目的基因檢測的特異性。靈敏度高：光譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用提高了靈度，有效的減少了勞動(dòng)量，熒光定量PCR使用氬激光來激發(fā)熒光的產(chǎn)生，利用熒光探測儀檢測熒光信號(hào)，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析靈敏度達(dá)到了極限，可以檢測到單拷貝的基因這是傳統(tǒng)的PCR難以做到的。其靈敏度可檢測到 400 個(gè)分子的 mRNA。精確：能夠精確定量 對(duì)DNA擴(kuò)增過程進(jìn)行監(jiān)測，由于PCR擴(kuò)增效率的差異和平臺(tái)效應(yīng)，傳統(tǒng)PCR無法進(jìn)行精確的。減少污染：定量而熒光定量PCR 由于利用擴(kuò)增進(jìn)入指數(shù)增長期的Ct值來定量起始模板的數(shù)量 實(shí)現(xiàn)了精確的核酸定量檢測有效地避免了污染，傳統(tǒng)的PCR在擴(kuò)增結(jié)束后需要電泳或紫外光下觀測結(jié)果，除了易造成污染外，還對(duì)人