請教關于水稻愈傷組織的問題

1、組培常見英漢對照abortion（敗育）adenine（腺嘌呤）agar （瓊脂）anther（花粉）apical（頂端的）aseptic(無菌的) auxin（生長素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈傷組織）cellular totipotency（細胞全能性） cellulase（纖維素酶）cellulose（纖維素）centrifuge（離心）chloroplast（葉綠體） chromosome doubling（染色體加倍）colony（細胞團，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞質雜種） cytokinin（細胞分裂素） cyt

2、oplasm（細胞質）degeneration （敗育）dedifferentiation （脫分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（雙子葉的）dihaploid（二單倍體）diploid（二倍體）dissect（剝離）dormancy（休眠）eliminate （除去） embryo（胚胎）embryoid（胚狀體）embryogenesis（胚胎發(fā)生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植體）filter paper（濾紙） gelose（瓊脂糖）genetype（基因型）germplasm（種質） glo

3、bal embryo （球型胚） haploid（單倍體）heterokaryon（異核體）homozygous（純合的）hormone （激素）interspecific（種間的）intraspecific（種內的）in vitro（體外）in vivo（活體）kinetin（激動素）macerozyme（離析酶）male sterile（雄性不育）medium（培養(yǎng)基）membrane（膜）meristem（分生組織）meristem culture（莖尖培養(yǎng)）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（單子葉植物） n

4、od culture （莖段培養(yǎng)）organelle（細胞器）organgenesis（器官發(fā)生方式）osmotic（滲透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture（花粉培養(yǎng)）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球莖protoplast fusion（原生質體融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不親和） shoot tip（莖尖） sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（體細胞胚）somatic hybrid

5、ization（體細胞雜交）somatic hybrid（體細胞雜種）stem（莖）stem tip culture（莖尖培養(yǎng)）sterilant（消毒劑）sterile distilled water（蒸餾水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (繼代) sucrose（蔗糖） terminal bud（頂芽）transfer （轉移）virus eradication（脫毒） 常用縮略語ABA（脫落酸） CM（椰子汁） CPW（細胞-原生質體清洗液）DMSO（二甲基亞砜） IAA（吲哚乙酸） IBA（吲哚丁酸）KT（激動素） NAA（萘乙

6、酸） PEG（聚乙二醇）LH（液氮） CH（水解酪蛋白） GA3（赤霉素）一、請教關于水稻愈傷組織的問題:我的水稻愈傷組織經過轉化后，基本上不分化，聽說TDZ能幫助分化，請問是用TDZ完全代替KT，還是按一定比例加入？還有就是在分化過程中還需要再加入潮霉素和羧芐嗎？我用的水稻品系是臺北309，以前的分化培養(yǎng)基為MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧芐+50MG/L潮霉素。請查閱華南農業(yè)大學楊躍生老師的兩篇文章,發(fā)在水稻科學上的,上面介紹了二價銅離子在水稻離體培養(yǎng)中的作用植物生理學學

7、報，1998年第3期， 水稻高效轉化系統(tǒng)的建立二、關于外植體消毒我做蝴蝶蘭的花梗培養(yǎng)，用如下三法消毒，均有較多染菌，請各位指教，謝謝！方法一：75%酒精30s，剝去腋芽包片，0.1%升汞10min，水洗，2%次氯酸鈉20min，水洗接種。方法二：75%酒精30s，0.1%升汞15min，水洗，剝去腋芽包片，0.1%升汞8min，水洗接種。方法三：75%酒精30s，0.1%升汞20min，水洗直接接種。你先用自來水沖洗半個小時，然后用上述方法一。我不知道結果，我只是遇到一個老師曾經這樣做水稻組培中的問題及解決方法：1、做愈傷組織培養(yǎng)是一定要用植物膠（phytagel）嗎，可以用瓊脂粉代替可以嗎？

8、 還有在一些文獻里看到一個叫gelrite的東西，作用是不是也跟植物膠一樣啊？完全可以，就是沒有phytagel外觀漂亮。而且在做分化培養(yǎng)時，瓊脂粉的效果比phytagel還要好。gelrite就是植物凝膠我們實驗室用的都是瓊脂粉有一種叫卡拉膠的效果也不錯，比瓊脂粉還要便宜些。有一種叫卡拉膠的效果也不錯，比瓊脂粉還要便宜些。2、我是用水稻的幼胚培養(yǎng)的愈傷，轉化并共培養(yǎng)之后轉移到篩選培養(yǎng)基上，已經好幾天了，愈傷怎么越變越呈褐色了呢，是不是基因沒轉進去死啦？急?。№槺銌栆幌麓蠹?，構建好的載體導入農桿菌后都怎么做檢測啊？我就用菌液和抽的質粒做了PCR，同時還做了陽性和陰性對照，陰性對照是沒有擴增出目

9、的條帶的。這樣可靠嗎？我農桿菌用的是卡那和利福平雙抗性。有人告訴我還要把從農桿菌抽的質?；剞DE.coli，再抽質粒酶切檢測?？墒俏蚁耄绻懊娴腜CR是因為被含有該載體的E,coli污染才做出來的，那么回轉后酶切檢測的結果不是也不可靠嗎？變黑是死了.一般轉了以后我是先放20度三天,然后到28度再培養(yǎng)的.不過有時候我轉的不好也會黑了,死掉.正常的話顏色是不會變的.本來轉了以后就是一個篩選過程.關于檢測,你用你的agrobacterium的菌液做PCR就可以了,不用回接,麻煩的3、誰有水稻成熟胚和幼胚愈傷組織培養(yǎng)的protocol啊愈傷組織的培養(yǎng)其實就是培養(yǎng)基的配方問題吧。我們采用的是成熟胚培養(yǎng)的

10、，就是直接將成熟的水稻種子去殼后消毒播種到培養(yǎng)基上（有研究種子在培養(yǎng)基上斜插和平放對愈傷誘導影響的文章，你可以看一下，斜插是指胚端向外），大約10天左右在胚端長出愈傷組織，用手術刀切下（注意將一起長出的根切除干凈），放到同樣的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，愈傷長大一些后進行繼代培養(yǎng)，或直接可用于轉基因的研究。培養(yǎng)基的配方如下：N6大量B5微量B5有機MS鐵鹽2.4-D終濃度2mg/LL-脯氨酸500mg/L谷氨酰胺500mg/L水解酪蛋白300mg/L蔗糖30g/L膠8g/L這種培養(yǎng)基我們稱為NBD培養(yǎng)基，你可以在培養(yǎng)的過程中進行試驗、摸索，不同的水稻品種的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基中的激素濃度都可能有不同，這方面

11、的文獻也很多，上網搜一下。另外未成熟胚據說做起來更方便，只是我們這里條件不允許，你可以試試。植物凝膠更利于細胞增值和胚的生長，更適合植物的生長的條件，瓊脂的均一性相對來說要差一些，也可以用，但效果要差。我們做的植物愈傷組織培養(yǎng)一直都是用的瓊脂粉,感覺只要培養(yǎng)配方適合,愈傷長勢也會很好,影響不大4、共培養(yǎng)之后，用于清洗愈傷組織的無菌水中的頭孢濃度和選擇培養(yǎng)基中頭孢的濃度多少最好啊我上學期剛學做組織培養(yǎng)時做過兩次，都是清洗后放到選擇培養(yǎng)基后農桿菌又蔓延開了，有個師兄說選擇培養(yǎng)基中的頭孢應該濃度高點請高手指點一二，還有用愈傷組織轉基因還要注意些什么？共轉化后不用清洗就行，關鍵是抗生素種類和濃度，抑制

12、農桿菌我們一直用羧芐，或者跟頭孢一塊兒用；如果菌很多要三天換一次培養(yǎng)基，直至無菌。用愈傷做轉化受體，誘導愈傷的時間長短及生長狀態(tài)與再生有很大關系。5、種子消毒原來是先用酒精浸泡1min，后用20NaClO浸泡30min，然后無菌水清洗，結果還是染菌了好多，怎么做才好呢？還有，是用整粒種子培養(yǎng)好呢還是切掉一部分好？種子的挑選很重要，一定要挑透明、成色很好的種子。滅菌使用75乙醇1min，0.15HgCl 15mins，無菌水清洗。關鍵是種子質量要好，要挑好種子做才行。半粒米做可能會好一點，因為這樣污染的幾率就少了一半，不過我沒試過。如果種子質量好，就不用切了，好麻煩的。其實挺好做的，祝你好運！這

13、個問題我也遇到過,后來發(fā)現是我的消毒液有問題,買一瓶新的試試看還有,不要忘記加點土溫在種子浸泡的時候加點洗滌劑，有利于浸泡充分，而且同樣的，有時試劑過期了，消毒效果不好，最好再換一瓶試試，我也遇過同樣的問題，換新的消毒液就好了如果是用幼胚來做的話,先用70%-75%的酒精消毒1分鐘,后用無菌水清洗一遍,然后再用2%NaClO浸泡30min.再用無菌水洗數遍直到干凈,最后把放入慮皿把幼胚挑出來,即解剖種子,這樣愈傷會長得好,而且可以大大減少污染率.我這樣做幾乎不污染.嚴格要求每一步消毒步驟，包括工作臺，器皿，高壓滅菌的最好是先滅先用，不要用滅過菌方了很長時間的用7071%的酒精處理1020秒,0

14、.2%HgCl 710分鐘.無菌水清洗46遍,酒精不要處理太長,容易引起褐化.無菌水每次清洗1MIN左右.做之前種子要洗干凈.無論是種子或是莖段,塊根我都差不多用以上方法滅菌,一般不會污染.如果不成功的話,你應該考慮其他方面的原因了.祝你好運!6、我做基因槍轉化后恢復培養(yǎng)了一周左右的時間，之后篩選了兩周的時間，請問大家現在是否可以做分化，請教各位水稻分化培養(yǎng)基的配方，另外希望好心人給提供較完整的分化流程，同時各位高手能否提供一些關于水稻組培方面的書，不勝感激！7、現在有一個很嚴重的問題想請教做過水稻組培的前輩：我現在做的實驗水稻組培部分再生出現了問題，以前也看到別人在這里求助過同樣的問題。我的

15、水稻愈傷組織再生一個多月沒有反應，我的激素配方參考了一個博士的論文：預分化激素濃度6-BA 2mg/L，NAA 0.1mg/L，ABA 5mg/L，羧芐 300mg/L，潮霉素50mg/L分化激素濃度是KT2.5mg/L，NAA 0.1mg/L，羧芐250mg/L，潮霉素50mg/L我想問的是：1我的愈傷組織經過了好多次繼代，農桿菌轉化后也經過了好多次篩選，是不是這樣做對再生不利。2我在做分化的時候，燈管很熱，一般能達到34度（我都已經把空調調到16度了），這樣由于存在溫差我的瓶子上有很多水珠，這種狀態(tài)是否對我的實驗有很大影響先謝謝多次繼代對發(fā)苗一定會有很大影響。溫度和濕度會有一定影響，但應該

16、不會一棵苗也沒有，應該不是主要原因。另外還應該仔細問問各種培養(yǎng)基的配方，這些東西老師一般都不讓寫的臺詳細，畢竟都是半輩子才摸索出來的東西。你的預分化和分化培養(yǎng)基的成分太簡單了分化一般都不加羧芐 和潮霉素了，另外溫度太高肯定不行繼代的次數太多是關鍵，只繼一次的再生效果最優(yōu)，其他因素都不重要。如果第一次繼代后就再生，你會發(fā)現，即使條件再惡劣，PGR配比有些出入都會分化得很好的。8、水稻愈傷轉化后多久才能長出抗性愈傷?。课沂怯盟镜挠着吲囵B(yǎng)的愈傷，轉化并共培養(yǎng)之后轉移到篩選培養(yǎng)基上，已經好幾天了，愈傷怎么越變越呈褐色了呢，是不是基因沒轉進去死啦？急啊！順便問一下大家，構建好的載體導入農桿菌后都怎么做

17、檢測啊？我就用菌液和抽的質粒做了PCR，同時還做了陽性和陰性對照，陰性對照是沒有擴增出目的條帶的。這樣可靠嗎？我農桿菌用的是卡那和利福平雙抗性。有人告訴我還要把從農桿菌抽的質?；剞DE.coli，再抽質粒酶切檢測?？墒俏蚁耄绻懊娴腜CR是因為被含有該載體的E,coli污染才做出來的，那么回轉后酶切檢測的結果不是也不可靠嗎？剛轉化后在篩選培養(yǎng)生長是會變褐。因為你的大部分愈傷組織是沒有轉化的，在篩選培養(yǎng)基上（一般是潮霉素）未轉化的愈傷組織會變褐，如果你的轉化成?，F象，篩選的目的就是讓大部分未轉化的愈傷褐化死掉，轉化成功的愈傷在20天左右會有新鮮的愈傷長出，然后再經1-2輪篩選就可分化了9、水稻愈

18、傷組織的分化與光照的關系小第我在做水稻愈傷分化中遇到了點麻煩事情-用了很多種培養(yǎng)基都未能分化出植株來!苦惱死我了o,不知道是否是光照因素在作祟? 祈望有經驗者能指點迷津!謝謝!水稻的愈傷組織的分化要考慮溫度，一般在28度比較合適，還有高光強。水稻再生技術已經成熟，可能還是你的培養(yǎng)基配方的問題。10、現在我的水稻組培苗在培養(yǎng)瓶中，我想移栽到土里，現在不知道怎么練苗，在此求助練苗如何操作和步驟，先謝謝了（：個人感覺水稻很好活，幾乎不需要怎么煉苗，不過可能要視品種而定，煉苗的話就是在你種之前先把瓶子打開加一點水，放上兩天。之后把苗拿出來洗凈培養(yǎng)基，然后我們是先水培幾天，就是用一種方的容器，放入營養(yǎng)液

19、，上面蓋上硬塑料板，塑料板上有很多的小圓空，將水稻苗一棵棵用海棉包住根上面一點的莖的部分，種在小圓空里，記住營養(yǎng)液的pH值要在4.55.5之間，不能超過5.5，長的不好的話就要檢測你的pH值是否合適了，生長上一周后，就可以拿出來種在土里的，當然一定要有水的。那么，主要就是光照問題，水稻喜高光強，屋內陽光不能直射，光強不夠。移到外面就好了。有兩種方法：1）有組培苗的培養(yǎng)瓶開口，培養(yǎng)基上覆水，約1 cm，置于溫室3天左右，然后移栽到土中；2）先將組培苗水培半個月，水稻營養(yǎng)液要求pH 5，參考倪晉山（1985）的配方。待苗壯實后，移栽到土中。參考文獻倪晉山。 1985。 植物生理學實驗手冊（薛應龍主

20、編），上?？茖W技術出版社，63-64我用的是第二種方法，效果很好，但比較煩，要經常換營養(yǎng)液。我于2005年7月份通過組培獲得了一批水稻苗，在移栽的前一天打開試管塞，然后在中午2點左右移栽到方便碗中，當然方便碗中的土已經和好，放在空曠的屋子里面，就是一間民房的堂屋，也就是客廳拉，光線很好，就是不能直接得到陽光的照射。在移栽15天后，還不見苗長高，也不見生根，都無精打采，有的黃化，有的已經死了。我趕快把這些方便碗移到屋外的屋檐下，過了10多天，可還是不見好轉，只是有些壯苗還沒有死掉。移栽后每天下午我都澆少量的水，可不知道苗就這么死了。當初之所以用組培的方法培養(yǎng)，就是因為種子少，萬一不能通過自然發(fā)芽

21、而成活，那就損失慘重，可結果 還是都死了 。本來培養(yǎng)的苗長勢很好，可移栽后居然。請有經驗的戰(zhàn)友能詳細的講解一下，好嗎？計是肥料太多了，或者是用了生肥，燒苗了。重新去田間取土，再次移栽，移栽時可剪去部分葉子，以降低蒸騰。方便碗是什么？盛方便面的碗嗎？太小了，用市售的水桶吧。另請注意水稻生長的最適溫度是28度，喜光因為我要做數量性狀定位，一棵植株就是一個基因型，所以我用方便碗裝。方便碗就是我們在小餐館吃飯，盛飯的碗啦！方便碗里面的土沒有施肥，沒有加其他的肥料，所以還請大家能給點建議！ 其實首先你應該注意的事你現在在南方還是北方。在北方首先解決的是光照和溫度。光強低和15攝氏度以下水稻幼苗特別容易死

22、亡。如果沒有這些條件，最好讓苗待在無菌瓶中。如果這兩個條件解決了，就可以打開瓶口，瓶中加水，只要不把整個苗淹沒就行。1周后，看到培養(yǎng)基中有白色的較壯的根，就可以移栽了。移栽后最好不要用水浸泡幼苗的基部。等大了后，就可以了。11、哪位師兄師姐做過水稻的組織培養(yǎng)實驗,我最近在做這方面的實驗.但是現在我遇到非常棘手的問題:水稻愈傷組織得到了.因為我是在做轉基因實驗,我也通過基因方法把外源基因導入到水稻愈傷組織中,而接下來的愈傷組織分化實驗中出現了問題.愈傷組織在分化培養(yǎng)基上不分化,我都已經做了快兩個月了.真是愁死人了.我的分化培養(yǎng)基是: MS培養(yǎng)基 +2mg/L KT +0.2mg/L NAA.另外

23、我還試了N6培養(yǎng)基 +2mg/L KT +0.2mg/L NAA.同時加了篩選激素:潮霉素.希望哪個師兄師姐幫幫忙.給我提些建議和意見.在次先謝謝了細胞分裂素試一試TDZ，作一個TDZ的梯度，NAA的濃度不變TDZ一般和BA、KT搭配使用效果會好些，當然不同的植物對不同的激素種類的敏感性是不同的，所以你要多試。可以少加或者不加潮霉素我們實驗室用的水稻愈傷分化配方是MS+6-BA: 2mg/l+NAA: 0.2mg/l+Zeatin: 0.2mg/l+KT: 0.5mg/l，效果挺好的，你可以試一下。12、Nitsch &Nitsch (1969)培養(yǎng)基1. 無機鹽KNO3 950 mgLNH4

24、N03 720mgLKH2PO4 68 mg/LCaCl22H2O 166 mg/LMgSO47H2O 185mg/LFeSO47H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/LMnSO44H2O 25mg/LH3BO3 10 mg/LZnSO47H2O 10mg/LCuSO45H2O 0.025mg/LNa2MoO42H2O 0.25 mg/L2.有機物維生素H(生物素) 0.05 mg/L肌醇 100 mg/L維生素B1 0.5mg/L煙酸 5 mg/L維生素B6 0.5 mg/L甘氨酸 2.0 mg/L葉酸 5 mg/L蔗糖 20 gL13、組織培養(yǎng)中植物激素的ELIZA檢

25、測方法所用試劑盒在哪里買？美國Agdia公司的產品：1.Abscisic Acid (ABA) 脫落酸檢測試劑盒2.Dihydrozeatin Riboside (DHZR) DHZR檢測試劑盒3.Indole-3-acetic Acid (IAA) 吲哚-3-乙酸檢測試劑盒4.Isopentenyladennosine (IPA) IPA檢測試劑盒5.Trans-Zeatin Riboside (t-ZR) 轉移玉米素糖甙檢測試劑盒競爭性酶聯免疫方法，96次檢測。14、第一節(jié)馬鈴薯的組織培養(yǎng)馬鈴薯(Solanum tuberosum)是一種全球性的重要作物,適應性廣,營養(yǎng)價值高，耐貯藏運輸，

26、成為一種重要的糧食作物之一，也是一種調節(jié)市場供應的重要蔬菜。馬鈴薯原產拉丁美洲，當被發(fā)現可以食用后，很快傳到世界各地，成為栽培很廣的一種作物。但是，發(fā)現從外地引種栽培12個周期后，明顯發(fā)現產量降低，植株變矮，并有卷葉和花葉退化現象產生，這便是由于病毒引起的退化現象。危害馬鈴薯的病毒有17種之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、奧古巴花葉病毒、紡綞形塊莖病毒。由于馬鈴薯是無性繁殖作物，病毒逐代積累，日益嚴重，引起嚴重退化。馬鈴薯卷葉病毒和馬鈴薯Y病毒的一些株系，可使塊莖產量減少5080%。法國Morel和他的同事們，1955年從患病馬鈴薯植株得到了無病植株，為治療作物病毒開避了新途徑。

27、一、馬鈴薯的形態(tài)特征和生物學特征（一）馬鈴薯的形態(tài)特征1根馬鈴薯的根系由初生根和匍匐根兩部分組成。初生根在塊莖發(fā)芽后從基部發(fā)生，構成其主要吸收根系。隨著芽的伸長，陸續(xù)在芽的各個葉節(jié)處匍匐莖的兩側及下方發(fā)生匍匐根，水平生長。2莖馬鈴薯的莖分地上和地下兩部分，地上莖的主莖在形成16片葉子后，由花芽封頂，并在花的下部發(fā)生兩個側枝，從而構成馬鈴薯的主要同化系統(tǒng)。地下莖包括主莖的地下部分、匍匐莖和塊莖。塊莖與匍匐莖相連的一端叫薯尾或臍部，另一端叫薯頂，塊莖表面分布著芽眼。薯頂芽眼分布較密，發(fā)芽早，發(fā)芽勢強，即具頂芽優(yōu)勢。生產上的整薯播種、帶著頂部芽眼切塊，都是發(fā)揮頂芽優(yōu)勢的有效措施。3葉馬鈴薯先出土的葉

28、是初生葉，全緣，心臟形。以后發(fā)生的葉為奇數羽狀全裂單葉，在葉柄基部與主莖相連處著生有托葉。4花馬鈴薯的花為聚傘花序，第一或第二花序開放，恰是塊莖強盛膨大之時，此時是需要不斷澆水的形態(tài)標志。5果實、種子馬鈴薯果實為球形或橢圓形漿果。種子小，扁平腎形。種子可用來繁殖，但后代性狀分離大。（二）生物學特性馬鈴薯性喜冷涼氣候，不耐高溫和霜凍，解除休眠的塊莖4下發(fā)芽，發(fā)芽適溫1218。地上莖葉生長適溫1721,25以上時生長不良，葉變小，超過30和7以下莖葉停止生長，1時受凍。塊莖形成要求晝溫1424，夜溫1214，土溫1618。土溫20以上時塊莖形成緩慢，而且容易引起退化，高溫下養(yǎng)分多用于芽和匍匐莖生長

29、而不易形成塊莖，2530時已經長成的塊莖也會消失而變成細長莖。結薯期要求12小時左右的短日照和松、濕潤、肥沃及通氣性良好的土壤條件。土壤板結，薯塊表面粗糙和薯形不正。馬鈴薯生產中普遍存在有種性退化問題，表現為植株長勢衰弱，株形矮化，分枝變少，薯塊變小，產量逐年下降，造成退化的原因和學說多種，綜合而言，主要是薯塊生長錐細胞發(fā)生階段性衰老而導致種性退化，而病毒和細菌病害的浸染，以及肥水、營養(yǎng)條件不良等都會加劇其退化程度。二、馬鈴薯脫毒技術馬鈴薯在營養(yǎng)繁殖時易受病毒的浸染，當條件適合時，病毒就會在植株內增殖，轉運和積累于所結塊莖中，隨著世代傳遞，病毒危害逐年加重，一般可造成減產50%以上。研究發(fā)現，

30、有30多種病毒感染馬鈴薯，并引起品種退化，嚴重影響到馬鈴薯生產。通過微莖尖組織培養(yǎng)技術能從馬鈴薯體內脫除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM 、PSV等病毒。因此，采用組培技術，通過一定良種繁殖體系，生產優(yōu)質種薯，是保證馬鈴薯高產、穩(wěn)產的一項有效措施。（一）脫毒種薯生產程序采取微莖尖組織培養(yǎng)的方法，誘導出苗，采用酶聯免疫吸附試驗法或指示植物方法鑒定馬鈴薯病毒和類病毒，經鑒定后，無主要病毒及類病毒的試管苗可定為脫毒試管基礎苗。試管基礎苗在無菌條件下，采用固體、液體培養(yǎng)基相結合方法，進行擴繁基礎苗，在防蟲網室栽植或封閉溫室扦插，生產出原原種(或稱脫毒小薯)。用原原種在一定隔離條件下生產

31、原種1代，以后逐級稱為原種2代、良種1代、良種2代。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒1取材和培養(yǎng)一般多采用在室內發(fā)芽，芽經熱處理(38)2周。然后取頂芽或側芽的1cm的莖尖，在自來水下沖冼1小時左右，無菌條件下先用95%酒精迅速浸潤組織，再用5%漂白粉溶液浸泡510min,然后用無菌水沖冼23次。為了減少污染機會，可將塊莖徹底消毒后，放在無菌容器培養(yǎng)，然后再去取莖尖。分離莖尖時，把消毒好的芽放在解剖鏡下仔細剝離，逐層剝去幼葉，露出圓滑的生長點，可以留個葉原基，隨即接種于MS液體培養(yǎng)基上，每升加0.1mgIAA、0.1mgGA3、pH5.8。也可White培養(yǎng)基，附加0.11mg/L的NAA和0.05mg/L

32、的BA。培養(yǎng)條件：2125、3000Lx、16h/d。2繼代和生根培養(yǎng)成功的馬鈴薯脫毒苗，經鑒定后，采用固體、液體培養(yǎng)基相結合方法擴繁。取試管苗單節(jié)切段扦插在固體培養(yǎng)基上，每瓶可插20個左右莖段，經20天左右使可發(fā)育成510cm高小植株，可再進行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖58倍，試管苗多節(jié)接種在液體培養(yǎng)基上，進行淺層靜止液體培養(yǎng)。試驗表明：多節(jié)液體培養(yǎng)試管苗比固體培養(yǎng)基生根快，長的粗壯，便于栽植，同時省去大量瓊脂，降低成本，提高試管苗成活率。培養(yǎng)基可用不加任何激素的MS。培養(yǎng)基中的煙酸、肌醇都可以減去，瓊脂濃度也可降低。切段繁殖的速度很快，在2528，光照強度30004000Lx，連續(xù)光

33、照的條件下，一般每月能增加78倍。為增強試管苗對溫室內環(huán)境條件的適應能力，移植前對試管苗要進行光、溫鍛煉。煉苗期溫室內的溫度：白天2327，夜間不低于10。煉苗的具體方法是：移植前7天左右，將長有35片葉、高23cm的試管苗，在不開瓶口狀態(tài)下，從培養(yǎng)室移至溫室排好。為防止強光、高溫灼傷試管苗，在溫室頂上加蓋一層黑色遮陽網。一般不能全遮，以使溫室內仍保持有一定光照和較高的溫度，并在擺放試管苗的畦內澆上水，維持試管苗周圍的濕度。移至溫室的試管苗，盡管仍處于封口的瓶內，但由于封口膜透氣性好，瓶內的濕度下降，使試管苗的莖葉變硬，加上光照增強，莖稈變粗，葉片肥厚濃綠，有效地抑制了徒長和真菌的侵染，從而提

34、高了試管苗的抗逆性和對環(huán)境條件變化的適應能力，提高了移植成活率。移植時，將裝好基質的營養(yǎng)缽緊密地排放于溫室內已整好的陽畦內，可采用珍珠巖作為基質，有條件的話，也可采用滅過菌的疏松土壤。每1m2排放營養(yǎng)缽300個左右。排好后用噴壺澆透水，將經光、溫鍛煉好的試管苗從瓶內用鑷子輕輕取出，放到15左右的水中洗去培養(yǎng)基，放入盛水的容器中，隨取隨扦插，防止幼苗失水萎蔫影響成活。大的幼苗可截為兩段，每個營養(yǎng)缽內插一個莖段，因莖尖生長比下部莖段上的腋芽生長快，為生長整齊，互不影響，上部莖尖段和下部莖段分別扦插到不同缽內。苗高不足25cm的不再截段，直接移植到另一畦內。扦插時莖段插入營養(yǎng)缽表土下12個莖節(jié)，露出

35、土面l2個帶葉莖節(jié)（莖尖） 土表上莖節(jié)處的腋芽（頂芽）形成幼苗的莖葉、下部莖節(jié)發(fā)生新根，即形成一株完整的脫毒苗，供將來切繁的基礎苗。扦插完成后隨之撒少量營養(yǎng)土，然后用細霧水噴澆，使扦插莖段同基質很好接觸，以免使莖段裸露土表不能成活。隨后用廢報紙蓋好，遮光保濕23d，莖段生出新根后將覆蓋的報紙及時去掉。扦插的基礎苗成活后，其水分、溫度及養(yǎng)分管理應根據氣候變化和苗情而定。一般情況下，扦插后最初幾天，每天上午噴一次水，保持幼苗及基質濕潤。但噴水量要少，避免因澆水過多造成地溫偏低而影響幼苗成活和生長。切忌暴熱時間涼水噴苗。為提高水溫，可提前用桶存水于溫室中。隨幼苗生長逐漸減少澆水次數，但每次用水量逐漸

36、加大。此外為保持溫室內始終有較高的濕度，以防幼苗莖皮硬化，影響切繁效果，在育苗不需要澆水的時候，應將溫室內所有空地全都澆上水，在幼苗生長及整個切繁期，溫室內的相對濕度保持在85以上，氣溫白天控制在2528，夜間保持在15以上?；A苗切繁前和培育大田定植苗，一般不再追肥。但基礎畝開始切繁后23d要噴一次營養(yǎng)液，此后每隔10d噴一次，直至切繁終止（見表131）表131 營養(yǎng)液的成分及用量成分KNO3-NH4NO3MgSO47H2OKH2PO4CaCl22H2O濃度(mg/l)950800180852203脫毒苗切繁基礎苗成活進入正常后便可切繁，但切繁數量的多少和質量的高低，除與前邊提到的水、溫、濕

37、度條件有關外，能否掌握正確的切繁方法和適宜的切繁苗齡也是非常重要的。脫毒苗切繁主要是剪取頂部芽尖莖段（主莖芽尖和腋芽芽尖）直接扦插。正確的切繁原則是：保證每次剪切后，基礎苗仍能保持較好的株型和營養(yǎng)面積與較多的莖節(jié)，不僅生長正常，而且又能萌發(fā)出多個腋芽供下次剪切，具體方法是：扦插后15天左右，當基礎苗長有45個展出葉、苗高354cm時進行首次切繁。從基礎苗莖基部上數23個莖芽(葉)上方，用鋒利刀片將上部莖芽切下(芽段不小于1cm)，扦插到澆透水的營養(yǎng)缽內。培育供大田定植的脫毒苗，也可作為供切繁的基礎苗。如生產脫毒小整薯，可直接扦插到用營養(yǎng)土作好的畦床上或備好的專用的無土培養(yǎng)盤中，扦插方法與扦插后

38、的管理同試管苗扦插和管理。第一次剪切后10d左右，基礎苗上萌發(fā)的腋芽長大時進行第二次切繁，同第一次一樣，將剪取腋芽基部的第一個葉節(jié)留下繼續(xù)萌發(fā)腋芽，將上部莖尖芽段剪下扦插。如基礎苗上除剪取的腋芽外，仍有多個未萌發(fā)腋芽，將上部莖尖芽段剪下扦插。如基礎苗上除取的腋芽外，仍有多個未萌發(fā)或未長大的腋芽時，可將腋芽全部切下。如果是高位腋芽，要連同著生腋芽的莖段一起剪下，以便基礎苗始終保持較好的、有利于繼續(xù)切繁的株型，延長切繁期。以后無論切繁多少次，其方法和原則相同。在生產需要，時間允許，所有切繁培育成的脫毒苗均可作為基礎苗進行切繁?；A苗最后一次切繁時，除最基部留下一個莖芽外，其余無論大小，全部剪下扦插

39、，并將多余的莖、葉清除，使其發(fā)育成一株正常的脫毒苗供大田定植。三、馬鈴薯無病毒苗的鑒定（一）指示植物鑒定在馬鈴薯的病毒鑒定中，汁液鑒定是最常用的方法，X病毒、S病毒和紡綞塊狀病毒很易通過汁液來接種。Y病毒、M病毒和A病毒等也可用此法接種。1鑒定寄生的準備馬鈴薯病毒的寄生范圍寬窄不一，如卷葉病毒只能感染茄科植物少數幾個種。而X病毒除茄科外，還能感染莧科的千日紅，藜科的莧色藜等。馬鈴薯常用的鑒定寄生植物有莧科的千日紅，茄科的洋酸漿、毛曼陀羅等。寄生植物應在無蟲網室中培養(yǎng)，溫度控制在1525，提供充足的肥、水、光等條件，保證幼苗茁壯，生長迅速。系統(tǒng)發(fā)病來鑒定寄生，一般用35片真葉的幼苗，局部發(fā)病的寄

40、主利用充分展開的葉片。每個病毒樣品可接種3株，并做好標記。2接種液制備及接種一般以表現病狀明顯的葉作為接種材料。葉片洗凈后，在消毒的研缽中研成糊狀，用紗布濾出汁液，再以蒸餾水稀釋10倍作為接種物，以防過濃的汁液對鑒定寄生產生傷害作用。在鑒定寄生植物的葉面上均勻地噴布600目的金剛砂，也可將金剛砂少許混入接種物中，然后用左手心緊靠在寄生葉片的背面，以右手食指蘸取接種液，均勻的在葉正面擦過，以不造成葉片產生傷痕為度，最后把葉面上多余接種物用水沖去，放置在1524的防蟲溫室，一般510天可發(fā)病。3培養(yǎng)鑒定局部壞死斑寄主：產生局部壞死斑的寄主對鑒定馬鈴薯病毒特別有用（表132）（二）嫁接鑒定法是通過嫁

41、接傳播病毒來進行鑒定。嫁接方法有枝條嫁接和塊莖嫁接兩種。枝條嫁接與一般使用的方法相似，可把馬鈴薯的病枝嫁接到鑒別寄主上去。塊莖嫁接是馬鈴薯病毒工作中常用的方法，取病塊莖和健塊莖若干，以13。5mm直徑的打孔器，由病塊莖上打出一不帶芽眼的柱狀組織；再用l3mm直徑的打孔器由健塊莖上打下一帶芽眼的柱狀組織。把病塊莖上打下的病組織放入健塊莖的孔洞中，病組織的直徑稍大，以便組織間能緊密接觸，病組織的維管束應與健塊莖的對齊，有利于愈合傳病。嫁接好的塊莖浸入熔化的（但不很熱）低熔點石蠟中，以覆蓋受傷的表面，防止干縮。健塊莖上取下的帶芽眼的組織和打洞的病塊莖也用石蠟覆蓋受傷面，分別播種在花盆中，觀察植株的發(fā)

42、病情況。四、馬鈴薯無病毒株的繁殖和保存（一）無病毒株的繁殖通過莖尖培養(yǎng)只能得到很少的無病毒植株，而生產上需要數以萬計的健康種薯。同時無病毒植株并沒有對該病毒獲得免疫能力，仍會在繁殖中受病毒再侵染。如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很關鍵的一環(huán)。目前在生產上來用的方法很多，下面介紹主要的幾種。1直接塊莖繁殖這是常用的方法，把少量無病毒小苗直接移入無蟲網室的土壤中，利用產生的塊莖繼續(xù)繁殖，并進行嚴格的病毒鑒定，一旦發(fā)現受病毒再侵染，即行淘汰，將經過56次繁殖的無病毒塊作一級原種，提供大田繁育體系作進一步擴大繁殖。2扦插繁殖把無病毒植株栽于無蟲網室的營養(yǎng)缽中，12個月以后切頂芽作插枝。切去頂芽后，又

43、促進了側芽發(fā)生，很快長成側枝。扦插時，將插枝的最下面一片葉除去，插入經過消毒的沙壤土中，插入深度為兩個節(jié)間。在插后一周時間內，維持土壤濕潤，插枝就能產生新根。有些插枝地下部分會結出塊莖，應及時除去，否則這些插枝不能生根，最后會枯死。經過兩周多的生長時間，插枝就可以移栽，或供作進一步切取插枝的母株，或讓其結塊莖提供一級原種。母株應經常更新，防止因太老導致生根困難。3組織培養(yǎng)切段繁殖這種方法如前所述。其優(yōu)點是速度快，完全避免了所有病毒源再侵襲的可能。（二）無病毒株的保存利用試管保存無病毒植株資源是一有效途徑。試管植株體積小，占用的空間少，可大量地保存植株。長期保存馬鈴薯無病毒試管植株的方法有二：1

44、繼代培養(yǎng)對保存的無毒苗不斷地繼代培養(yǎng)，每個品種可以接種210瓶。為便保存可選用較大的150ml三角瓶，內加入一半以上體積的培養(yǎng)基。其瓊脂含量要高于一般培養(yǎng)基，可用不含激素的基本培養(yǎng)基，并加入10ppm的激素，以延緩小苗生長。每瓶接種23個切段。培養(yǎng)溫度可在525，在較低溫度下，保存的時間更長。用不含激素的基本培養(yǎng)基。光照1000Lx。這樣每隔23個月繼代培養(yǎng)一次，達到保存的目的。2低溫保存當試管的植株長至2cm左右，放入4冰箱中，放在暗處保存，可達一年左右。五、栽培管理（一）催芽播種須經催芽處理，方法是播種前3040天，將選好的健康種薯裝入袋或筐內，放1518和空氣相對濕度60% 70%的火炕

45、上或大棚內710天，促進芽萌動。然后將種薯攤晾在光照充足的地方或室外，厚度以23層種薯為宜，保持1518和70%80%空氣相對濕度，晚間收回。經1520天，能形成0.51.5cm長、紫綠色粗壯的幼芽，芽基部已發(fā)生根尖和莖的原始體。將催芽種薯縱切成45塊，每塊25g左右，帶12個芽。切口抹草木灰，放20和80%90%空氣相對濕度下，促傷口愈合，防塊莖腐爛。（二）播種和管理3月中旬左右播種，密度為60701530cm,開溝10cm深，播后覆土平溝，增強保墑。干旱時，播前或播后澆水。播后覆蓋地膜，可早出苗和增加產量。春薯可和棉花或玉米間作。 春薯管理的重點在于促進早出苗、早發(fā)棵、早結薯。80%出苗時

46、中耕松土，提高地溫。齊苗后半月左右，行間撒硫酸銨1012Kg ,后澆水中耕，促發(fā)苗和長棵，迅速形成莖葉和地下匍匐莖。發(fā)棵初期施肥，以后適當控制肥水，地不旱不澆，多次淺耕保墑，防植株旺長而延遲結薯。封壟前大培土一次，培土高1215cm，不埋沒主莖的功能葉。開花后地下塊莖膨大，要求濕潤疏松的土壤，在初花、盛花和終花期連澆三次水，這時期缺水會明顯減產，后期可減少澆水， 更不能大水漫灌。收前57天停水促薯皮老化，以利貯藏。第二節(jié)番茄的組織培養(yǎng)一、番茄的形態(tài)特征和生物學特性（一）形態(tài)特征：草本植物，苗期直立生長，成熟期呈匍匐蔓生狀態(tài)，植株高大，生長勢強。番茄莖節(jié)上還能長出不定根，如將一段枝條剪下，能發(fā)育

47、一株新個體，番茄的葉片為長羽狀，在葉軸上生有側生裂片，頂生裂片，小裂片，間裂片，這些裂片是葉的深裂，缺刻的深化。兩性花，聚傘花序，小果型品種多為總狀花序。番茄種子為扁平短卵形，在一端的邊緣有一個向內凹陷，種子外面覆以粗毛，呈褐色或黃褐色。種子地較小，壽命34年。（二）生物學特性：番茄屬于喜溫性蔬菜，較耐低溫，但不耐炎熱，在月平均溫度1825的季節(jié)里生長良好，為喜光性作物, 需1214h/d，光強4000050000Lx。對水分需求量極大，要求土壤濕度在6585%，空氣濕度50%60%為宜，番茄對土壤條件要求不嚴格，肥沃的壤土利于高產，此外在有機肥充足的情況下，通氣良好的砂壤土也能獲得高產。番茄

48、對土壤要求酸堿度是pH 57，適于微酸性或中性土壤。番茄是最需肥的一種作物，據測，畝產5000kg番茄 ,需吸氮17kg，磷5kg，鉀26kg。二、番茄的組織培養(yǎng)（一）花藥培養(yǎng)1取花藥長約37mm 、花粉粒處于單核中期的花蕾。2將花蕾用萬分之一的吐溫40水溶液浸泡5min，用水沖洗，再浸于70的酒精中15s，立即轉入有效氯3的漂白粉溶液滅菌10 min，經無菌水沖洗后，進行接種。3從花蕾中取出花藥，接種在DBMII20mgL NAA10 mgLKIN的培養(yǎng)基上，放在27和24h光照后黑暗下培養(yǎng)。4經約20天培養(yǎng)，有25的花藥形成了愈傷組織，但因品種而異。5產生的愈傷組織可在DBMIII十50

49、mgL NAA01 mgL KIN的培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，使愈傷組織增殖。6接種在DBMI 0l mgL NAA2 mgL KIN的培養(yǎng)基上，放在16h光照和27下培養(yǎng)?？烧T導苗的分化。7分化的苗要及時轉到H或MS十02 mgLIAA2蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此時苗生長健壯，2周后長出根，形成完整植株。（二）葉培養(yǎng)1取無菌幼嫩葉片，切成55mm的小塊。2接種在MS02mgLIAA2mgLBA的培養(yǎng)基上，放在27和光下培養(yǎng)。325天后開始發(fā)生芽的分化，芽從葉塊切口的愈傷組織周緣及表面分化形成。一個月后每個切塊約長出25個芽。4芽轉到無激素的MS培養(yǎng)基上，510d后形成根。（三）原生質體培養(yǎng)1從生長在7

50、000Lx、16小時光照下的植株，取第一片真葉葉片，用8Domestos消毒25min，無菌水沖洗5次。2撕去下表皮，放在質壁分離液中一小時。分離液的組成是：019mmolKH2PO4，lmmolKNO3，10lmmol CaCI22H2O，1mmolMgSO47H2O，096umolKI，O1umolCuSO45H2O（CPW鹽），05mol甘露醇。PH57。3取出葉片放在酶液中，在27和黑暗下保溫13h。酶液的成分是：15Meicelase，015Driselase和15Macerozyme的上述分離液中。4過濾除去葉碎片。5懸浮液用100g離心4min。6將原生質收集于06mol蔗糖的C

51、PW鹽液中，100g下離心 8 min。7把原生質體密度調到 2105個ml，和等量的含1瓊脂的改良B5培養(yǎng)基混合，在5cm培養(yǎng)皿中制成平板培養(yǎng)。放在黑暗、30下7d，再轉到27和800Lx光下培養(yǎng)。828天后產生出小細胞團，并每兩周間隔逐步降低甘露醇濃度。9把愈傷組織移到 MS10mgL ZEA的苗再生培養(yǎng)基中，每月繼代一次，直到再生成苗。10苗高4cm時，移到MS十30 mgLIAA的培養(yǎng)基中誘導生根。（四）胚培養(yǎng)1外植體的制備授粉后3040d收獲果皮完整的果實，果實放入95%乙醇中表面消毒，浸在5%NaCl中5min，用無菌蒸餾水充分淋洗。果實放在無菌吸水紙上，除去種子上的膠狀復被。2培

52、養(yǎng)基MS培養(yǎng)基類。按常規(guī)加蔗糖、肌醇、維生素和瓊脂，并附加硫胺素3.0um。pH調節(jié)到6.0。用附加2.4D9.05um,IiP4.92um和椰乳100ml/L的MS用做愈傷組織啟動和保存培養(yǎng)基。愈傷組織培養(yǎng)基不加維生素。芽再生培養(yǎng)基附加9.12um，蔗糖濃度降到32%，生根培養(yǎng)基不加激素。3培養(yǎng)條件愈傷組織啟動和保存，用暗培，27。愈傷組織在2周內產生。當見其生長時，應立即繼代在新的培養(yǎng)基上。經23周后，把增殖的愈傷組織分成幾小塊，放在再生培養(yǎng)基上。芽再生和生根在室溫2030、16h/d，熒光下進行。每3周芽再生培養(yǎng)一次。3個月內可取得芽，再過三周生根。三、栽培管理（一）育苗播種前種子需進行

53、處理：可用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡種子30min，或用10%磷酸三鈉溶液浸泡種子4045 min，以預防其它病害，促使幼苗健壯生長，防止徒長，還可以采用2.5kg水加5g敵壯索、7g鉬酸銨和7g瑞毒霉混合液浸泡45h。把浸過的種子移至2530條件下催芽，催芽之間要有充足的空氣，經常檢查和翻動種子并每天用淺水沖洗120次。如此經23d即可發(fā)芽。如若在番茄二葉一心時分苗，播種密度為每平方米1015g，如一葉一心時分苗，則播種密度為1520g，播種前床內灌足底水，灌水量以床土810cm深的土層為宜。然后采用撒播，條播或點播的方法播種，種子上覆適量的土即可。播種后，使床溫在白天保持528，夜溫在15以上，當番茄幼苗出土70%左右還應注意通風換氣。當第一片真葉生長時即可分苗。即播種后2535天進行，分苗后白天溫度在2530間，夜晚1518間，當幼苗67葉時可進行移植。定植密度為5030cm或5033cm。定植