齊魯醫(yī)學外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)與成骨細胞活性鑒定

1、精品醫(yī)學文檔 精品醫(yī)學文檔 精品醫(yī)學文檔 兔脂肪干細胞體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及成骨活性鑒定的實驗研究張開剛1 張月東1 王玫2（1.泰安市中心醫(yī)院骨科，山東泰安271000 2.泰山醫(yī)學院，山東泰安 271016）【摘要】目的 體外分離培養(yǎng)兔脂肪干細胞，在成骨誘導(dǎo)條件下，鑒定其成骨活性。方法 取4月齡新西蘭大白兔腹股溝區(qū)脂肪,型膠原酶消化,分離、培養(yǎng)及傳代原細胞, 將第3代ADSCs消化后，加入成骨培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化,分別行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、Von Kossa（鈣結(jié)節(jié)）染色鑒定分化結(jié)果.結(jié)果 體外分離培養(yǎng)的細胞增殖活躍，成骨誘導(dǎo)后檢測堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、Von Kossa（鈣結(jié)節(jié)）染

2、色均呈陽性表達。結(jié)論 脂肪干細胞具有成骨分化能力, 是一種理想的骨組織工程種子細胞?！娟P(guān)鍵詞】脂肪干細胞；成骨誘導(dǎo)；種子細胞An experimental study of osteogenic culture in vitro and identificating the osteogenic activity of rabbit adipose-derived stem cells ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2（1.Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shando

3、ng Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016）【Abstract】Objective Separating and Culturing rabbit adipose-derived stem cells，identificating the osteogenic activity in osteogenic conditions.Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits aged 4 months, Using I collage

4、nase digestiong, separating, culturing and passaging of the original cells, adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation after digesting the 3rd generation ADSCs, then identificating the differentiation results by alkaline phosphatase staining、alizarin red staining、Von Kossa (calciu

5、m nodules) staining.Results The cells of Separating and Culturing in vitro were active, the alkaline phosphatase staining、alizarin red staining and Von Kossa (calcium nodules) staining were both positive expression after osteogenic.Conclusion Adipose derived stem cells have the ability of Osteogenic

6、 differentiation,they are an ideal seed cells for bone tissue engineering.【Keywords】Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed CellsAn Experimental study of Adipose stem cells cultured in vitro osteogenic and osteogenic activity identification ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2（1.Department

7、 of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016）【Abstract】Objective Isolation and Culture of adipose stem cells in osteogenic conditions to identify osteogenic activity. Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits

8、aged 4 months, Using I collagenase digestion, separation, culture and passage of the original cells, the 3rd generation ADSCs after digestion, by adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation, alkaline phosphatase staining were performed, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nod

9、ules) staining differentiation results. Results Proliferation of isolated and cultured cells cultured in vitro Active is active, Detection of bone alkaline phosphatase staining after induction, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nodules) were both positive for expression. Conclusion Adipose d

10、erived stem cells have the ability to differentiate into bone, it is an ideal seed cells for bone tissue engineering.【Keywords】 Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed Cells脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細胞，2001年，Zuk1等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了具有與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能的脂肪干細胞。因具

11、有來源豐富、取材方便、對機體的損傷小、增殖快、能多向分化等優(yōu)點,迅速成為組織工程學、再生醫(yī)學等領(lǐng)域的研究熱點。本實驗通過分離培養(yǎng)兔脂肪干細胞，研究其成骨分化能力，探討其作為骨組織工程種子細胞的可行性。 1材料和方法1.1材料1.1.1 主要試劑和儀器I型膠原酶（sigma 美國）；胰蛋白酶（sigma 美國）；地塞米松（sigma 美國）)；維生素C（sigma 美國）；甘油磷酸鈉（sigma 美國）；高糖DMEM （GibcoGibeo 美國）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司杭州四季青生物工程材料有限公司）；堿性磷酸酶染色試劑盒（華美生物工程公司）；四環(huán)素（華美生物工程公司）；茜素

12、紅 （Amersco 美國）；EDTA（華美生物工程公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Queue Systems Company 美國）；病理切片機（leica 德國）。1.1.2 實驗動物 4月齡健康新西蘭大白兔（體重2.02.5kg，雌雄不拘，泰山醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2005一0005)4月齡健康新西蘭大白兔，體重2.02.5kg，雌雄不限。1.2 方法1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)及傳代4月齡健康新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣栓塞致死，取兔雙側(cè)腹股溝脂肪， PBS液沖洗剪碎，用I型膠原酶法進行消化，加入高糖DMEM培養(yǎng)液重懸浮，放入恒溫CO2培養(yǎng)箱內(nèi)

13、培養(yǎng)，隔日換液，融合達90一95%后，傾倒原培養(yǎng)液，用PBS液輕緩漂洗貼壁細胞2次，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。在培養(yǎng)瓶中加入適量消化液(0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA)進行消化，吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)輕柔吹打培養(yǎng)瓶底壁，使已經(jīng)消化的細胞脫離瓶壁，吹打液1200 r/min離心10 min，棄上清。用培養(yǎng)液將沉積的細胞重新懸浮，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，傳代比例為1：2，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征及傳代情況。1.2.2 脂肪干細胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制：DMEM培養(yǎng)液+ 10%胎牛血清+0.lumo1/L地塞米松+50mg/L維生素C+10mmol/L-甘油磷酸鈉+

14、1%雙抗 PH7.27.4，參照Zuk2等文獻所述方法。普通培養(yǎng)液：高糖DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素、鏈霉素）取第3代ADSCs，以lx105/cm密度接種于24塊蓋玻片，置于37、體積分數(shù)為5 %的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞長滿后，其中12片作為成骨誘導(dǎo)組，加入成骨誘導(dǎo)液復(fù)合培養(yǎng)，行成骨誘導(dǎo)分化。12塊作為對照組，加入普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，共4周，每72 h換液1次。待細胞長滿后，其中12片作為成骨誘導(dǎo)組，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，12塊作為對照組，使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，共4周，每72 h換液1次。1.2.2.1堿性磷酸酶（ALP）染色 在培養(yǎng)皿底部預(yù)置蓋玻片，接種第三

15、代細胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37 、5%2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1周后取出蓋玻片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，滴加堿性磷酸酶染色液，蒸餾水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢。1.2.2.2 茜素紅染色 在培養(yǎng)皿底部預(yù)置蓋玻片，接種第三代細胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37 、5%2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，加入1%茜素紅溶液(PH值為8.3，Tris一Hcl配制)，37染色30分鐘，蒸餾水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢1.2.2.3 Von Kossa（鈣結(jié)節(jié)）染色 在培養(yǎng)皿底部預(yù)

16、置蓋玻片，接種第三代細胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37 、5%2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，加入5%硝酸銀溶液，避光孵育30分鐘，紫外燈下染色1小時，蒸餾水沖洗3遍，加入5%硫代硫酸鈉作用5分鐘，蒸餾水沖洗3遍，1%中性紅復(fù)染5分鐘，蒸餾水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢。2結(jié)果2.1 ADSCs體外培養(yǎng)的生物學特性原代脂肪干細胞8小時開始貼壁，24小時完成貼壁，接種后可見部分懸浮呈圓形的血細胞混雜其中，輪廓清晰，細胞呈短梭形和多角形(圖l)，5一7天融合達90-95%，約兩周內(nèi)可傳代到第三代，細胞數(shù)量可擴增200-300

17、倍，絕大多數(shù)細胞呈扁平的長梭形，局部排列有一定方向性，呈魚群狀（圖2)。 2.2 ADSCs體外成骨誘導(dǎo)及鑒定2.2.1 堿性磷酸酶（ALP）染色：培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞，成骨誘導(dǎo)1 周后，行ALP染色,ALP檢測胞漿內(nèi)可見藍色顆粒（圖3），而對照組無明顯ALP表達（圖4）。2.2.2 茜素紅染色: 培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞，成骨誘導(dǎo)4周后，行茜素紅染色。細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊，細胞結(jié)構(gòu)為紫紅色（圖5)，對照僅見紫色細胞結(jié)構(gòu)，結(jié)節(jié)中央未見紅色團塊染色(圖6);2.2.3 Von Kossa（鈣結(jié)節(jié)）染色：培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞，成骨誘導(dǎo)4 周后，進行Von Kossa染色。細胞集

18、落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，細胞結(jié)節(jié)中央為黑色團塊（圖7），對照組無黑色團塊（圖8）。3.討論當前研究的骨組織工程種子細胞主要有以下幾個來源:骨膜成骨細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞和骨外組織如成纖維細胞、脂肪干細胞、胚胎干細胞。干細胞是結(jié)構(gòu)和功能未特化的原始細胞，它的自我更新與分化能力強，已經(jīng)成為構(gòu)建組織工程骨重要的種子細胞來源，日益成為組織工程首選的種子細胞。干細胞根據(jù)來源不同，可分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell，ASC）。成體干細胞存在于人體各種組織中，具有自我更新和分化成多種組織的能力，如向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)組織的分化

19、，正常生理情況下干細胞多處于G0期或緩慢向G1期轉(zhuǎn)化3。在研究領(lǐng)域，人和動物的許多不同部位來源的成體干細胞已經(jīng)得到分離和鑒定4-6。其中骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是近年來主要的研究對象，但人體骨髓總量有限，BMSCs所占比例低，并且隨著年齡增長，BMSC所占的比例逐漸下降，故獲取的干細胞數(shù)量少,因而限制了BMSCs的廣泛應(yīng)用。脂肪干細胞（ADSCs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細胞，與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能，因其具有安全性高 7 、獲得率高等優(yōu)點,迅速成為目前組織工程學的研究熱點。國內(nèi)外相關(guān)報道指出，脂肪干細胞的體外分離及培養(yǎng)所應(yīng)用的消化酶、消化方法并不完全

20、相同，由于成熟脂肪基質(zhì)中含有大量I型膠原，目前分離本實驗分離ADSCs一般采用I型膠原酶消化法，用培養(yǎng)基重懸細胞后，接種到培養(yǎng)瓶中，通過細胞貼壁而得到ADSCs。文獻指出，ADSCs接種1224h后細胞可達到完全貼壁，細胞形態(tài)為圓形、短梭形和多角形，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，增殖迅速，平均倍增時間為60小時，衰老緩慢，能穩(wěn)定傳代10代左右，說明脂肪干細胞的生物學特征穩(wěn)定，可為組織修復(fù)提供充足的種子細胞8。有研究推測，脂肪組織中含有成骨分化潛能細胞9，ADSCs成骨培養(yǎng)后，細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)成骨基因表達產(chǎn)物，如型膠原蛋白、BMP-2、 BMP受體等10，具有成骨細胞分化潛能。關(guān)于脂肪干細胞的鑒定，目前還沒有發(fā)

21、現(xiàn)ADSCs特異性表面分子標志物。本實驗通過觀察細胞的形態(tài)、繪制生長曲線，得到此細胞具有穩(wěn)定、迅速的增殖能力，符合干細胞的特點。而且在脂肪干細胞分離、純化過程中，一些混雜細胞，如紅細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等，很難一次徹底清除，但其所含數(shù)量很少，約占細胞群的5%20%，這些細胞大部分不能貼壁生長，其增殖能力有限，隨傳代培養(yǎng)，其數(shù)量逐漸減少。在傳代培養(yǎng)過程中，用消化液消化原代脂肪干細胞，關(guān)于消化程度，本實驗選擇在倒置相差顯微鏡下觀察判斷：一般以細胞突起回縮，細胞間隙增大，細胞近乎縮成圓形為度。這時應(yīng)立即吸出消化液，加入含有血清的培養(yǎng)液，終止消化，以保證消化的純度。本實驗本研究通過反復(fù)3次試驗證實

22、，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)下,1周時通過ALP檢測胞漿內(nèi)可見藍色顆粒；4周時檢測茜素紅染色，細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊，細胞結(jié)構(gòu)為紫紅色；4周時鈣結(jié)節(jié)染色，細胞集落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，檢測到大量鈣鹽沉積。鈣結(jié)節(jié)染色原理是將礦化基質(zhì)中硫酸鈣、碳酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強還原劑使其還原為黑色的金屬銀，染色陽性表明細胞已進入基質(zhì)礦化期，而對照組培養(yǎng)的細胞無鈣化結(jié)節(jié)形成。本實驗成功分離培養(yǎng)及傳代脂肪干細胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)可向成骨細胞轉(zhuǎn)化，為脂肪干細胞作為骨組織工程的種子細胞來源提供實驗依據(jù)，為將其應(yīng)用于組織工程，實現(xiàn)多種組織損傷的修復(fù)提供了理論依據(jù)。附圖： 圖1 原代ADSCs呈短梭形

23、圖2 第3代ADSCs呈扁平長梭形，形成魚群狀原代ADSCs呈短梭形 （100） （100） 第3代ADSCs呈扁平長梭形，形成魚群狀 圖3 ALP檢測胞漿內(nèi)可見藍色顆粒 圖4 對照組無明顯ALP表達ALP檢測胞漿內(nèi)可見藍色顆粒 （200） （200） 對照組無明顯ALP表達 圖5 細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊 圖6 對照組細胞結(jié)節(jié)中央未見紅色團塊 （40） （40）細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊 對照組細胞結(jié)節(jié)中央未見紅色團塊 圖7 細胞結(jié)節(jié)中央為黑色團塊 圖8 對照組細胞結(jié)節(jié)中央無黑色團塊細胞結(jié)節(jié)中央為黑色團塊（40） （40） 對照組細胞結(jié)節(jié)中央無黑色團塊參考文獻1. Zuk PA，ZhuM

24、，MizunoH, et al.Multilineage cells from hu-man adipose tissue:implications for cell-based therapiesJ.Tissue Eng,2001,7:211-228.2 .Zuk PA，ZhuM， Ashjian P， Human adipose tissue is a source of multipotent stem cellsJ. MolBiolCel，l 2002， 13: 427942953 YannakiE.Thepapayannopoulou.Stem cells have an identity crisis. Haema. 2001; 4:158-166.4 Morasso MI,Tomic-Canic M.E