2010大一暑假實(shí)驗(yàn)報(bào)告提取分離試驗(yàn)

1、2010年7月18日星期日雨按照陳老師說的，我們今天開始做黃酮分離的預(yù)試實(shí)驗(yàn)，大家每人各取20g粉碎過的蕨菜，包扎好放在干燥的索氏提取器中。接好在鐵架臺(tái)上，最上面接冷凝管，中間接所氏提取器，下面接平底燒瓶，接口一定要配套，是磨口的。蕨菜粉末袋要包好裝在連通管頂?shù)南露?，以便于每次冷凝下來的水都能覆蓋滿粉末，從而充分浸泡，脫色。然后在冷凝管進(jìn)水雨出水管口接上橡皮管，進(jìn)水管橡皮管另一端套緊水龍頭管口，等水浴鍋溫度上升到近50度才打開水龍頭放水。接下來迅速往燒瓶里倒入其2/33/4的乙醚，我快速倒了乙醚。那刺鼻味簡直讓人窒息，加之有毒，易爆炸，使人麻醉，我是百般小心，才避免了它的危害。倒完乙醚立刻將燒

2、瓶接好，乙醚瓶要立刻蓋緊，以防揮發(fā)。脫脂裝置開始正常運(yùn)行了，注意水浴鍋內(nèi)水不能過少，溫度保持原樣。只要等著其流出液體變?yōu)闊o色即可。過了好幾個(gè)小時(shí)，終于完了，關(guān)掉水浴鍋，取下裝置，將乙醚包緊，留著處理。濾紙包仍置于所氏提取器中，放在空氣流通的地方讓其干燥。中文名稱：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器英文名稱：rotaryevaporator定義：一種快速液體樣品濃縮的裝置。樣品在球形的玻璃容器中加熱、減壓，并不斷地旋轉(zhuǎn)增大蒸發(fā)表面積，加快蒸發(fā)速度。所屬學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)(一級學(xué)科)；方法與技術(shù)(二級學(xué)科)普通蒸餾最大的不同就是通過旋轉(zhuǎn)，增大溶劑的蒸發(fā)面積，使蒸發(fā)更加順暢！現(xiàn)在的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀也可以進(jìn)行減壓蒸餾，通過

3、減壓，還可以補(bǔ)充蒸發(fā)的液體而不需要用方法：1高低調(diào)節(jié):手動(dòng)升降，轉(zhuǎn)動(dòng)機(jī)柱上面手輪，順轉(zhuǎn)為上升，逆轉(zhuǎn)為下降.電動(dòng)升降,手觸上升鍵主機(jī)上升，手觸下降鍵主機(jī)下降.2冷凝器上有兩個(gè)外接頭是接冷卻水用的，一頭接進(jìn)水，另一頭接出水,一般接自來水，冷凝水溫度越低效果越好上端口裝抽真空接頭,接真空泵皮管抽真空用的.3開機(jī)前先將調(diào)速旋鈕左旋到最小，按下電源開關(guān)指示燈亮，然后慢慢往右旋至所需要的轉(zhuǎn)速，一般大蒸發(fā)瓶用中，低速，粘度大的溶液用較低轉(zhuǎn)速燒瓶是標(biāo)準(zhǔn)接口24號,隨機(jī)附500ml,1000ml兩種燒瓶，溶液量一般不超過50%為適宜.注意事項(xiàng)：1玻璃零件接裝應(yīng)輕拿輕放，裝前應(yīng)洗干凈,擦干或烘干.2各磨口,密封面

4、密封圈及接頭安裝前都需要涂一層真空脂3加熱槽通電前必須加水，不允許無水干燒.4.RE-52B必須使(19)擰入保險(xiǎn)孔內(nèi)保險(xiǎn)，以免損壞燒瓶.5如真空抽不上來需檢查各接頭，接口是否密封密封圈，密封面是否有效主軸與密封圈之間真空脂是否涂好真空泵及其皮管是否漏氣7月19日星期一晴天氣好轉(zhuǎn)，經(jīng)過一夜的烘干，我的蕨菜包是完全干了。所以可以重新組裝裝置進(jìn)行提純。重新找了一個(gè)冷凝管和圓底燒瓶，用橡皮塞連接，并將蕨菜包打開，粉末倒入圓底燒瓶里，并加百分之七十的乙醇溶解其中，一切就緒后，打開水龍頭進(jìn)行冷凝。水浴鍋溫度要調(diào)為70度。就這樣讓酒精幫助脫脂，兩三個(gè)小時(shí)后取下將燒瓶。用布氏漏斗過濾，再將殘?jiān)右掖祭^續(xù)脫脂

5、，每隔兩小時(shí)過濾一次，共做三次。乙醇要配好。獲得干燥的蕨菜粉放好繼續(xù)提純。今天我們還對大孔樹脂進(jìn)行活化。樹脂在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理，具體方法如下：1、樹脂裝入交換器后，用潔凈水反洗樹脂層，展開率為50-70%，直至出水清晰、無氣味、無細(xì)碎樹脂為止。2、用約2倍樹脂體積的4-5%HCI溶液，以2m/h的流速通過樹脂層。全部通入后，浸泡4-8小時(shí)，排去酸液，用潔凈水沖洗至出水呈中性，沖洗流速為10-20m/ho3、用約2倍樹脂體積的2-5%NaOH溶液，按上面進(jìn)HCI溶液的方法通入和浸泡。排去堿液，用潔凈水沖洗至出水呈中性，沖洗流速同上。酸、堿溶液若能重復(fù)進(jìn)行2-3次，則效果更佳。經(jīng)預(yù)處理后的樹脂

6、，在第一次投入運(yùn)行時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加再生劑用量，以保證樹脂獲得充分的再生。璃件是否有裂縫,碎裂停止蒸餾操作。7月20日21日22日星期二雨先不分段直接用100%乙醇純化，再分段萃?。菏兔?、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。共得8個(gè)組分，TLC檢測。（尹）先純化，30%、60%、100%乙醇洗脫，再分段萃?。涵h(huán)己烷/石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。共得12個(gè)組分，TLC檢測。（胡）先萃取，再純化。先用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，再不分段純化，用乙醇直接沖柱。共得10個(gè)組分，TLC檢測。（唐）先萃取，再純化。先用環(huán)石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，后分段純化，用30%、60%、

7、100%乙醇洗脫。共得12個(gè)組分，TLC檢測。（袁）先萃取，再純化。先用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，再不分段純化，用乙醇直接沖柱，再用TLC檢測。共得10個(gè)組分對所得粗提液顯除去其.含有的百分之七十的乙醇，要用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，.先用70度，除去乙醇，再用80度除去一半水即可。要將提取液放在燒瓶里開啟旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀時(shí)，要先開溫度開關(guān)，調(diào)節(jié)溫度。再開電機(jī)旋鈕。旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速要適宜，稍慢。這樣就得到無乙醇的提取液，收集在另一個(gè)燒瓶中。得到的液相再分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，各做五次。萃取后這四種試劑再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸以回收再利用。萃取時(shí)水相與待萃取相體積比

8、為1：1，先加待萃取劑于250ml的分液漏斗中，再加等體積萃取劑，經(jīng)過震蕩充分混合后并排完氣，放在鐵架臺(tái)上。先靜置一會(huì)兒，使其充分分層。然后打開旋鈕讓下層液體流下。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇都在上層，而氯仿密度比水大，故在下層。萃取出黃酮。萃取時(shí)會(huì)出現(xiàn)許許多多問題，阻擋你繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。如：出現(xiàn)乳膠，導(dǎo)致無法正常分層。我們可以用玻璃棒是氣泡破掉，消除乳膠。還可以加點(diǎn)水和有機(jī)試劑，使其分層。甚至取下溶液用超聲波震碎等等。有時(shí)還可以單獨(dú)將乳化層作為一個(gè)相提取出來，如果乳化現(xiàn)象較為嚴(yán)重的話。就這樣萃取得到四個(gè)萃取后的向和水相，一共五個(gè)相。接著就是把五個(gè)萃取相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸蒸干，以回收期有機(jī)試劑。旋蒸前將放

9、氣孔關(guān)閉，調(diào)好溫度，接好燒瓶。注意這五種旋蒸時(shí)水浴鍋溫度的調(diào)試。石油醚的回收溫度是6570度，氯仿為50度左右，乙酸乙酯為60度左右，正丁醇是8590度。前面已經(jīng)得知乙醇回收溫度為70度左右，乙醚為20多度，而睡則為80度左右。然后就是慢慢的旋蒸了，由于旋蒸儀不夠，我們四個(gè)排隊(duì)使用，效率不是怎么高，蒸了好久才完，蒸干后用甲醇或乙酸乙酯用滴管將其從燒瓶中洗出來。這一步結(jié)束后獲得五個(gè)相，怎么辦呢？接著就用大孔樹脂過濾，事先活化好大孔樹脂，在裝到小點(diǎn)的層析柱中。一定要注意水一定一直比大孔樹脂高度高，以免產(chǎn)生氣孔。若產(chǎn)生氣孔，就需要倒出重新裝。將所得提取劑倒入柱內(nèi)讓大孔樹脂充分吸收器有效成分黃酮。隨后

10、用水沖一遍，得到水相。再用純乙醇沖洗一遍得到乙醇提取相。然后用乙醇洗一遍，換用其他有機(jī)試劑。獲得物再旋蒸即可得到所要的餾分，同樣方法用毛細(xì)管取餾分液體，往硅膠板上點(diǎn)樣。用TLC檢測黃酮含量即結(jié)束預(yù)實(shí)驗(yàn)。7月24日星期六多云今天終于將預(yù)實(shí)驗(yàn)做完了，我得到了七種餾分。然后陳老師馬上教我們做點(diǎn)滴，有試了用玻璃刀切玻璃。將硅膠玻璃切成方形，留著點(diǎn)樣用。還學(xué)習(xí)了毛細(xì)管的使用及清洗。我們買了把玻璃刀，用來切割玻璃制作硅膠板。7月30日星期五多云轉(zhuǎn)雨由于陳老師今天要我們把實(shí)驗(yàn)結(jié)果給他，而且我的實(shí)驗(yàn)任務(wù)比較重，要留十八個(gè)餾分。所以昨晚加了會(huì)班把餾分得到了。到今天上午還有正丁醇萃取的兩個(gè)樣沒蒸干。上午一直放在旋

11、蒸上蒸。下午在點(diǎn)樣和跑板，老師拍了照片。最后我們集體打掃了衛(wèi)生，把實(shí)驗(yàn)室收拾干凈。將儀器整理好，刷干凈，擺好。果然503實(shí)驗(yàn)煥然一新，我們自己看了都感到激動(dòng)，干活也更積極了。今天主要是為了明天開始的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)做足準(zhǔn)備。我們找了大的冷凝管12個(gè)，以及相配套的燒瓶、橡皮塞。安裝好便置于桌面等待使用。我們分工協(xié)作我和尹興坤刷小儀器、試管，他粗洗我來用自來水沖。胡小玉學(xué)長和袁緒甫刷大的。刷好擺放在試驗(yàn)臺(tái)上，好一片整齊的場景。下午點(diǎn)樣是由于我要點(diǎn)18個(gè)點(diǎn)，另加蘆丁和槲皮素作為對照,（蘆丁和槲皮素是黃酮的一種），點(diǎn)過多。所以我用兩個(gè)硅膠板點(diǎn)樣，兩個(gè)硅膠板都有蘆丁和槲皮素，故共有22個(gè)樣點(diǎn)要點(diǎn)。而且還要用三

12、種展開劑進(jìn)行跑板，所以我必須點(diǎn)樣6個(gè)板，共計(jì)66個(gè)點(diǎn)。這確實(shí)不是多么輕松啊。但這讓我更好的練習(xí)了點(diǎn)板，功底果然見長。7月25日星期一晴昨天我們將做好的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的樣品用硅膠板進(jìn)行了點(diǎn)樣，認(rèn)識了黃酮。黃酮是在紫外光為254nm下呈現(xiàn)黃色，它又含有酮基，顧名思義得名黃酮。陳老師比較傾向于先用大孔樹脂不分段純化，再萃取的方案。因?yàn)榇罂讟渲荒艽痔?，過濾大分子化合物，如糖類。分段純化沒什么效果，最后點(diǎn)樣其圖像一模一樣。今天我們要再做一次預(yù)實(shí)驗(yàn)，我做的是先稱取50g脫脂蕨菜粉，再用百分之七十乙醇粗提。接好冷凝管與燒瓶。用乙醇溶解該50g蕨粉，需要250300ml無水乙醇。還要清洗好提取裝置。安裝好裝

13、置將燒瓶放在水浴鍋里，并將水浴鍋溫度調(diào)為70度左右，開始加熱。粗提一段時(shí)間取下取下裝置，用布氏漏斗抽濾濾掉雜質(zhì)。只倒上清液，沉淀舍去。抽濾要用兩層濾紙。共粗提三次，將最后獲得的液相放一塊。將獲得物回收乙醇。將所得液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄型瓶中，溫度調(diào)為70度，以除去乙醇。關(guān)掉出氣閥門，開啟冷凝水，使茄型瓶旋轉(zhuǎn)。等冷凝管幾乎無液滴滴下時(shí)，開始將水浴鍋溫度設(shè)為80度，以除去水中混的乙醇出去。約除去剛才溶液的一半留下即可。隨后將茄型瓶中所得物倒出，再用水洗，二者并在一起。接下來安裝大孔樹脂柱。先倒入少量水于柱內(nèi)，再將與水混合好的大孔樹脂倒入柱內(nèi)，最后柱頂要留幾厘米水柱，以防止柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡，影響純化。上樣

14、。將所得無乙醇的粗提物溶解，加熱或用超聲使其充分溶解，無沉淀為止。接著倒入大孔水柱中，并控制柱底的滴速，不能太快(每1.5秒一滴)。下面向柱內(nèi)倒水，純水。沖洗5個(gè)柱體積(BV)的水為止，這些水相保留。然后依次用百分之30、60、100的乙醇沖洗，每個(gè)依次沖洗7個(gè)柱體積為止。我的柱體積約為70ml共得到三個(gè)沖洗后的液相.并各取少許液體放小瓶里收集點(diǎn)板用。隨后對這三個(gè)液相萃取，分別依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每個(gè)萃取劑要萃取5遍。每個(gè)萃取時(shí)，共得到水相和提取相。3個(gè)水相加12個(gè)提取相，共15個(gè)，還包括前面收集的三個(gè)過大孔流下的3個(gè)，共計(jì)18個(gè)相。將所得的再旋蒸回收有機(jī)試劑即可，回收時(shí)

15、不要等其蒸干要提前拿出，再用甲醇或乙酸乙酯洗出即可。將所得18個(gè)餾分點(diǎn)樣，同樣方法用毛細(xì)管取樣，往硅膠板上點(diǎn)樣。然后再將硅膠板置于254nm紫外線下觀測，測其Rf值分析黃酮含量。（Rf值=樣點(diǎn)遷移值/硅膠板展距，是一種反應(yīng)化合物極性或電負(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)。如果是黃酮話，其Rf值一樣。）（石油醚的回收溫度是6570度，氯仿為50度左右，乙酸乙酯為60度左右，正丁醇是8590度。前面已經(jīng)得知乙醇回收溫度為70度左右，乙醚為20多度，而水則為80度左右。）7月27日星期二雨今天做了乙醇的回收和提取液過大孔樹脂。7月28日星期三晴30七點(diǎn)多起床后立刻跑到503用大孔樹脂柱過濾水相，在過濾之前，我是用布氏漏斗真

16、空泵抽濾了一次，以求再一次除去雜質(zhì)。然后才上大孔。這樣就不會(huì)有大顆粒堵住柱體，順暢過濾。用水過濾時(shí)加了好多水才使從柱內(nèi)流出液體顏色變淡，足足有一千多毫升。用水沖洗時(shí)其流速可以稍快，以節(jié)約時(shí)間。用水沖洗后換用。7月31日星期六晴雨晴今天我們團(tuán)隊(duì)開始了大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，一切準(zhǔn)備就緒，只欠東風(fēng)。將三個(gè)水浴鍋找好，冷凝提取裝置連好，每燒配好取800ml百分之80的酒精和80g蕨菜粉，脫過脂的。（前些天我們還在用濾紙包蕨菜粉，然后放在那大的所氏提取器里，每次大約裝五包。還經(jīng)常加乙醚，一個(gè)人拖著冷凝管，一個(gè)人去塞子，并扶著大燒瓶另一個(gè)同學(xué)往里加乙醚就行了。）我們又是分工協(xié)作，兩個(gè)人陪乙醇，兩個(gè)人稱蕨粉，然后往

17、燒瓶里加蕨粉和酒精。之前我們已把冷凝提取裝置安好，并將進(jìn)水管出水管串聯(lián)完畢，還用繩子系好塑料管接口。一切接好后，打開水浴鍋，通入自來水，開始工作。過了幾個(gè)小時(shí)，下午四點(diǎn)時(shí)我們?nèi)∠卵b置，對蕨菜提取液進(jìn)行抽濾，然后我用旋蒸回收乙醇。我們先進(jìn)行了一公斤蕨菜粉的提取，用去一升酒精?？偣残枳鲞@十倍的工作。8月1日星期日晴提取穩(wěn)步進(jìn)行，今天是將第一次提取工作做完了。我們四人分好工。上午做第二遍時(shí)，我仍然用旋蒸回收乙醇。溫度調(diào)為68度，蒸發(fā)速度還蠻快的，不一會(huì)便搞定了。我用一個(gè)大桶回收旋蒸后留下的提取液，將酒精放在另一個(gè)玻璃容器內(nèi)。我們先要將燒瓶從提取裝置下掉，共十二個(gè)，已編號號碼。去掉燒瓶后立刻將提取液用

18、真空抽濾，再加酒精，是配好的百分之80的乙醇。8月2日星期一晴熱早晨起來我們繼續(xù)工作，我仍然用旋蒸回收乙醇。溫度調(diào)為68度，蒸發(fā)速度還蠻快的，不一會(huì)便搞定了。我用一個(gè)大桶回收旋蒸后留下的提取液，將酒精放在另一個(gè)玻璃容器內(nèi)。我們先要將燒瓶從提取裝置下掉，共十二個(gè)，已編好號碼。去掉燒瓶后立刻將提取液用真空抽濾，再加酒精，是配好的80%的乙醇。然后我稱蕨菜粉，并將稱好的放入燒瓶里，倒入酒精再重新安裝到提去裝置。我們還用酒精計(jì)測量酒精密度儀配制80%的酒精?？墒菦]有合適量程的酒精計(jì)，有兩個(gè);一個(gè)是070%的，一個(gè)是90%100%的，所以只能配和使用。我們自己積極發(fā)揮自主創(chuàng)新的能力，想出來一種方法，用90%100%量程酒精計(jì)的90刻度線的液面與酒精計(jì)浸入水中起始刻度間距離。計(jì)算為2.2cm，只要滿足著就可以配好酒精。8月4日星期三晴今天是三遍提取的最后一次，這次結(jié)束后這一公斤的蕨菜就可以進(jìn)行純化了。我今天主要配置酒精，用濃度較大的配置濃度較小的80%的乙醇。按照我們那套方法，我是將酒精放在大儲(chǔ)存瓶里配置，一次能配置好幾千毫升的酒精，甚為舒服。仍然用酒精計(jì)，先往瓶里到個(gè)大概，如果酒精計(jì)往下沉，說明密度小了。由于酒精密度比水的密度小，所以加水增加密度使酒精計(jì)上浮，反之亦然。就這樣，配好了將其倒入待裝酒精的燒瓶，