口蝦蛄提取物對體外人鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的影響

1、口蝦蛄提取物對體外人鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的影響【摘要】目的討論口蝦蛄提取物對體外人鼻咽癌細胞系NE-2Z轉(zhuǎn)移潛能的影響。方法用細胞-基質(zhì)粘附實驗、細胞運動實驗及侵襲實驗檢測口蝦蛄提取物對NE-2Z細胞粘附、運動及侵襲才能的影響；免疫細胞化學(xué)法檢測其對P-2、P-9及D44v6蛋白表達的影響。結(jié)果口蝦蛄提取物能以量-效方式抑制NE-2Z細胞體外運動及侵襲才能P0.01，但對NE-2Z細胞-基質(zhì)粘附才能無影響P0.05。且口蝦蛄提取物能降低P-2、P-9及D44v6蛋白強陽性表達率P0.01。結(jié)論口蝦蛄提取物可抑制體外NE-2Z細胞的運動及侵襲才能,其機制可能與下調(diào)D44v6、P-9和P-2蛋白表達

2、有關(guān)。【關(guān)鍵詞】口蝦蛄口蝦蛄提取物鼻咽腫瘤腫瘤轉(zhuǎn)移近年來，研究發(fā)現(xiàn)海綿、海藻及珊瑚等多種海洋生物均含豐富的抗瘤活性物質(zhì)1，提示從海洋生物挑選抗腫瘤新藥具有廣闊的前景?？谖r蛄(ratsquilla)，又稱瀨尿蝦，屬于節(jié)肢動物門，是日常食用的海洋生物之一。目前，有關(guān)口蝦蛄抗腫瘤的報道甚少。本課題組近年研究發(fā)現(xiàn)口蝦蛄提取物能抑制人低分化鼻咽癌細胞系NE-2Z的生長2，3，但能否抗腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移尚不清楚。本文旨在討論口蝦蛄提取物對NE-2Z細胞轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用，為口蝦蛄抗腫瘤作用提供實驗根據(jù)。1材料NE-2Z為人低分化鼻咽癌細胞系,由廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供。2方法2.1口蝦蛄有效成分提取與配制新穎

3、口蝦蛄暴曬干后粉碎成粉末，用95%乙醇浸泡3次，每次浸泡液過濾混勻在56蒸發(fā)提純。提純物呈膏狀，每克藥物相當(dāng)于生藥3.81g。提取物用二甲基亞砜DS配成1000gL-1，4保存，臨用時用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，以下實驗均分4組：溶劑對照組、口蝦蛄提取物低濃度組200.0gL-1、口蝦蛄提取物中濃度組400.0gL-1及口蝦蛄提取物高濃度組800.0gL-1。2.2細胞-基質(zhì)粘附實驗atrigel按2.0g/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，風(fēng)干過夜。NE-2Z細胞常規(guī)培養(yǎng)，以每孔4104/100l接種，并參加不同濃度的口蝦蛄提取物，每組設(shè)12個平行孔，培養(yǎng)8h后倒掉培養(yǎng)液，結(jié)晶紫100l/孔染色10in，P

4、BS洗滌3次。參加醋酸乙醇100l/孔，酶標(biāo)儀測定A570n值。實驗重復(fù)2次。2.3細胞侵襲及運動實驗Transell上室腔內(nèi)參加稀釋好的atrigel10g)，風(fēng)干過夜。24孔培養(yǎng)板內(nèi)參加10g/l纖維粘連蛋白的完全培養(yǎng)液600l/孔。搜集NE-2Z細胞，用含1%牛血清白蛋白的RPI1640制成1106/l細胞懸液，以100l/室參加上室腔，同時參加不同濃度的口蝦蛄提取物，每組設(shè)平行小室3個，小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，取小室，甲醇丙酮11固定10in，擦去未穿膜的細胞，HE染色，光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)細胞數(shù)目，取均值。運動試驗除不鋪atrigel外，其余步驟一樣。

5、2.4免疫細胞化學(xué)法NE-2Z細胞接種在一次性塑料培養(yǎng)皿中，同時參加不同濃度的口蝦蛄提取物，常規(guī)培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，冷丙酮：甲醇11固定10in，晾干。免疫組化染色：參照S-P試劑盒說明。結(jié)果觀察：每組選用上下左右中五個區(qū)域，記數(shù)500個細胞，胞漿或和胞膜著色淡黃為弱陽性+，著色棕黃為陽性+，著色棕褐為強陽性+，無著色為陰性-。2.5統(tǒng)計學(xué)分析用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSSfrind11.5中單因素方差分析ne-ayANVA(PstHTest:LSDtest)及RTableDesriptivestatistis(rsstabs,hi-square)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1

6、粘附實驗結(jié)果不同濃度口蝦蛄提取物組D值變化不大。溶劑對照組、口蝦蛄提取物200.0，400.0，800.0gL-1組D值分別為1.3130.073，1.3200.058，1.3040.052及1.3060.085。組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。3.2細胞運動實驗結(jié)果隨口蝦蛄提取物濃度的增高，穿PVPF膜的細胞數(shù)漸減少見圖1，呈量-效關(guān)系。溶劑對照組及口蝦蛄提取物低、中、高濃度組穿膜細胞數(shù)分別為84.675.15，36.075.46，31.002.60及15.602.16。組間差異有顯著性P0.01。3.3細胞侵襲實驗結(jié)果隨口蝦蛄提取物濃度的增高，穿PVPF膜的細胞數(shù)也漸減少見圖2，呈量-效關(guān)

7、系。溶劑對照組及口蝦蛄提取物低、中、高濃度組侵襲細胞數(shù)分別為102.273.91，54.824.39，45.602.03及38.472.48。組間差異有顯著性P0.01)。3.4免疫細胞化學(xué)法結(jié)果NE-2Z細胞D44v6主要在細胞膜上表達，均呈陽性或強陽性表達。隨口蝦蛄提取物濃度的增高D44v6表達有下降的趨勢，溶劑對照組及口蝦蛄提取物低、中、高濃度組D44v6強陽性表達率分別為46.6%(233/500)、45.6%(228/500)，38.0%(190/500)和30.6%(153/500)，組間差異有顯著性(P0.01)。P-9及P-2主要表達NE-2Z細胞膜及胞漿，呈陽性或強陽性表達。

8、溶劑對照組及口蝦蛄提取物低、中、高濃度組P-9強陽性表達率分別為48.8%(244/500)，43.6%(218/500)，29.2%(146/500)及29.0%(145/500)；而P-2強陽性表達率分別為28.0%(140/500)，10.0%(50/500)，6.6%(33/500)及6.0%(30/500)。兩者強陽性表達率均隨口蝦蛄提取物濃度增高而降低，差異均具有顯著性P0.01)。4討論鼻咽癌又稱“廣東癌，放療為其治療的主要手段，但晚期患者的5年生存率僅30左右，放療失敗的主要原因是部分復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，其中遠處轉(zhuǎn)移是患者死亡的主因。在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞間及其與細胞外

9、基質(zhì)、正常細胞間的粘附作用、細胞外基質(zhì)的降解和癌細胞運動游走才能起著重要作用，是決定惡性腫瘤能否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的3個關(guān)鍵因素。因此，通過觀察藥物對癌細胞粘附、侵襲以及運動才能的影響可判斷其能否抑制腫瘤轉(zhuǎn)移潛能。本實驗粘附實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度口蝦蛄提取物組D值變化不大P0.05，提示其對NE-2Z細胞-基質(zhì)粘附才能可能無抑制作用。細胞運動實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著口蝦蛄提取物濃度的增高，穿過PVPF膜的NE-2Z細胞數(shù)漸減少，呈量-效關(guān)系P0.01)，提示其對NE-2Z細胞運動才能有抑制作用。而細胞侵襲實驗結(jié)果顯示隨口蝦蛄提取物濃度的增高，侵襲人工基底膜后穿過PVPF濾膜的NE-2Z細胞數(shù)也漸減少，呈量-效

10、關(guān)系P0.01)，提示其對NE-2Z細胞侵襲才能也有抑制作用。D44為細胞外表胯膜糖蛋白，研究說明D44拼接異構(gòu)體的D44v6與癌侵襲、轉(zhuǎn)移親密相關(guān)4，D44v6異常表達可能與鼻咽癌轉(zhuǎn)移親密相關(guān)5，D44v6可通過影響了腫瘤細胞的運動才能而參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程6。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨口蝦蛄提取物濃度的增高D44v6表達有下降的趨勢，組間差異有顯著性P0.01)，提示了口蝦蛄提取物對D44v6表達有抑制作用，從而降低NE-2Z細胞的運動才能?；|(zhì)金屬蛋白酶atrixetallprtEinase，P家族成員中的型膠原酶與惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系最親密，是近年研究熱點之一。目前發(fā)現(xiàn)型膠原酶有兩種:72K

11、D型和92KD型型膠原酶，即P-2及P-9，兩者的過度表達與肺、前列腺及乳腺等多種器官惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)。有研究說明P-9和P-2與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)7，8。本實驗結(jié)果顯示P-2及P-9蛋白表達也隨口蝦蛄提取物濃度增高而降低，呈量效關(guān)系P0.01)，提示了口蝦蛄提取物可抑制P-2及P-9表達，從而降低NE-2Z細胞的侵襲才能。綜上所述，口蝦蛄提取物可能同時抑制了D44v6、P-9和P-2蛋白表達而降低NE-2Z細胞的運動及侵襲才能，從而抑制了NE-2Z細胞的轉(zhuǎn)移潛能。由此可見，口蝦蛄提取物中可能含有抗鼻咽癌侵襲及轉(zhuǎn)移的活性成分，至于其起作用的詳細活性成分是什么，有待進一步的研究?！緟?/p>

12、考文獻】1T.LukeS,EriA,KerryP,etal.arinenaturalprdutsasantianerdrugsJ.lanerTher，2022,4(2):333.2顧帝水，黃培春，孔霞，等.口蝦蛄提取物對人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響J.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2022,14(14):1825.3葉才果，潘海燕，黃培春，等.海洋來源的口蛄蝦生物堿的別離純化和抗鼻咽癌作用研究J.時珍國醫(yī)國藥,2022,19(12):2965.4Kainz,Tepfer,KhlbergerP,etal.IunhistheialdetetinfadhesinleuleD44splievariantsinlyphndeetastasesfervialanerJ.IntJaner,1997，74:185.5卓明英,楊軍,林昶，等.D44v6基因蛋白在鼻咽癌的表達及意義J.臨床腫瘤學(xué)雜志,2001,6(1):25,31.6AfifyA,PurnellP,NguyenL.RlefD44sandD44v6nhuanbreastanerelladhesin,igratin,andinvasinJ.ExplPathl，2022,86(2):95.7ZhangXX,GuY,YeQ,etal.StudyftherelatinbeteenP2、P9andnasph