基因工程期末考試

1、、名詞解釋1、基因:是一個含有特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。1、基因工程（狹義）：Geneengineering又genemanipulation，是在分子生物學和分子遺傳學等學科綜合發(fā)展的基礎上，于上世紀70年代誕生的一門嶄新的生物技術科學，應用基因工程技術完全打破生物界物種的界限，在體外對大分子DNA進行剪切、加工、重組后引入細胞中表達，使其具有新的遺傳特性，從而定向改造生物。2、柯斯質粒：是一類由人工構建的含有A噬菌體的cos位點序列和質粒復制子的質粒載體。具有噬菌體載體特點具有質粒載體特點高容量特點（30kb）常具后性基因3、克隆載體：能夠攜帶目的DNA片段進入宿

2、主細胞進行擴增獲得大量目的DNA的一類DNA分子。4、細菌轉化：一種細菌菌株由于捕獲了另一種細菌菌株DNA,而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。5、連接酶：是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來的酶。6、融合基因：指兩個或多個基因的編碼區(qū)手尾相連，置于同一套調(diào)控序列（包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等）調(diào)控之下，構成嵌合基因。7、核酸外切酶Exonuclease：是一類從多核苷酸鏈的一頭開始按順序降解核苷酸的酶。8、表達載體：能夠攜帶目的DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達，獲得目的DNA蛋白質產(chǎn)物的一類DNA分子。9、植物基因轉化受體系統(tǒng)：指用于轉化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他

3、非組織培養(yǎng)途徑，能高效穩(wěn)定的再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。10、岡崎片段：在DNA后隨鏈的合成中先以片段的形式合成崗崎片段，多個崗崎片段再連接成完整的鏈。二、問答題1、PCR的基本原理是什么，用PCR擴增某一基因，必須先得到什么樣的信息？DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性和引物延伸。至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。2、在細菌細胞中表達真核基因，為什么要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細菌的啟動子？（1）真核生物基因組的編碼DNA序列是含有內(nèi)含子的間斷序列，而細菌是原核生物，他們的編碼基因組DNA是連續(xù)的

4、不含內(nèi)含子的。所以如果在細菌中表達真核生物的基因產(chǎn)物，用基因組DNA的話，那么在細菌中表達的時候因為內(nèi)含子序列在轉錄成mRNA的時候mRNA就會同樣含有內(nèi)含子序列，于是基因產(chǎn)物表達不出來。所以我們要用真核生物的mRNA反轉錄而成的cDNA來進行原核表達基因產(chǎn)物。真核生物的mRNA在成熟過程中內(nèi)含子序列已經(jīng)被剪切掉了，所以cDNA序列是完整的不含間隔序列的編碼序列，不含阻礙基因產(chǎn)物的表達。（2）細菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，不能識別的真核生物的啟動子，要在細菌中進行原核表達，就必須有原核表達系統(tǒng)，所以要在cDNA前加上細菌的啟動子。3、描述Northern雜交和RT-PCR的原理，相對于Norther

5、n雜交而言，RT-PCR的優(yōu)點是什么？（1）Northern雜交原理：用來檢測真核生物RNA量和大小的試驗方法，是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。將RNA進行變性和電泳分離后，轉移到固相支持物上的過程稱為Northernblott.整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達，則轉化植株細胞內(nèi)有其轉錄產(chǎn)物特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子質量大小依次排布在凝膠上；將他們原位轉移到固定膜上；在適宜的離子強度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然后通過探針的標記性質檢測出雜交體。若經(jīng)雜交，樣品無雜交帶出現(xiàn)，表明外源基因已經(jīng)

6、整合到植物細胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達。（2）RT-PCR原理：是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。（3）用Northern印記法分析RNA水平需要有足夠的RNA含量，對低豐度的mRNA的定量更是夠取，而RT-PCR可對微量RNA進行定量。4、在序列5CGAACATATGGAGT3中含有一個6bp的I邛艮制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，該位點的序列可能是什么（4分）？II型限制性核酸內(nèi)切酶的特點是：一般能識別和切割48個堿基對的核苷酸序列；大多數(shù)識別序列具有回文結構；沒有修飾性甲基化酶功能。II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式有三種：

7、切割產(chǎn)生5突出的粘性末端（stickyends）；切割產(chǎn)生3突出的粘性末端；切割產(chǎn)生平頭末端（bluntends）。5-cgaAcatatGgagt-33-GCTTGTATACCTCA-35、請設計PCR引物，用于擴增下圖所示序列之間的DNA序列。（5分）5-GACCTGTGGAATC-CATACGGGATTG-3前引物F：5-GACCTGTGGAAG-3后引物R：5-CAATCCCGTATG-36、用連接酶將Sau3AI（JGATC）切割的DNA與經(jīng)BamHI（GJGATCC）切割的DNA連接起來后,能被BamHI切割的幾率有多大（用百分比表示）？25%7、j以下那些酵所產(chǎn)生的末端可相互匹配

8、連接：（5分）.Smal：CCClGGGBamHI:g|gATCCApal:GGGCCEcoRV:Ag4gCTBglll：AATCTXbal:cJcCGGGMspI:QcGGSall：okcGACSau3A|GATCTaql:QcGABssHII:CCGCGCSmal和EcoRV；BamHI和BssHII；Bg1II和Sau3A；BamHI和Sau3A；MspI和TapI；8、計算下列三種誨各自在某染也體DNA序列上的識別位點間的平均距離5分Alul：5AGCT3EcRI:5GAATTC3Acyl;5PPuCGPyC33TCGA亍屮CTTAAGF3*CPyGCPuG5:注：片=任一種嗜喘：戸口

9、=任一種嗪吟Alul：44=256；EcRI：46=4096；Acyl：44x2=10249、6.插入片段大小是1Kb,按1：40稀釋插入片段DNA,測定0D23是0.1（lOD260代表50微克/毫升的DNA）質粒的玻度是80ng/ub質粒大小是4Kb如果在連接反應體系中加luL質粒，需要加多少微升的片段DNA才能是最后摩爾比為片段：載體=5：1?（5分）50卩g/ml=50ng/卩1,按1：40稀釋，為50 x40=2000ng/pl質粒有80ng/plx1pl=80ng,設DNA片段為Xng,80ng/4Kb_1Xng/1Kb5X=100ng；100ng/2000ng=0.05pl3G-

10、55G-33-G5PstI5-CTGCA-G-33-G-ACGTC-5JDNA聚合酶5-CTGCAG-33-GACGTC-5Jt4DNA聚合酶5-CTGCAG-33-GACGTC-5限制性內(nèi)切核酸酶BamHJ和PW切割某-DNA序列，結果如下圖所示（10分）:5J-G|GATCC-3指出被切割DNA分子的3,端和亍端；如果將切割后的DNA同DNA聚合酶、4種血丁戸在_起溫育”這些DNA末端會有什么樣的變化？經(jīng)過2）反應后，你還能用TDNA連接酶將BamHI和Pstl末端連接起來嗎？（T*DNA灶接酶可在平未端和粘性末端）經(jīng)過3連接后,能夠重新形成BamHI位點嗎？Ps（l位點呢？（1）BamH

11、I5-G35GATCC-33-CCTAG5BamHI_GGATCOy-CC7AG|G召-CCTAGG5-Ctgca|PstIYTGCAG-31ACGTC-5PstI5-CTGCA33ACGTC-5（2）BamHI的末端能夠被DNA聚合酶填補，而PstI的末端卻不能，這種差異是由于DNA聚合酶的作用條件所決定的：dNTP只加到具有3-OH的引物上，并且要有一條保證正確添加的模板鏈。BamHI的末端可以滿足這些條件，但PstI的末端卻不能，因其具有隱藏的5末端，這種末端不能作為引物，故不能被填補，因此BamHI的末端會變成平末端，PstI不會。3)BamHI5-G-GATCC-33-CCTAG-G

12、-5JDNA聚合酶5-GGATCGATCC-33-CCTAGCTACG-5Jt4DNA聚合酶5-GGATCGATCC-33-CCTAGCTACG-5(4)BamHI不能；PstI能。-GACGTC-118-在細菌質粒PBI1的四環(huán)素抗性基因tetR的中間有Hindlll酶切位點.用出還口切割果蠅基因組DNAr以PBII為載體構建基因組文庫.分子雜交證明克隆15帶有果蠅的目的基因.用咖IH和EcoRV對克隆15進行了酶切分析，電泳結果如圖所示（用酶切的pBIl質粒DNA作對照），旁邊標出片段的大小。（1分）1）繪制含有插入片段和不含有插入片段的pBIl的限制性圖譜.并標明四環(huán)素抗性基因的位賈；2

13、）如果用四環(huán)素基因作探針進行Southern雜交，預測上述電泳圖會出現(xiàn)什么樣的雜交帶；3如果用克隆15的果蠅DNA片段作為採針進行Southern雜交，結果又如何?pH/OHQ15：Ep*I?Id15K5.0Kb4.5Kb3.0Kb2,5Kb2.0Kbi.5Kb1.0Kb1-2:HindIII酶切；3-4:EcoRV酶切;5-6:EcoRV+HindIII酶切；1,3,5是質粒；2,4,6是15號克隆Hindm2）2號的2.5Kb和6號的1Kb和1.5Kb沒有條帶。（3）2號的2.5Kb和5Kb沒有條帶，1Kb、1.5Kb、2Kb、3Kb和4.5Kb有條帶。三、綜合題研究表明，某細菌含有一種蛋白，具有很強的殺蟲活性，先已將該蛋白純化并從N端到C端各測定了10個aa序列，請設計實驗，克隆編碼該蛋白的基因？擬將該基因轉入楊樹，請問（1）如何進行受體系統(tǒng)的選擇和建立（2）遺傳轉化系統(tǒng)的建立（3）轉化方法選擇（4）轉化系統(tǒng)如何優(yōu)化（5）如何鑒定轉基因植株（6）如何解決嵌合體（7）如何推廣轉基因植株（1）如何進行受體系統(tǒng)的選擇和建立1）植物基因轉化受體系統(tǒng)應具備的條件具有高效穩(wěn)定的再