5 誘變物質(zhì)的微核檢測技術(shù)

1、誘變物質(zhì)的微核檢測技術(shù)摘要微核是真核類生物細(xì)胞核染色體畸變在間期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。實(shí)驗(yàn)以大蒜根尖作為實(shí)驗(yàn)材料，利用溴化乙錠對其細(xì)胞進(jìn)行染色體誘變，在設(shè)置陰性、陽性對照情況下觀察其細(xì)胞內(nèi)微核的產(chǎn)生，并對微核率進(jìn)行計(jì)算，從而評價(jià)誘變劑對生物遺傳物質(zhì)的影響能力。引言微核（micronucleus,簡稱MCN）,也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變在間期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥劑，有很多能引起染色體的異常。一般認(rèn)為微

2、核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經(jīng)證實(shí)，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)與染色體畸變的情況一樣。所以許多人認(rèn)為可用簡易的周期微核計(jì)數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)，用以評價(jià)化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)染色體異常的能力。因此微核測試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑的安全評價(jià)，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個(gè)方面。本次實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)操作者

3、自選材料進(jìn)行大蒜誘變培養(yǎng)，了解微核檢測的方法和意義，并且通過檢測評價(jià)環(huán)境中常見物質(zhì)的誘變情況實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)材料生物材料：大蒜器材：培養(yǎng)皿，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，刀片，解剖針，量筒，滴管試劑：NaN3溶液（40mg/mL）,溴化乙錠（EB,染色濃度5mg/mL）,卡諾固定液，無水乙醇，水，HCl（lmol/L），改良苯酚品紅染液2.實(shí)驗(yàn)步驟取材大蒜于24水中培養(yǎng)2436h,選擇根長整齊一致，不定根長約0.51cm左右的大蒜隨機(jī)分組。處理各實(shí)驗(yàn)組。將樣品分為七組，放入不同成分的培養(yǎng)液中，其中1組為陰性對照組，培養(yǎng)液為水；2組委陽性對照組，培養(yǎng)液為40mg/mLNaN3溶液；37組培養(yǎng)液分

4、別為稀釋102106倍的EB染液（染色濃度）。于24水中培養(yǎng)24h?；謴?fù)培養(yǎng)24小時(shí)。卡諾固定液中固定24小時(shí)，如不立即檢測可移至70%乙醇中4C下保存。制片根尖用IMHC1處理的10min,水洗3次。切取近根尖分生區(qū)的伸長區(qū)組織，用改良苯酚品紅染色10min。壓片：加上蓋玻片后，用鉛筆輕敲使細(xì)胞分散，最后垂直壓下去。鏡檢每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)含微核的細(xì)胞數(shù)，然后取平均值，即為該處理的微核千分率。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果圖示abc圖1視野中細(xì)胞核的三種狀態(tài)3.2.統(tǒng)計(jì)微核率表1微核試驗(yàn)微核率統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿編號培養(yǎng)液成分微核率1純水（陰性對照組）0240mg/mLNaN3溶液（陽性對照組）420%

5、o35X10-2mg/mLEB溶液768%o45X10-3mg/mLEB溶液506%55X10-4mg/mLEB溶液292%65X10-5mg/mLEB溶液4%75X10-6mg/mLEB溶液0結(jié)果分析圖1示三種形態(tài)細(xì)胞核。圖1a為正常形態(tài)的細(xì)胞核，取材自在水中培養(yǎng)的根尖，為邊緣完整的圓形或者橢圓形；圖1b為產(chǎn)生微核的細(xì)胞核，取材自40mg/mLNaN3溶液中培養(yǎng)的根尖。圖中每個(gè)細(xì)胞核周圍都有一個(gè)或多個(gè)微核，呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小在主核1/3以下；圖1c所示細(xì)胞核，取材自50Ag/mL溴化乙錠（EB）處理后的根尖。由于溴化乙錠的嵌入作用，細(xì)胞核已經(jīng)沒有完整的外形，完全破碎為數(shù)個(gè)微核。可見溴化乙錠致突變效率極高。由表1各實(shí)驗(yàn)組微核檢出率可見，實(shí)驗(yàn)材料大蒜根尖細(xì)胞的微核率與處理用EB溶液的濃度呈正相關(guān)，而且與其濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)。盡管如此，我認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中對于3號以及6號樣品的計(jì)數(shù)區(qū)選取不甚明確，故對其微核率與誘變試劑濃度的線性關(guān)系的結(jié)論存疑。4.注意事項(xiàng)EB