使用傅里葉變換紅外光譜學(xué)定量測(cè)定的葡萄糖在全血濃度

1、使用傅立葉變換紅外光譜法定量測(cè)定全血中的葡萄糖濃度摘要：傅里葉變換紅外透射光譜已經(jīng)用于測(cè)定來(lái)自28個(gè)患者的全血樣品中的葡萄糖濃度。使用光譜范圍950-1200cm-1的4-向量偏最小二乘法校準(zhǔn)模型產(chǎn)生獨(dú)立測(cè)試集的0.59mM的標(biāo)準(zhǔn)誤差預(yù)測(cè)。對(duì)于來(lái)自單個(gè)患者的血液樣品，我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度與在1082cm-1和1093cm-1處的二階導(dǎo)數(shù)光譜的值之間的差異成比例。這種光譜學(xué)可以單獨(dú)的使用特定的波數(shù)來(lái)測(cè)定來(lái)自單個(gè)患者的血漿樣品中的葡萄糖濃度，預(yù)測(cè)誤差為0.95mM。一引言血液中葡萄糖的定量是臨床分析中一個(gè)持續(xù)的研究領(lǐng)域。血液中葡萄糖濃度的測(cè)定對(duì)于糖尿病的治療和控制是至關(guān)重要的（Shamoon等199

2、3，Nathan1996），對(duì)關(guān)鍵病房患者的監(jiān)測(cè)，特別是在特殊護(hù)理新生兒?jiǎn)挝坏脑绠a(chǎn)兒。由于許多潛在的優(yōu)點(diǎn)，紅外（IR）光譜學(xué)已經(jīng)吸引了對(duì)血液和血清研究的許多關(guān)注：不需要試劑，可以從單個(gè)光譜確定多于一種分析物的濃度，并且該方法適合于自動(dòng)化.（霍爾和波拉德，1992年，哈森等人，1998，肖和Mantsch2000年,海澤和比特，1997年，哈蘭等人1992年，哈利勒1999，阿諾德1996，海澤等人1989，波拉德等人1993，Ward等1992）以前的研究已經(jīng)表明，傅立葉變換紅外光譜（FTIR）可用于在中紅外范圍內(nèi)測(cè)定血液中的葡萄糖。已經(jīng)對(duì)液體樣品采用了衰減全反射（ATR）技術(shù)，其與偏最小二乘

3、法（PLS）校準(zhǔn)模型組合產(chǎn)生了在0.8-1.1mM范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)誤差預(yù)測(cè)（海澤等人1989，波拉德等人1993，Ward等人1992）。然而，蛋白質(zhì)在ATR晶體上的吸收是該技術(shù)的缺點(diǎn)。因此，在另一種方法中，將血液或血清樣品沉積在聚乙烯卡片或IR-窗口基底上并干燥以消除水的吸收。對(duì)于血清中的葡萄糖和對(duì)于血液中的葡萄糖，所獲得的標(biāo)準(zhǔn)誤差預(yù)測(cè)值為0.41mM（Budinova等人1997,Shaw等人1998）。在這些測(cè)量中，將硫氰酸鉀加入到血液或血清樣品中作為內(nèi)部參考以補(bǔ)償膜厚度和樣品量的變化。由于其粘度和高顆粒含量（全血含有約45的細(xì)胞組分），以及高水分背景吸收，中紅外透射測(cè)量長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是用于

4、全血分析差的技術(shù)。然而，盡管有這些問(wèn)題，使用FTIR透射光譜法對(duì)全血中的葡萄糖進(jìn)行直接測(cè)定。在本文中，我們從28名患者的全血樣本中葡萄糖濃度的定量測(cè)定來(lái)提供詳細(xì)的結(jié)果表明使用FTIR透射光譜和PLS校準(zhǔn)模型的效果。我們討論了PLS模型中光譜范圍和矢量數(shù)量對(duì)預(yù)測(cè)精度的影響。此外，我們得知葡萄糖濃度可以直接從兩個(gè)特定波長(zhǎng)透射光譜的二階導(dǎo)數(shù)確定，這可能有利于該技術(shù)的實(shí)際實(shí)施。二實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)通過(guò)用去離子水適當(dāng)稀釋預(yù)制備的32g/dlD-葡萄糖溶液，將葡萄糖水溶液樣品制備成各種濃度。所使用的血液樣品取自常規(guī)臨床預(yù)約的28名匿名患者。將這些靜脈全血樣品直接收集到氟化物/EDTA管（氟化物抑制糖酵解和EDTA作

5、為抗凝血?jiǎng)┲?并在測(cè)量前在4C冷藏儲(chǔ)存。從接收到實(shí)驗(yàn)室的2小時(shí)內(nèi)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室參考方法（DadeBehringDimension尺寸分析儀）直接分配新孔樣品的葡萄糖濃度，發(fā)現(xiàn)其范圍為2.4至29.0毫米。該臨床方法在5.0mM和20mM的葡萄糖水平下的一批內(nèi)的變異系數(shù)小于2%。所有透射光譜用配備有Ge/KBr分束器和液氮冷卻的汞-碲化鎘（MCT-316）檢測(cè)器的BrukerIFS113V光譜儀記錄。整個(gè)使用具有KRS-5窗口和25pm特氟隆間隔物的液體池（池體積10pI）。對(duì)于全血測(cè)量，首先使用注射器（1ml）將500pl樣品通過(guò)液體細(xì)胞沖洗。在測(cè)量之后，用1毫升去離子水在相反方向上清潔液體電

6、池。在所有FTIR紅外光譜測(cè)量期間，樣品的溫度保持恒定（222C）,以使由于溫度變化的光譜變化最小化。在500cm-1至7000cm-1（4cm-1分辨率，四點(diǎn)變跡和零填充因子為2）的光譜區(qū)域中進(jìn)行三十二次掃描用于數(shù)據(jù)采集。在用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析之前，使所有光譜用標(biāo)準(zhǔn)Savitzky-Golay方法（13個(gè)平滑點(diǎn)）測(cè)量三結(jié)果與討論圖一水性葡萄糖樣品（60mM）及其相應(yīng)的二次衍生物的測(cè)量（空心圓）和模擬（實(shí)線(xiàn)）FTIR透射光譜。3.1葡萄糖水樣品圖1顯示了在950-1200cm-1光譜范圍內(nèi)60mM含水葡萄糖樣品的FTIR透射光譜，歸一化為去離子水譜。在這個(gè)光譜范圍內(nèi)的吸收特征主要是由于CC和C

7、O拉伸模式以及OCH,COH和CCH基團(tuán)的變形（Buslov等人1999,Kacurakova和Mathlouthi1996）。圖1還表示出了洛倫茲振蕩器模型的結(jié)果，其使用八個(gè)振蕩器的和來(lái)在該光譜范圍上模擬葡萄糖光學(xué)吸收系數(shù)a其中和S是中心波數(shù)（單位是cm-1），線(xiàn)寬（單位是cm-1）,振子強(qiáng)度。分別的，jjj表示電子對(duì)復(fù)介電常數(shù)的貢獻(xiàn)測(cè)量和模擬吸收光譜的二階導(dǎo)數(shù)也呈現(xiàn)在圖1中；由于00消除了基線(xiàn)和斜率中的隨機(jī)波動(dòng)，可以在二階導(dǎo)數(shù)光譜之間觀察到更好的一致性，并且可以縮小和增強(qiáng)光譜特征。然而，具有高信噪比的的原始FTIR光譜對(duì)于避免噪聲的增強(qiáng)是必要的。圖二，F(xiàn)TIR透射光譜（歸一化為去離子水譜）

8、和水性葡萄糖樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜。為了清楚起見(jiàn)，繪制了9個(gè)光譜中的4個(gè)，樣品濃度為1.8,3.6,5.3和8.0mM。具有最大峰值（在1082cm-1處）的二階導(dǎo)數(shù)譜對(duì)應(yīng)于具有最高葡萄糖濃度的樣品。圖2顯示了用濃度范圍為1.0-8.0mM制備的四種水性葡萄糖樣品的歸一化FTIR光譜以及歸一化光譜的二階導(dǎo)數(shù)。由于這些樣品的濃度低，原始透射光譜中的吸收特征較弱，并且埋在基線(xiàn)和光譜斜率中的隨機(jī)波動(dòng)中。然而，通過(guò)與從更濃的水性樣品獲取的光譜進(jìn)行比較來(lái)驗(yàn)證，在獲取二次導(dǎo)數(shù)后顯示所有葡萄糖吸收峰。使用多變量偏最小二乘法（PLS）校準(zhǔn)模型（Martens和Naes1991，Beebe和Kowalski1987

9、）來(lái)確定葡萄糖濃度，使用歸一化光譜的二階導(dǎo)數(shù)作為評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。對(duì)于校準(zhǔn)模型的評(píng)估，我們使用標(biāo)準(zhǔn)誤差校準(zhǔn)（SEC）和標(biāo)準(zhǔn)誤差誤差（SEP）。通過(guò)這些值計(jì)算其中Ci和C0i分別是校準(zhǔn)集的第i個(gè)樣本的預(yù)測(cè)和真實(shí)濃度，Ti和T0i分別是測(cè)試集的第i個(gè)樣本的預(yù)測(cè)和真實(shí)濃度。NC和NT是校準(zhǔn)和測(cè)試樣品的數(shù)量。我們研究了不同的多元校準(zhǔn)模型，改變所使用的PLS矢量的數(shù)量，光譜范圍和數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟（Martens和Naes1991,Beebe和Kowalski1987）?；谠?50-1200cm-l范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)IR光譜，確定向量的最佳數(shù)目為4將PLS模型應(yīng)用于校準(zhǔn)組（圖2所示）和獨(dú)立測(cè)試組（在另外九個(gè)水性葡

10、萄糖樣品上進(jìn)行另一組FTIR測(cè)量）。計(jì)算校準(zhǔn)組的SEC和測(cè)試組的SEP分別為0.01mM和0.15mM;這個(gè)SEP與用于測(cè)定血液中葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)臨床方法的可比性（Petibois等人2001）。為了檢查已建立的PLS模型在更復(fù)雜系統(tǒng)上的功效，制備并研究了7種混合糖水樣品，每種糖樣品包含具有恒定葡萄糖濃度（7.0mM）的不同果糖濃度（在3-22mM的范圍內(nèi)）。圖三全血和去離子水的FTIR透射光譜。血液來(lái)自患有葡萄糖濃度為20.1mM的患者10。選擇果糖，因?yàn)樗哂信c葡萄糖相似的分子結(jié)構(gòu)，因此具有相似的吸收特征。預(yù)測(cè)的濃度具有6.7mM的平均值，SEP值為0.3mM，與制備的濃度非常一致。這表明即使

11、在可能的干擾分析物例如果糖的存在下，模型也可以量化葡萄糖濃度。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TIR光譜具有測(cè)定水性葡萄糖樣品中葡萄糖濃度所需的靈敏度和選擇性。3.2全血樣本對(duì)從28名具有2.4-29.0mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度的匿名患者中獲得的全血樣品進(jìn)行FTIR光譜測(cè)量。圖3顯示了全血樣品的典型FTIR透射光譜，與去離子水的光譜相比較。在900-1600cm-1的光譜范圍內(nèi)，全血的透射率約為水的透射率的40。此外，可以在血液譜中鑒定許多吸收特征，特別是對(duì)應(yīng)于蛋白偶聯(lián)的N-H彎曲振動(dòng)模式和C-N伸縮振動(dòng)模式的酰胺II吸收范圍（1480-1580cm-1）。然而，950和1200cm-1之間的葡萄糖吸收特征與源

12、自其他血液成分的光譜特征重疊（Shaw等1998）。在所研究的28個(gè)患者中，14個(gè)隨機(jī)選擇的血液譜用作校準(zhǔn)集，其余作為測(cè)試集。采用上面討論的4-矢量PLS校準(zhǔn)模型。盡管高吸水性背景和復(fù)雜的血液基質(zhì)，參考數(shù)據(jù)和FTIR數(shù)據(jù)非常一致，如表1所示。校準(zhǔn)集的SEC和測(cè)試集的SEP計(jì)算為0.46mM和0.59mM這是在血液中測(cè)定葡萄糖的最佳結(jié)果之一（Heise等人1989,Bhandare等人1993,Ward等人1992,Budinova等人1997，Shaw等人1998，Vonach等人1998）。使用透射FTIR光譜和摻雜程序（向全血添加葡萄糖以獲得期望的葡萄糖濃度的樣品），Vonach等（199

13、8）在測(cè)定血肌譜病患中的葡萄糖濃度時(shí)獲得0.81mM的SEP。相反，在我們的工作中，每個(gè)血液樣品來(lái)自不同的患者，因此具有不同的血液基質(zhì)。這兩項(xiàng)研究表明，IR透射測(cè)量是確定2.4-29mM的臨床相關(guān)濃度范圍中的葡萄糖濃度的方便和精確的工具。此外，該技術(shù)具有優(yōu)于ATR和干血膜方法的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榧炔恍枰噭┮膊恍枰獦悠分苽洌╒onach等1998）。3.4偏最小二乘校正模型的光譜范圍為了理解限制全血中葡萄糖測(cè)定的潛在因素，我們通過(guò)改變光譜范圍和使用的PLS載體的數(shù)目，評(píng)估了許多不同的多變量PLS模型。選擇三個(gè)光譜范圍（980-1010cm-1,1015-1045cm-1和1070-1100cm-1），

14、因?yàn)樵谶@些頻率的吸收特征主導(dǎo)水性葡萄糖樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜。水性葡萄糖和全血樣品的結(jié)果總結(jié)在表2中。對(duì)于水性葡萄糖樣品，1070-1100cm-1光譜范圍提供了最好的預(yù)測(cè)結(jié)果。這是因?yàn)樵?082cm-1處的吸收峰具有較窄的線(xiàn)寬，并且也是二階導(dǎo)數(shù)光譜中的最大峰。由于沒(méi)有來(lái)自其他分析物的干擾，SEP由FTIR光譜儀的性能決定。然而，對(duì)于全血樣品，基于1070-1100cm-1范圍的PLS模型給出大約的SEP,大約是含水葡萄糖樣品的5倍。這是因?yàn)槠渌悍治鑫飳?duì)該范圍內(nèi)的光譜有顯著貢獻(xiàn)。然而，基于1015-1045cm-1的PLS模型提供了更好的結(jié)果，其中全血樣品的SEP非常接近水性葡萄糖樣品的SEP

15、。這表明在該特定光譜范圍內(nèi)，SEP再次主要受光譜儀的性能限制。圖四作為葡萄糖的函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)譜的峰-峰值（a）水性葡萄糖校準(zhǔn)組，（b）水性葡萄糖測(cè)試組，（c）全血校準(zhǔn)組的濃度（d）全血測(cè)試組中的濃度。在每種情況下的實(shí)線(xiàn)代表最佳擬合結(jié)果。（d）（三角形）中的四個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)不包括在該擬合過(guò)程中然而，包含所有三個(gè)吸收帶（950-1200cm-1）的PLS模型給出了葡萄糖和全血樣品的最佳總體預(yù)測(cè)結(jié)果。我們相信，通過(guò)優(yōu)化測(cè)量參數(shù)（孔徑尺寸，光譜分辨率和掃描速度等）可以進(jìn)一步改善獲得0.59mM的SEP。這將使FTIR技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)臨床方法（Petibois等人2001）競(jìng)爭(zhēng)。3.4葡萄糖測(cè)定的二階導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)于實(shí)

16、際應(yīng)用，使用在幾個(gè)特定波長(zhǎng)而不是整個(gè)光譜范圍獲得的光譜數(shù)據(jù)是方便的。此外，監(jiān)測(cè)糖尿病以了解血糖水平是高于還是低于某一限度是重要的（Shamoon等人1993，Nathan1996）。在這里，我們顯示使用二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的主要好處之一是，可以通過(guò)觀察幾個(gè)特定的傳輸來(lái)容易地判斷血糖濃度是否高于或低于一定水平，具有合理的準(zhǔn)確性波長(zhǎng)。計(jì)算圖2的二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰-峰值（在1082cm-1和1093cm-1處），并作為圖4（a）中的葡萄糖濃度的函數(shù)圖。由于該校準(zhǔn)組的線(xiàn)性依賴(lài)性，可以確定水性葡萄糖樣品的獨(dú)立測(cè)試集的濃度，并且最佳擬合線(xiàn)具有0.994的R平方值（圖4（b）。對(duì)于全血樣品的等效結(jié)果示于圖

17、4（c）和（d）中，但是注意，圖4（c）中的數(shù)據(jù)在首先將透射光譜標(biāo)準(zhǔn)化為具有最低葡萄糖濃度的血樣的光譜之后獲得，以試圖減少來(lái)自血液基質(zhì)中的其他組分的干擾?；谠摼€(xiàn)性依賴(lài)性，計(jì)算來(lái)自14名患者（測(cè)試集）的全血樣品中的葡萄糖濃度并繪制在圖4（d）中。預(yù)測(cè)和提供的濃度對(duì)于大多數(shù)樣品很好地一致，盡管存在一些差異，我們推測(cè)這可能是來(lái)自其他血液分析物的干擾的結(jié)果。圖5比較了典型的二階導(dǎo)數(shù)光譜（患者26,19.2mM）與“異?！惫庾V（患者21,9.9mM），其導(dǎo)致圖4（d）（實(shí)心三角形）中的一個(gè)偏離點(diǎn)，特別是在1100cm-1以上的光譜之間的差異。當(dāng)與圖1和圖2所示的水性葡萄糖樣品的光譜相比時(shí)，患者21的“

18、異常”光譜具有比患者26的光譜更大的差異。需要進(jìn)一步研究以充分理解原因。圖五來(lái)自（a）患者26和（b）患者21的全血樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜。注意在1100cm-1以上的光譜形狀的差異。圖6（a）10個(gè)血漿樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜，濃度為7.3，12.5，17.3，22.7,27233.7,38.6,42.8,47.6和51.2mM。具有最低葡萄糖濃度的血漿樣品用作標(biāo)準(zhǔn)化的參照，具有最大峰值的二階導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)應(yīng)于具有最高葡萄糖濃度的血液樣品。插圖顯示了峰-峰值對(duì)葡萄糖濃度的線(xiàn)性相關(guān)性。（b）與（a）相同，但是平均譜用作歸一化的參考。二階導(dǎo)數(shù)光譜可以用于直接測(cè)定來(lái)自患者的全血樣品中的葡萄糖濃度。為了模擬來(lái)自單個(gè)患者的不同葡萄糖濃度的血液樣品，我們使用相同的血漿池基質(zhì)制備一組血糖濃度范圍為7.3至51.2mM的血漿樣品。圖6（a）示出了十個(gè)這樣的血漿樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜。在獲取導(dǎo)數(shù)之前，通過(guò)具有最低葡萄糖濃度的血漿樣品的光譜來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化光譜，其自動(dòng)補(bǔ)償其他血液分析物的影響，因?yàn)樵谶@種特定情況下，所有樣品的血漿基質(zhì)是相同的。如在圖6的插圖中可以看出的，在1082cm-1和1093cm-1處的光譜值的峰-峰差值隨著葡萄糖濃度線(xiàn)性增加（最佳擬合線(xiàn)具有R平方值0.996）。因此，可以從FTIR光譜數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)葡萄糖濃度，并