核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用

1、核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用 趙歡吳衛(wèi)鄭有良潘紅梅翟娟園【摘要】藥用植物核rDNA是高度重復(fù)的串聯(lián)序列，由于同步進化的力量，大多數(shù)物種中這些重復(fù)單位間已發(fā)生純合或接近純合。5.8SrDNA把核rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分為ITS1和ITS2兩部分。由于ITS序列變異較快，可以提供較豐富的變異位點和信息位點，已在藥用植物鑒別、道地性研究、栽培與野生藥用植物遺傳差異分析、較低分類階元的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究中發(fā)揮重要作用?！娟P(guān)鍵詞】核糖體DNAITS區(qū)藥用植物Keyrds：NulearrDNA;ITSsequene;ediinalplants人們對藥用植物的研究有著悠久的歷史。隨著植

2、物遺傳學(xué)規(guī)律的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，植物大量次生代謝產(chǎn)物的別離與結(jié)果鑒定及其對系統(tǒng)學(xué)意義的討論，進一步加深了人們對藥用植物的認識?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速開展，使以形態(tài)組織學(xué)、解剖學(xué)等客觀指標為劃分根據(jù)的傳統(tǒng)分類學(xué)得到了補充，為藥用植物系統(tǒng)與進化研究提供了豐富而翔實的資料，為解決分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、物種形成與進化等方面的難題提供了極為有力的技術(shù)途徑1。中藥用于疾病防治已有幾千年的歷史，但由于中藥現(xiàn)代品質(zhì)監(jiān)控技術(shù)缺乏，常常出現(xiàn)藥材混淆代用、成心偽制的現(xiàn)象，嚴重影響中藥的聲譽，甚至危及人身平安，建立健全完善的中藥品質(zhì)檢測技術(shù)體系迫在眉睫。目前，越來越多的研究者將ITS應(yīng)用于藥用植物的鑒別，為提醒藥用植物的遺傳

3、差異和鑒定中藥材品種的道地性提供了新的方法和手段2。本文著重對核糖體DNAITS序列分析在藥用植物的鑒定、道地性研究、栽培與野生藥用植物遺傳差異分析及藥用植物科以下等級系統(tǒng)與進化研究中的應(yīng)用進展了綜述。118S-26SrRNA基因的根本構(gòu)造目前，核基因組序列在藥用植物鑒定和品質(zhì)研究中的應(yīng)用主要集中在編碼核糖體RNA基因nrDNA重復(fù)區(qū)內(nèi)。高等植物細胞核中nrDNA是高等植物中的rRNA基因(rDNA)是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，18S，5.8S和26SrDNA聯(lián)結(jié)在一起，作為一個轉(zhuǎn)錄單位。18S-26SrDNA在植物中有一至數(shù)個位點3，拷貝數(shù)可達50040000，18S-26SrDNA根本構(gòu)造由

4、18SrDNA，26SrDNA，5.8SrDNA和位于三者之間的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)組成，其中ITS區(qū)由被5.8SrDNA所分隔的ITS1和ITS2兩個片段組成4。其轉(zhuǎn)錄物(transript)不參加成熟核糖體，只是部分地對nrDNA的成熟起作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者已利用nrDNA中的ITS片段序列作為分子標記，在藥用植物鑒定和品質(zhì)研究方面開展了許多有益的工作。l8S-26S核rDNAITS區(qū)在核基因組中高度重復(fù)，而且通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換，這些重復(fù)單位間已經(jīng)發(fā)生了位點內(nèi)和位點間的同步進化，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致，且所受選擇壓力較小，堿基交換速率較快，進化速度快，加上片

5、段長度變異很小，ITS1和ITS2的長度均缺乏300bp，在絕大多數(shù)被子植物中缺乏700bp，非常適宜進展各種分子操作5。屈良鴿等通過對不同生物類群的ITS序列(自生物學(xué)數(shù)據(jù)庫)的比較得出：被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為1.210.2，屬間差異值為9.628.8，這對系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較適宜的范圍。另外，ITS在一些起源古老或世代較長的植物類群(如木本竹子)中的變異較低，也為研究那些間隔區(qū)進化速度很慢的古老類群間的關(guān)系和長世代類群內(nèi)較高階元的系統(tǒng)重建提供了可能性6。2ITS區(qū)測序的技術(shù)流程及系統(tǒng)學(xué)分析目前研究者對ITS序列分析的詳細流程大體一樣，主要包括總DNA提娶PR擴增、克

6、隆、測序、排序等步驟。2.1總DNA的提取采用TAB法或在此根底上略加改良，從新穎葉片、鮮莖、甚至保存數(shù)年的蠟葉標本中提取總DNA。在野外，可先用硅膠枯燥法保存材料，然后帶回實驗室提取總DNA。所提取DNA的純度是影響測序準確性的關(guān)鍵因素。2.2PR擴增、產(chǎn)物純化及測序選擇適宜的引物對ITS區(qū)進展擴增，然后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測、回收、純化。對PR產(chǎn)物進展純化是直接測序的關(guān)鍵，可用離心透析法、透析袋法等。也可先對PR產(chǎn)物進展克隆，然后測一個或者多個序列。Baldin7曾指出，在被子植物系統(tǒng)發(fā)育分析中，是測定ITS區(qū)PR克隆，還是直接測定PR全部產(chǎn)物的序列更好，尚處于爭論之中。常用的測序儀有：PE公司

7、的ABI3l0，ABI377自動測序儀、LKBDNA測序儀等。2.3排序用手工或計算機軟件如LUSTALV、LUSTALX、LUSTAL、DNASTAR程序等對所測得的序列進展排序，然后根據(jù)空位(gap)情況對排序結(jié)果進展適當調(diào)整。ITS1和ITS2的范圍可根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的植物18S、5.8S和26SrDNA序列以及近緣類群的ITS1、ITS2序列確定。2.4系統(tǒng)學(xué)分析對已排好的序列進展變異位點(variablesite)和信息位點(infrativesite)數(shù)目的統(tǒng)計，然后進展系統(tǒng)學(xué)分析，只有信息位點才能用于系統(tǒng)學(xué)分支分析。常用的分析軟件有PAUP分析軟件、PHYIIP3軟件

8、包、EGA等。對轉(zhuǎn)換(transitin)和顛換(transversin)進展加權(quán)和對于將gap作為缺失(issing)或新性狀(nestate)得到的簡約樹樹形大致一樣，但自展數(shù)值(btstrap)不同。最常用的分支分析法有簡約法(parsinyethd)、鄰接法(nEighbr-jiningdistaneethd)、最大似然法(axiulikelihdethd)等。3rDNAITS序列分析在藥用植物鑒定中的應(yīng)用資源調(diào)查說明，我國中草藥約有1.2萬余種，其中藥用植物約占85，對它們進展明確的鑒別是非常重要的。中藥材的準確鑒定是中藥研究和實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的基矗由于我國藥用植物種類繁多，藥材來源復(fù)

9、雜，在藥材使用上存在互混、互代、以假充真等及同名異物、同物異名現(xiàn)象，因此影響了用藥的平安性和有效性。應(yīng)用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分來鑒定比較困難，通過比較分析ITS區(qū)序列，可以很容易地鑒別其真?zhèn)?。中藥南五味子為華中五味子的枯燥果實。綠葉五味子的化學(xué)成分與南五味子有所不同，但果實外形相似，使市場上南五味子藥材真?zhèn)坞y辨。高建平等9通過比較采自湖南、四川、陜西、河南、山西、浙江等的12個自然居群的華中五味子和綠葉五味子rDNAITS區(qū)的DNA序列的差異及其規(guī)律性，得出rDNAITS區(qū)為鑒別中藥南五味子與混淆品綠葉五味子的一種良好的分子標記。柴胡是一種多來源藥材，在我國的使用已有兩千多年的歷史。柴胡具

10、有和解表里、疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣之成效。用于治療感冒發(fā)熱、口苦耳聾、頭痛目眩等癥。目前，在中國報道的柴胡屬植物有42種，17變種，7變型。謝暉等10和武瑩等11的研究均發(fā)現(xiàn)：ITS序列可以作為柴胡類藥材鑒定的根據(jù)。此外，en等12對人參屬12種植物的ITS區(qū)和5.8SrDNA進展了序列分析和有效鑒別，發(fā)現(xiàn)西洋參與東亞種人參、竹節(jié)參、三七具有更近的親緣關(guān)系。Ngan等13以保守的植物序列作引物，對ITS區(qū)進展了擴增，并籍以鑒定人參屬6種藥用植物。蔣繼宏等14研究蘇皖產(chǎn)大戟屬內(nèi)6種藥用植物的ITS區(qū)，其結(jié)果與來自形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果相吻合，從而得出ITS區(qū)可用于大戟屬植物種間及真?zhèn)纹疯b別。郝明

11、干等15通過ITS的序列比較，將白花蛇舌草與外形上與其相似的纖花耳草、傘房花耳草和松葉耳草區(qū)別開來。劉忠權(quán)等16搜集目前市場上出現(xiàn)的白花蛇舌草及偽品共9種，通過對其ITS2區(qū)的序列的分析，將白花蛇舌草及偽品區(qū)分開來。金成庸等17為研究韓茵陳和白蓮蒿是否為同一植物，同時對來源于兩個不同國家的3種茵陳韓茵陳、白蓮蒿和茵陳蒿的rDNAITS序列進展遺傳差異的討論，認為用rDNA的ITS序列分析法鑒別茵陳類藥材，方法簡便、準確。彭雪梅等18通過對羅布麻及其易混品的DNA分子鑒定，可以將羅布麻同其混淆品大白葉麻和A.annabinu區(qū)分開來。丁平等19比較巴戟天與常見混偽品之間的rDNAITS區(qū)堿基序列

12、的差異及其規(guī)律，得出ITS序列可作為巴戟天與混偽品的一種較好的分子指紋圖譜的標記方法。4rDNAITS序列分析在藥用植物科以下等級系統(tǒng)與進化研究中的應(yīng)用價值ITS區(qū)序列分析已成為在分子程度上討論科、亞科、族內(nèi)關(guān)系非常有效的手段，在植物系統(tǒng)發(fā)育與分類的研究中起了重要作用。4.1科內(nèi)系統(tǒng)與進化劉艷玲等20基于核糖體DNAITS區(qū)序列討論了睡蓮科植物7屬11種的系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，結(jié)果說明，蓮屬Nelub可從睡蓮科中獨立出來成立蓮科Nelubnaeae和蓮目Nelubnales；萍蓬草屬仍應(yīng)置于睡蓮科中；水盾草屬abba和莼菜屬Brasenia聚成一小支并構(gòu)成姐妹群，說明這兩屬之間親緣關(guān)系較近；睡蓮屬和

13、芡實屬Euryale、王蓮屬Vitria聚成一小支并構(gòu)成姐妹群，說明三者親緣關(guān)系較近，仍應(yīng)置于睡蓮科中。此外，nrDNAITS序列分析用于槭樹科、菖蒲科、檉柳科、金縷梅亞科、君子科風(fēng)車子亞科、金縷梅科殼菜果亞科等科的系統(tǒng)發(fā)育研究中獲得了很好的結(jié)果。4.2屬內(nèi)系統(tǒng)與進化關(guān)系親密的物種間ITS長度接近，而序列有一定程度的變異，因此，該片段特別適宜于屬，尤其是近緣屬間關(guān)系等低級分類群的研究21。Kita和It22利用ITS序列對產(chǎn)于東亞的烏頭亞屬一些二倍體種與四倍體種進展了系統(tǒng)發(fā)育分析。Utelli等23為理解釋產(chǎn)于歐洲的黃花牛扁A.1ytnu復(fù)合體的系統(tǒng)關(guān)系，測定了產(chǎn)于歐洲與高加索山脈的所有牛扁亞

14、屬的種與產(chǎn)于歐洲的烏頭亞屬的種的nrDNAITS序列及pDNA的psbA-tH序列，并運用簡約性方法，進展了系統(tǒng)發(fā)育分析。張富民等24對烏頭屬AnituL.27個類群的nrDNAITS序列進展了簡約法與鄰接法分析，結(jié)果說明，紫烏頭A.delavayi復(fù)合體不是一個單系類群，可能經(jīng)歷了3次不同的起源。這三項研究顯示，ITS序列數(shù)據(jù)均為烏頭屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究提供了有意義的信息。趙國平等25測定中日當歸屬21份材料藥用植物的ITS區(qū)序列，經(jīng)Phylip軟件分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果與當歸屬藥用植物成效差異根本吻合。汪紅等26研究中藥丹參ITS片段遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)該序列在丹參種內(nèi)保守，在屬間有

15、較大的差異，與外類群的差異最大。蔣繼宏等27研究蘇皖產(chǎn)大戟屬內(nèi)6種藥用植物的ITS長度的變異，聚類所得系統(tǒng)進化樹與形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果相吻合，為討論大戟屬植物的系統(tǒng)演化關(guān)系和大戟屬植物鑒定提供DNA分子證據(jù)。閆坤等28對地黃屬6個物種進展了核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究認為，地黃屬為單系起源，天目地黃與湖北地黃有較近的親緣關(guān)系；高地黃和裂葉地黃應(yīng)為同一物種；地黃與茄葉地黃是屬內(nèi)進化程度最高的類群。4.3種內(nèi)系統(tǒng)與進化由于nrDNA的ITS區(qū)域具較多的堿基變異信息，在長度上具較好的保守性，因此近十幾年來被廣泛地用于生藥的種間鑒別29。曹暉等30還認為可將ITS區(qū)用于種下一級分類群親

16、緣關(guān)系研究。羅玉明等31分析紫蘇屬各變種間(紫蘇、白蘇、雞冠蘇和耳齒紫蘇等)rDNAITS區(qū)的序列以及存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)現(xiàn)象，設(shè)計出位點特異性PR引物，用于紫蘇屬各變種間的分子標記鑒別。吳玲等32利用ITS序列對石蒜屬13個種(含變種)的親緣關(guān)系進展分析，說明石蒜屬13個種可分為三大類，比較系統(tǒng)進化樹和核型分析，推導(dǎo)出稻草石蒜、乳白石蒜和短蕊石蒜為變種。5應(yīng)用rDNAITS序列討論藥用植物道地性中藥的品質(zhì)關(guān)系到臨床用藥的平安有效，開展道地藥材是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。藥材道地性主要是指藥材中有效成分的地域差異性，品質(zhì)優(yōu)良是道地藥材的表現(xiàn)型。藥材道地性研究是藥學(xué)研究的熱點之一，主要包括

17、兩個方面：一是研究形成藥材道地性的重要原因；二是如何鑒別藥材市場上的道地性藥材。藥用植物道地性的形成與其代謝過程中的酶系統(tǒng)發(fā)生的“道地性變化有親密聯(lián)絡(luò)，但這種變化受其居群的遺傳特性和生態(tài)環(huán)境的影響。目前，關(guān)于藥用植物品質(zhì)的研究多限于形態(tài)、化學(xué)藥效學(xué)方面，但道地性藥材與非道地性藥材在形態(tài)和生藥性狀等特征上的差異常不明顯，這給應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒別道地藥材帶來了困難33。DNA分子作為遺傳信息的載體，不受材料的生長環(huán)境及發(fā)育時期等的影響，通過rDNAITS序列分析，找到不同樣本間在DNA程度上的遺傳差異，對藥材地理分布和分化變異進展評判與劃分，不僅使從分子程度上來提醒藥材道地性形成的原因成為可能，而且使

18、道地藥材的鑒定更為便利、準確。假設(shè)同時結(jié)合藥效成分分析，對于道地藥材的品質(zhì)評價能起到指導(dǎo)性作用34。為研究蓮的種質(zhì)資源道地性的鑒定、為其質(zhì)量控制和蓮的GAP施行提供科學(xué)根據(jù)，林珊等35和唐先華等36分別從分子程度上比較了不同地區(qū)蓮的差異，結(jié)果說明不同地區(qū)蓮的ITS區(qū)序列有一定的差異，蓮樣品的ITS區(qū)序列即其ITS及5.8SrDNA的序列分析資料可為蓮的品種鑒別及分類提供新的手段。半夏為天南星科半夏屬植物，其枯燥塊莖為我國傳統(tǒng)大宗藥材。張君毅等37對來自我國半夏主要的16個居群18個樣本rDNA中的ITS區(qū)序列進展分析，得出半夏rDNA變異與其地理分布相關(guān)。馬玉花等38對l5個來自不同地區(qū)杜仲品系rDNA的ITS序列分析，為分布于我國同地區(qū)杜仲的分類鑒別提供分子生物學(xué)根據(jù)。王淑美等39討論不同產(chǎn)地牛膝的ITS的序列變異，得出牛膝與川牛膝及土牛膝堿基序列有明顯差異，不同產(chǎn)地、不同栽培品種牛膝堿基序列無差異。目前，應(yīng)用DNA序列分析方法討論藥用植物道地性的研究雖然才剛起步，但是將來自不同居群藥材的化學(xué)成分和其DNA序列分析相結(jié)合那么可以為藥用植物道地性的研究提供更多的信息。6rDNAITS序列分析在研究野生與栽培藥用植物遺傳差異上的應(yīng)用由于生態(tài)環(huán)境的改變等因素，生物的遺傳特性及其生藥品質(zhì)在一定程度上發(fā)生了變化，產(chǎn)地和栽培對生藥品