western blot中洪博元五年經(jīng)驗(yàn)談

1、五年 western blot 實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)1.抗體的選擇對(duì)于國內(nèi)的大多數(shù)來講，做 western blot 實(shí)驗(yàn)選擇抗體是個(gè)頭疼。原因很簡單，買進(jìn)口抗體捉襟見肘，買國產(chǎn)抗體得需要大無畏的勇氣，對(duì)于我所在的蘭州地區(qū)的實(shí)驗(yàn)者而言，感觸尤深。在這五年的 western blot 實(shí)驗(yàn)歷程里，我先后用過進(jìn)口抗體，進(jìn)口抗體國內(nèi)分裝包裝，國產(chǎn)抗體，質(zhì)量良莠不齊。進(jìn)口抗體一般不會(huì)出現(xiàn)閃失：abcam 品種全，質(zhì)量過硬，但價(jià)高（3400元/100 微升），而且說是 100 微升，但至多能吸出來 90 微升；Sigma的價(jià)最貴；比較有性價(jià)比的是 CST 的抗體，現(xiàn)在好像是 2200 元/100微升，我前后用過

2、二十幾種， 1:1000 的稀釋比下，還沒有失過手，100 微升通常能完成所有的免疫組化和 western blot 實(shí)驗(yàn)，還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通常量比 100 微升多出來 10 微升，唯一的是 CST 的品種實(shí)在不多。Santa 的多克隆抗體質(zhì)量可以，但是選用 Santa 的單抗還是有風(fēng)險(xiǎn)，估計(jì)這也是業(yè)界共識(shí)了吧。進(jìn)口抗體國內(nèi)分裝包裝我也用過不少，呵呵，畢竟是窮人（420 元/100微升），大概好抗體的比例約為 50%，如果能做出來，也存在一個(gè)問題，就是抗體大多只能用一次。我曾經(jīng)把 Santa 的原裝抗體和分裝抗體做過比對(duì)（抗體品種，貨號(hào)等完全一致），在都能做出來的前提下，原裝抗體能重復(fù)使用的次數(shù)

3、要多出許多。具體原因我已經(jīng)揣測了好幾年，出來，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整個(gè)賣，也會(huì)有所不同。揣測歸揣測，假如只為了文畢業(yè)走人，可以考慮選用進(jìn)口分裝的多克隆抗體。國產(chǎn)抗體比較知名的就幾家，但質(zhì)量確實(shí)不敢恭維。western blot 能做出來的確實(shí)不多，而且雜帶多，背景不干凈。周邊的大多買國產(chǎn)抗體做免疫組化，怎么說呢，應(yīng)付夠了。我也幫別人過抗體，再用抗原親和純化。效價(jià)非常不錯(cuò)，夸張的時(shí)候 1：10000 都能做出條帶，唯一的麻煩是兔子太騷（騷臭），不知道這是不是“兔女郎”名號(hào)的來由。如果讀書非常悠閑，又特別想擁有手工作坊的情況下，可以自己伺候折騰兔子來，剛開始的時(shí)候還是蠻有成就感的。只是

4、單憑抗原表達(dá)和多抗，是不是可以寫成畢業(yè)，估計(jì)因校而異了。2.Western Blot 設(shè)備目前最好的垂直槽和轉(zhuǎn)移槽還是 Biorad（伯樂），尤其是 MINI3 好用,MINI4 可以一次跑四塊膠，但通常用不上，由此造成垂直緩沖液的浪費(fèi)，而且 MINI4 用綠色玻璃板來組成內(nèi)槽，容易漏液，夾應(yīng)該是有疲勞的，估計(jì)日子一長，彈性就會(huì)改變，所以如果剛買了 MINI4，趕緊用，遭殃的肯定是某一級(jí)的師弟師妹們。Biorad 的一套系統(tǒng)得兩萬多，西部能玩得起伯樂的還真不多。好在咱聰明，天能的外觀和構(gòu)造和伯樂的 MINI3 幾乎一模一樣，而且可以通用，不帶電泳儀是 5 千多一套，挺好用的。唯一的是不如伯樂，

5、膠架容易斷裂。不過仔細(xì)算算，三套天能也就是一套伯樂的價(jià)格，值了。六一的垂直槽很轉(zhuǎn)移槽很好用，但垂直槽配膠不方便，玻板太厚，散熱不好，但能用，六一的電泳儀（電源）還是很好用的。3. Western Blot 實(shí)驗(yàn)條件Western Blot 實(shí)驗(yàn)條件我基本是按 ABCAM 公司經(jīng)典做的，按以下的下來就可以了（ht/ps/pdf/protocols/WB-beginndf）。具體的試劑配方我是按寶生物試劑冊的附錄部分配制。丙烯酰胺和甲是從華美買的德國 biomol 原裝貨，配出來的膠可以提在手里玩，彈性非常好，價(jià)格比 sigma 的便宜許多，1 公斤好像是 480 多，夠用好長時(shí)間，現(xiàn)在做雙向電泳

6、都用 biomol 的膠，很好用。Marker 我現(xiàn)在用 fermantas 的 SM1811,2 微升就很清晰了，蘭州的是生工。要強(qiáng)調(diào)的是垂直電泳緩沖液千萬不能回收用，具體愿因你只需上網(wǎng)查查 SDS的原理就知道了。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。轉(zhuǎn)膜我通常是快轉(zhuǎn)兩百 200 毫安/2 小時(shí)，慢轉(zhuǎn) 80 毫安/12 小時(shí)?？燹D(zhuǎn)是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。封閉我通常用 BD 的脫脂奶粉，不歸，260 元 500 克，也是從華美買的。ECL 我用 pierce 的，500 毫升 1650 元，比國產(chǎn)的還便宜好用。膠片是柯達(dá)的，以前用過的，不如柯達(dá)。我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染膠

7、，總覺得是子放屁的事。4. Western Blot 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵Western Blot 操作步驟多，每一步的都會(huì)造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關(guān)鍵，如果抗體很濫，就是神仙也沒招。其中內(nèi)參抗體很重要，因?yàn)閮?nèi)參抗體的選擇關(guān)系到全盤實(shí)驗(yàn)的考評(píng)。Actubulin，GAPDH 我都用過，Actubulin 的缺點(diǎn)是有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)復(fù)帶，比較穩(wěn)定的還是 GAPDH。如果用心看看 cell，nature，science 上的文章，大多用 GAPDH 做內(nèi)參。進(jìn)口的，國內(nèi)分裝的，國產(chǎn)的，我都用過。進(jìn)口的最強(qiáng)的 1:10000 都能做出條帶（Upse，現(xiàn)在被 Minipore 招安了），國內(nèi)分裝的也

8、好用，但就是不好回收重復(fù)使用，國產(chǎn)的一般只能用一次。我要特別強(qiáng)調(diào)的是，里最貴的抗體實(shí)際上是內(nèi)參抗體，因?yàn)橹灰?Western Blot 開工，每次都得用內(nèi)參抗體，而一般目的蛋白的抗體也就用幾次，重復(fù)三次就了事。但內(nèi)參抗體是不折不扣的耗材，嚴(yán)格意義上將，每跑一次膠，就得雜一次內(nèi)參，使用頻率最高決定了內(nèi)參是最花錢的抗體。我也自己過內(nèi)參抗體，但好像因?yàn)榉N屬同源性太高，背景總是不干凈。進(jìn)口的好，太貴；國產(chǎn)的只能使用一次，年終算賬，不比進(jìn)口的便宜。的體會(huì)是多抗并不是技術(shù)含量極高的事，為什么國內(nèi)企業(yè)高的早不了，低的造不好呢？現(xiàn)在我用的是杭州賢至的 GAPDH 兔多抗，200微升 420 元錢，我在蛋白上樣

9、量 12 微升/孔的情況下，按 1:2000 稀釋比，條帶非常清晰，沒有雜帶，是我目前用過的最好的國產(chǎn)抗體，我估計(jì)按 1:4000 照樣能做出來，因?yàn)榘窗?1:2000 稀釋做，在暗室里點(diǎn)上 ECL 后肉眼清楚地看到熒光條帶?？贵w我在不加疊氮化鈉的情況下 4 度過夜雜交，可回收重復(fù)使用 5 到 6 次。最早我是 2008 年在丁香通上看到了杭州賢至（當(dāng)時(shí)名叫杭州）發(fā)布的，我就慫恿主管買了 2 支，很好用，現(xiàn)在都沒有用完 ；2009 年我的一個(gè)朋友做 western，我他又買了 1 支，做出來的效果確實(shí)好，2009 年底我到了新的，western 的我在新重新建立，啥都采購齊了，可就是買不到杭州

10、的內(nèi)參抗體，我上網(wǎng)再也找不到這個(gè)公司的網(wǎng)頁了，沒辦法，只好一直噌朋友的內(nèi)參抗體用。我有個(gè)陋習(xí)，就是實(shí)驗(yàn)中用順了用穩(wěn)定了試劑輕易不愿意更換品牌。還好，今年 7 月份我終于找到了當(dāng)年的通訊，一聯(lián)系才知道他們改名叫杭州賢至生物科技了，呵呵，改了個(gè)名，害我找了大半年。第三次買到的 GAPDH 內(nèi)參抗體，還是好用，1:2000，條帶清晰，回收重復(fù)用，照樣 work，截止目前，新導(dǎo)師對(duì)我采購的一堆試劑還沒有不滿意的，嘿嘿！草根出生，我也照樣有我窮人的勞斯萊斯。5.關(guān)于奶粉，膜的選擇和顯影定影奶粉看似簡單，其實(shí)很重要，如果要湊合，可以到超市買光明的脫脂奶粉。奶粉質(zhì)量不好，會(huì)最終導(dǎo)致顯影要么漆黑一片，要么啥都

11、沒。fluka 的很好，可惜因?yàn)榀偱２〉脑?，現(xiàn)在進(jìn)口牛制品。我現(xiàn)在用的 bd 的，很好很穩(wěn)定，如果回收使用，500 可以用很長時(shí)間。細(xì)菌達(dá)到一定極限后，會(huì)導(dǎo)致 tbst 里的奶粉變質(zhì)，表現(xiàn)為發(fā)綠發(fā)臭，一種肉眼可察覺的淡淡的綠，一種鼻子湊過去能嗅出的臭，這時(shí)候就得扔了。nc 膜，pvdf 膜我都用過，現(xiàn)在我已經(jīng)固定下來用密理博的 0.45 微米的 pvdf 膜。pvdf 膜的好處是蛋白載量大，韌性好。唯一的麻煩是事先得用甲醇泡幾分鐘，目的好像是為了增強(qiáng)膜的正電荷。甲醇泡完后，得在轉(zhuǎn)移緩沖液里泡一兩分鐘。國內(nèi)用 nc 膜的人多一些，主要是因?yàn)?nc 膜有分裝的小片，買一張膜就 100 元錢，肯定

12、樂意，若是說膜得花上千元，就有可能長時(shí)間的思考，然后過些日子再答復(fù)你。所以大多數(shù)人會(huì)采取前式，當(dāng)然得告訴好幾次，膜就 100 元錢。我第一次用到 pvdf 膜是和好幾個(gè)合資買了一卷，我出了 475 元，類似于打的拼車的方式?，F(xiàn)在 pvdf 膜國內(nèi)大概是 1600 元到 1700 元一卷，33 厘米*375 厘米，夠好幾個(gè)人用好長時(shí)間了，膜假貨不多，至少我沒有見過。幾個(gè)拼車的窮弟兄拿著尺子分贓的時(shí)候才發(fā)現(xiàn)本地供貨商給送的貨少了 80 厘米，嘿嘿，窮鬼攆著殺叫鬼，花錢容易嗎！所以，再，直到他把的血汗膜返還才罷休?，F(xiàn)在我基本是從的和華美買，大概 1700 元一卷，完完整整。0.45 微米的 pvdf

13、 膜我用 5%的脫脂奶粉（溶于 tbst 中）室溫封閉 1 小時(shí)，0.22 微米的用 8%的脫脂奶粉。bsa 我很少用，主要是 bsa 會(huì)出現(xiàn)封閉不均勻的情況。我也很少用 0.22 微米的膜，原因是背景不干凈，20kd再者無論是封閉時(shí)間還是洗膜時(shí)間都得延長。標(biāo)準(zhǔn)上以下的 分子 用 0.22微米 的膜 ，我雜 過最 小的 分子 是cleaved-caspase3,12ka，按我在一樓的轉(zhuǎn)膜條件，在 0.45 微米的膜上的師弟他們轉(zhuǎn) 7ka的分子也用 0.45 微米的，沒清清楚楚。我在出過事。廢話一句，我?guī)煹艿膰抑攸c(diǎn)，那個(gè)富呀，讓我閉上眼想想吧，那屎殼郎掉到了化糞池的感覺。一抗我一般 4 度搖床

14、過夜，洗膜 3 此，每次 5 分鐘。要注意的是，如果一抗里添加了疊氮化鈉，務(wù)必洗膜 5 次，每次 10 分鐘，因?yàn)榀B氮化鈉會(huì)滅活二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（hrp）活性。二抗我用的是中杉金橋分裝的，120 元一支，通常 1:5000，室溫 1 小時(shí)，然后洗膜三次，每次 5 分鐘。奶粉，一抗，二抗，我都回收，從開始到現(xiàn)在，一直如此。因?yàn)槲也桓彝涀约嘿\的出身。一抗是國外的一位老師送給的，剛開始的半年我啥都做不出來，以至于導(dǎo)師在平安夜領(lǐng)我到教堂祈禱。的師弟知道后，每次裁膜的時(shí)候給我一小片一小片日積月累了一些，二抗只拿到了 10 微升，的人發(fā)現(xiàn)，一直是熬夜做western?？勺罱K還是因?yàn)樽觳焕慰?，?dǎo)致

15、東窗事發(fā)，師弟險(xiǎn)些被，事情敗露的那天，師弟在長途的那邊哭，我在這邊哭，寫著寫著，眼淚又一次的盈眶而出，說不出的辛酸與悲涼，師弟說他承擔(dān)一切責(zé)任，讓我裝作不知道，那天晚上，我給他的導(dǎo)師寫了一封長信，只求能保住師弟。老天，他導(dǎo)師讓師弟寫檢查認(rèn)錯(cuò)。那以后，沒有讓師弟為我偷過東西，我不能再為自己的理想讓朋友付出代價(jià)。雖然現(xiàn)在的比較大方，我依然堅(jiān)持著回收試劑的，我始終不能忘記自己 western blot 的開始。一般 8.3*4.3 厘米的膜，大概要 400 微升的 ecl 混合液。加 ecl 我一般就在燈光下，或者白天把窗簾拉上。加好 ecl，覆上保鮮膜后，我才端著暗盒進(jìn)暗室，暗室里暗室紅燈始終開著

16、，沒有那么可怕。在暗室里，我一般是剪 4 張同樣尺寸的膠片，疊在一起，壓在膜上方，暗盒一扣，就干別的事情去了。5 個(gè)小時(shí)或過夜，我再把膠片顯影，顯影我起初很注意技巧，但現(xiàn)在基本上是在顯影液里放 10 分鐘，撈出來放到水盤里涮一涮，然后在定影液里放十分鐘。我一般總能找到一張理想的膠片，因?yàn)槟z片疊加到一起后，層層，從而逐漸遞減熒光強(qiáng)度，我試過多次，即便是熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的內(nèi)參，也至多能達(dá)到最上面的第四層膠片。所以顯定影后，肯定有過度的膠片，但也肯定有趨勢，背景，強(qiáng)度恰到好處的一張，嘿嘿，傻瓜做法。傻瓜做法看似呆笨，實(shí)則不然。我在很長的一段時(shí)間里，都是讀秒，或三分鐘，或 15 分鐘，或，或 1 小時(shí)取出

17、膠片顯影，眼睛緊緊盯著，一看到條帶就撈出來定影。如果不理想，再壓膠片，再等，再取再投再撈，活脫脫是個(gè)“猴埋兒”。西北人小猴夭折了，母猴把小猴埋到土里面，一會(huì)又挖出來，再埋進(jìn)去，又挖出來.反復(fù)無止。顯定影時(shí)如果采取猴埋兒式的技巧，是最費(fèi)膠片，最費(fèi)時(shí)間，最費(fèi)心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的辦法。我用過好幾個(gè)品牌的國產(chǎn) ecl，和進(jìn)口的 ecl 也做過對(duì)照。國產(chǎn)的一半是 a 液 b 液總共 50 毫升 180 元錢，單價(jià) 3.6 元/毫升，一般肉眼可見的熒光強(qiáng)度可持續(xù) 1 個(gè)小時(shí)，pierce 和 milipore 的可以持續(xù) 3 小時(shí)。milipore 的麻煩之處在于由 a 液 b 液 c 液三

18、組成分組成，費(fèi)槍頭，費(fèi)腦子。現(xiàn)在我固定使用 pierce 的 super ecl，1650 元 500 毫升，折算下來是 3.3 元/毫升。是。好像分子克隆上寫出了 ecl 的配方，技術(shù)含量并不高，膠片我用過醫(yī)院放射科的，的，柯達(dá)的，柯達(dá)現(xiàn)在小膠片（盒尺寸）好像是 130 元/50 張，的是其價(jià)格的一半。的缺點(diǎn)在于膠片容易出現(xiàn)劃痕，有莫名奇妙的背景，雖然瑕不掩瑜，但還是讓人不爽，再就是感光不如柯達(dá)的靈敏。這些我都比對(duì)過。如果細(xì)心地把二者膠片厚度比比，也可看出差距。我就此請教過的總，他說根源出在牛身上。顯影液定影液我一直用的，便宜，量又足，誰用誰說好。進(jìn)口的從未染指，連想都沒想過，呵呵，我內(nèi)心里

19、還是極其渴望支貨的，愛之深，恨之切??！6.總結(jié)從 2005 年第一次見到抗體到現(xiàn)在，我已經(jīng)做 western blot 實(shí)驗(yàn)整整五年了。五年里，太多的磨難，太多的驚喜，太多的感觸，太多的代價(jià)?，F(xiàn)在我做博士后，我指導(dǎo)的學(xué)生也能一次就上手，雖然他們也會(huì)出錯(cuò)，但我很少責(zé)備他們，因?yàn)槲抑雷约旱穆吠疽膊⒉豁樌?，如果過度的責(zé)難他們，會(huì)讓他們失去信心，而且更嚴(yán)重的是會(huì)導(dǎo)致他們遮遮掩掩，我從來不怕實(shí)驗(yàn)做不出來結(jié)果，就怕查不出失敗的原因。我喜歡 western blot 技術(shù)，甚至偏愛或癡迷。最夸張的時(shí)候是一天連跑帶轉(zhuǎn)了八張膜，實(shí)驗(yàn)最不順利的那兩個(gè)月我天天就睡在里，有時(shí)候三天三夜不睡覺。我不知道自己借了從丁香

20、園的二手資源版淘過別人用剩的抗體，至今我穿的最貴的褲子也就 80 元錢，但花 1000 元買抗體我從來沒有覺得破費(fèi)。好在家人和朋友們理解我，支持我，讓我能逐步實(shí)現(xiàn)自己的愿望。五年里，從器具，試劑，儀器，甚至如何用濾紙，我都形成了自己獨(dú)有的體系和訣竅，一切東東都有品牌，這些品牌組合起來就是窮人的勞斯萊斯?；叵脒^去，內(nèi)心仍然會(huì)浸沒到悲涼與辛酸中。最難受的時(shí)候是做 p21抗體，整整半年，從丁香園淘了五個(gè)品牌的抗體，都做不出來。最后著導(dǎo)師買 cst 的抗體，還是不出，那時(shí)候正好是 2008 年雪災(zāi)，抗體在公走了半個(gè)月，我收到抗體是大年初二，興奮地上樣，轉(zhuǎn)膜，還是沒有，當(dāng)時(shí)我感覺自己就好像浸沒在冰窖里。宿舍里暖氣不好，第二天我起床時(shí)，房子里的洗臉?biāo)家呀Y(jié)冰，和心緒一模一樣。好在是一級(jí)，讓我，cst總部發(fā)回來他們的蛋白陽性對(duì)照品，再試，p21 出來了，技術(shù)支持是個(gè)人，一眼就看出來我沒有用超聲波裂解。沒有這個(gè)東東，我怎么就想不到解決問題又是兩個(gè)月。因?yàn)?western，到問題就出在這呢！從造成我博士延期一年半，害得師弟差點(diǎn)被，這也是我主動(dòng)和導(dǎo)師關(guān)系疏遠(yuǎn)的開始。但我還是癡迷 western，在我心里，western b