液相色譜故障判斷分析

1、液相色譜故障判斷分析時(shí)間：2010年11月色譜培訓(xùn)講義E-mail:色譜技術(shù)QQ群：19295477能引起HPLC發(fā)生問(wèn)題的潛在因素:工作環(huán)境 電源及地線流動(dòng)相 泵進(jìn)樣器 保護(hù)柱在線過(guò)濾器連接管路色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理裝置 操作基線問(wèn)題分析基線噪聲流動(dòng)相內(nèi)含有空氣 - 脫氣處理檢測(cè)池內(nèi)有氣泡 - 沖洗檢測(cè)池色譜柱內(nèi)有未洗脫盡的組份 - 洗脫色譜柱. 系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理電噪聲 - 去除噪聲源, 信號(hào)線屏蔽, 檢查系統(tǒng)接地狀況檢測(cè)器光源燈能量低 - 更換光源燈檢測(cè)池污染 - 沖洗檢測(cè)池基線噪聲基線噪聲基線周期性噪聲絕大多數(shù)情況下是來(lái)源于泵的問(wèn)題泵頭內(nèi)有氣泡 - 流動(dòng)相脫氣 ,泵頭排氣(注

2、意正確的排氣方法)泵進(jìn)出口閥有問(wèn)題 - 更換閥組件柱塞桿有問(wèn)題 - 更換柱塞桿及其密封圈溶劑混合不良 - 加裝混合器電噪聲 - 去除噪聲源非周期性噪聲氣泡 - 流動(dòng)相脫氣檢測(cè)池內(nèi)有氣泡 - 流動(dòng)相脫氣, 檢測(cè)池后加適當(dāng)反壓系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理溶劑混合不良 - 加裝混合器電噪聲 - 去除噪聲源基線噪聲系統(tǒng)未充分平衡梯度系統(tǒng) - 溶劑A于溶劑B的ABS值相差大 - 試用另種溶劑或使用基線扣除法色譜柱有其他組份被洗脫出 - 沖洗, 直至基線穩(wěn)定溶劑發(fā)生變化 (如溶入氣體或溶劑揮發(fā)) - 氦氣或脫氣機(jī)脫氣, 溶劑瓶避光,密封(但要 注意防止溶劑瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生負(fù)壓)系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理環(huán)境

3、溫度影響 (尤其對(duì)示差,電導(dǎo),電化學(xué)檢測(cè)) - 室溫,柱溫,檢測(cè)池溫度控制反壓變化 - 溶劑和樣品過(guò)濾. 注意黏度過(guò)大的樣品 基線漂移溫度影響 - 環(huán)境溫度及檢測(cè)池溫度控制. 注意空調(diào)機(jī)的影響溶劑混合不良 - 加裝混合器流動(dòng)相脫氣不良 - 流動(dòng)相脫氣供電電源的影響 泵不良 - 檢修處理 基線周期性波動(dòng)氣泡 - 溶劑脫氣電路接觸不良 - 保證清潔, 接線牢固, 接點(diǎn)無(wú)氧化光源燈不良- 檢查處理電噪聲 - 去除噪聲源基線有無(wú)規(guī)律的尖峰脫氣方法在線脫氣機(jī)脫氣 氦氣脫氣真空過(guò)濾脫氣注意: 溶劑應(yīng)每天脫氣脫氣方法未進(jìn)樣 泵未工作漏液流動(dòng)相或樣品的問(wèn)題柱子或保護(hù)柱的問(wèn)題數(shù)據(jù)采集裝置的問(wèn)題或其與檢測(cè)器連線的

4、問(wèn)題最簡(jiǎn)單快捷的檢查 - 泵是否工作, 系統(tǒng)是否漏液, 進(jìn)一針b苯或甲苯溶液檢查檢測(cè)器讀數(shù)及數(shù)據(jù)單元是否有響應(yīng) 無(wú)樣品峰組份的ABS值小于溶劑的ABS值氣泡通過(guò)了檢測(cè)池對(duì)RI檢測(cè)器不一定是有了問(wèn)題，很可能是正常的所有峰都是負(fù)峰 - 可能是檢測(cè)器輸出與數(shù)據(jù)單元連線 極性接反負(fù)峰兩個(gè)要點(diǎn)- 峰保留時(shí)間(RT)重現(xiàn)性, 峰面積重現(xiàn)性RT重現(xiàn)性不好 - 無(wú)規(guī)律變化 : *流量不穩(wěn) - 氣泡, 漏液, 泵 *溫度影響 有規(guī)律的變化, 且逐漸趨于穩(wěn)定 : 系統(tǒng)未充分平衡 RT 重現(xiàn)性好, 但峰面積重現(xiàn)性不好 *進(jìn)樣量-選用定量管進(jìn)樣時(shí),進(jìn)樣體積應(yīng)大于3倍定量管容積; *樣品, 氣泡; *樣品在流動(dòng)相各組份

5、中不能充分溶解(通常伴隨有柱壓逐漸升高 且經(jīng)反沖后,柱壓會(huì)恢復(fù)正常之現(xiàn)象); *基線噪聲的影響; *積分處理的影響;系統(tǒng)性能HPLC 系統(tǒng)組件 * 泵* 進(jìn)樣器/自動(dòng)進(jìn)樣器* 色譜柱* 檢測(cè)器* 數(shù)據(jù)系統(tǒng)所有組件均會(huì)發(fā)生問(wèn)題，都需要進(jìn)行故障排除！ HPLC色譜柱故障癥狀A(yù). 色譜柱柱壓B. 色譜峰峰形色譜柱柱壓柱壓過(guò)高 查原因，矯正柱壓陶瓷片堵塞色譜柱污染色譜柱填料堵塞1 . 清洗色譜柱-清除色譜柱污染物和堵塞的柱填料-大分子量/色譜柱吸附物-樣品或緩沖液沉淀2.反沖色譜柱-清洗堵塞的陶瓷片3.更換陶瓷片* 柱壓?jiǎn)栴}有時(shí)由系統(tǒng)或預(yù)柱堵塞引起檢查有 / 無(wú)色譜柱時(shí)系統(tǒng)的壓力色譜柱柱壓沖洗色譜柱-

6、用比流動(dòng)相更強(qiáng)的溶劑反相色譜柱用以下溶劑至少各25mL沖洗色譜柱(分析柱) * 不含緩沖鹽的流動(dòng)相* 100%甲醇* 100%乙腈* 75%乙腈+25%異丙醇* 100%異丙醇 * 100%二氯甲烷 * 100%己烷*若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱，則在重新使用反相流動(dòng)相以前，必須用異丙醇沖洗色譜柱 !正相色譜柱用以下溶劑至少各50mL沖洗色譜柱(分析柱)* 50%甲醇+50%三氯甲烷* 100%乙酸乙酯色譜柱柱壓色譜柱柱壓 預(yù)防柱壓過(guò)高采取色譜柱保護(hù)措施樣品制備適當(dāng)適時(shí)沖洗色譜柱含緩沖鹽的流動(dòng)相一定要過(guò)濾保持更換緩沖液和水色譜峰峰形 * 裂分峰* 色譜峰拖尾* 色譜峰峰擴(kuò)展* 柱效低色譜柱“

7、二次作用色譜柱死體積色譜柱污染色譜柱壽命色譜柱容量柱外效應(yīng) 許多色譜峰峰形問(wèn)題都是復(fù)合型問(wèn)題色譜峰峰形 裂分峰* 色譜柱污染復(fù)雜樣品基體或待測(cè)樣品量大* 顆粒物堵塞陶瓷片復(fù)雜樣品基體或待測(cè)樣品量大* 色譜柱死體積流動(dòng)相pH7時(shí)，硅膠溶解(除非使用特殊色譜柱)* 樣品溶劑效應(yīng)樣品溶劑強(qiáng)于流動(dòng)相-裂分峰和擴(kuò)展峰取決于樣品量色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形裂分峰的原因1. 樣品基體或待測(cè)物復(fù)雜色譜柱污染物或顆粒物堵塞陶瓷片濾芯2. 流動(dòng)相 pH 7由于硅膠溶解導(dǎo)致色譜柱死體積增加（可使用能承受高pH的特殊固定相色譜柱避免此問(wèn)題）3. 樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動(dòng)相裂分峰和色譜峰擴(kuò)寬（與進(jìn)樣體積有關(guān)）色譜峰

8、峰形 拖尾峰* 考慮流動(dòng)相效應(yīng)改變流動(dòng)相pH或添加化學(xué)試劑消除二次作用* 考慮色譜柱選擇選用高純硅膠色譜柱或不同鍵合技術(shù)色譜柱* 減少樣品進(jìn)樣量* 消除色譜柱柱外效應(yīng)沖洗色譜柱，檢查色譜柱壽命和死體積色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形色譜峰峰形峰拖尾-柱外體積0.12mm內(nèi)徑管線用于毛細(xì)管HPLC中2.1內(nèi)徑色譜柱0.17mm內(nèi)徑管線用于分析型HPLC中2.14.6內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑管線用于半制備型HPLC中9.4內(nèi)徑色譜柱0. 5mm內(nèi)徑管線用于制備型HPLC中21.2內(nèi)徑色譜柱50 mL 柱外體積（管線）4321Time (min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 mL 柱外體積Time (min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.04321樣品: 1. 苯丙胺酸2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸3. Asp-Phe 4. 天冬甜素色譜柱: StableBond SB-C18, 4.6 x 30 mm, 3.5 mm 流動(dòng)相: 85% H2O with 0.1% 三氟乙酸 : 15% ACN 流速: 1.0 mL/min 溫度: 35C色譜峰峰形保留時(shí)間保留，色譜柱和分析結(jié)束時(shí)間都發(fā)生改變* 色譜柱壽命* 色譜柱污染* 平衡時(shí)