大鼠肺泡巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的改良措施

1、大鼠肺泡巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)措施【摘要】目的改進(jìn)原代肺泡巨噬細(xì)胞(alvelararphage,A)培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)步A培養(yǎng)效果。方法SD大鼠，在體支氣管灌洗肺獲取A，通過(guò)預(yù)先注射空氣、14號(hào)注射器針頭回收灌洗液、低速離心、種板前屢次吹打等改進(jìn)措施別離和培養(yǎng)A。倒置顯微鏡連續(xù)觀察A的形態(tài)變化，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)鑒定A存活率，瑞氏-姬姆薩染色鑒定A純度。結(jié)果A體外培養(yǎng)后40in即見(jiàn)細(xì)胞貼壁;23天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形、不規(guī)那么形、梭形等形態(tài)，胞體變大，胞質(zhì)豐富。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)示A存活率95%，瑞氏-姬姆薩染色示A純度95%。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了原代A培養(yǎng)的技術(shù)方法，進(jìn)步了原代A培養(yǎng)效果?！娟P(guān)鍵詞】

2、肺泡巨噬細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);技術(shù)改進(jìn)Abstrat:bjetiveTdifythetehniquesfrpriaryulturefhighlypurifiedthepriaryratalvelararphages(As).ethdsAsereislatedinvivandulturedithsuhdifiedtehniquesaspre-injetinfairandrelaatinfbrhalvelarlavagefluidith14-buglesyringeneedle,l-speedentrifugatinandulti-blingbefreplatingn6-ellultureplates.

3、Therphlgialhangeserebservedundertheinvertedirspe.Theellsurvivalrateasdetetedithtrypanbluedyeexlusintest,andellpurityasdeterinedbyright-Giesastaining.ResultsInvitr,Asadheredtplastisurfaeithin40in;2-3dayslater,ellrphlgypresentedixedshapes,i.e.,irular,irregularandspindleshapes.Thetrypanbluetestshedasur

4、vivalrate95%ftheAsandright-Giesastainingindiatedapurity95%ftheAs.nlusinThedifiedtehniqueseplyedinurexperienthadbetterresultsfrtheislatinandpriaryulturefAs.Keyrds:alvelararphage;ellulture;tehniquedifiatin肺泡巨噬細(xì)胞(alvelararphage，A)分布于呼吸道-肺泡外表，是肺部抗感染的第一道防線(xiàn),是肺部抵抗病原感染的重要組成局部。A不僅具有吞噬和抗原遞呈功能，而且還能分泌多種生物活性物質(zhì),對(duì)

5、急性肺損傷的發(fā)生、開(kāi)展及轉(zhuǎn)歸具有重要影響1-3，因此，A一直是研究肺部抗感染模型的重要細(xì)胞類(lèi)型。但由于在別離培養(yǎng)原代A過(guò)程中存在獲取率低、混雜紅細(xì)胞、容易污染損傷、不易貼壁等技術(shù)難題4，目前國(guó)內(nèi)外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株H-S5、大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR83836等細(xì)胞株替代原代A，然而A細(xì)胞株與原代培養(yǎng)的A在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力及細(xì)胞生理等方面存在明顯差異。因此，優(yōu)化原代A培養(yǎng)技術(shù)從而得到理想的A對(duì)研究肺部感染性疾病發(fā)活力制有很重要的作用。本研究討論A培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)措施及考前須知。1材料和方法1.1材料1.1.1動(dòng)物安康雄性SD大鼠，體重200250g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.

6、1.2主要試劑和器材DE(低糖)培養(yǎng)基(Gib公司)，胎牛血清(杭州四季青)，青霉素、鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份)，PBS(北京中杉金橋生物技術(shù))，臺(tái)盼藍(lán)染液(Siga公司)，瑞氏-姬姆薩染液(南京建成科技)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)TherFisherSientifi)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備)，倒置顯微鏡(日本ti公司)，離心機(jī)(美國(guó)Bekan公司)。1.2方法1.2.1A的別離培養(yǎng)在參考郭曉芳等7-8別離A技術(shù)的根底上，我們對(duì)別離A的方法加以改進(jìn)。SD大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引頸處死;在75%乙醇中浸泡消毒12in，移到超凈工作臺(tái)上，仰臥于小手術(shù)臺(tái)上，固定頭尾;翻開(kāi)胸腔，暴露肺;暴露

7、頸部氣管，用14號(hào)注射器針頭從頸部正中線(xiàn)切口行氣管插管，用4-0的手術(shù)縫合線(xiàn)結(jié)扎固定8-9。用冷PBS在體氣管灌洗肺，同時(shí)按摩肺，每次510l，灌洗10次，灌洗液回收率為90%。灌洗液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾，1000r/in低速離心10in，棄上清，再用PBS洗滌2次，參加含10%胎牛血清的DE培養(yǎng)液重懸沉淀細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。在倒置顯微鏡下進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞密度為1109個(gè)/L，將其接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。在37、5%2濃度的培養(yǎng)箱中孵育12h，棄上清，用PBS洗板2次去除非貼壁細(xì)胞，重新參加含10%胎牛血清的新穎DE培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，23天更換培養(yǎng)液。

8、1.2.2臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)將0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液10與等體積單細(xì)胞懸液混合，染色23in,取1滴混合懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)。鏡下觀察可見(jiàn)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞和未藍(lán)染細(xì)胞。細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算:細(xì)胞存活率(%)=未染色細(xì)胞/(藍(lán)染細(xì)胞+未染色細(xì)胞)100%。1.2.3瑞氏-姬姆薩染色取5l單細(xì)胞懸液于載玻片上，制成涂片。待涂片晾干后，按瑞氏-姬姆薩染液試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。染色完成后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，鑒定單細(xì)胞懸液中A純度。計(jì)算公式如下：細(xì)胞純度(%)=著色巨噬細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%2結(jié)果2.1顯微鏡觀察結(jié)果單細(xì)胞懸液中A呈圓形，透亮，培養(yǎng)40in后可觀察

9、到呈橢圓形、三角形或不規(guī)那么形的貼壁細(xì)胞，胞質(zhì)豐富;2h后細(xì)胞貼滿(mǎn)培養(yǎng)皿底部，細(xì)胞呈星形，有許多偽足和突起(圖1A);培養(yǎng)23天后，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形、不規(guī)那么形、梭形等形態(tài)，胞體變大，胞質(zhì)豐富(圖1B)，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期，合適進(jìn)展實(shí)驗(yàn)研究。圖1A的形態(tài)學(xué)變化(300)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.A.肺泡巨噬細(xì)胞貼壁2h;B.肺泡巨噬細(xì)胞貼壁2天2.2臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)細(xì)胞呈圓形透亮存活狀態(tài);極個(gè)別細(xì)胞破壞死亡，臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)呈藍(lán)染狀(圖2)。肺泡巨噬細(xì)胞的存活率95%。2.3瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果A胞質(zhì)呈灰色，胞質(zhì)顆粒呈細(xì)小淡紫紅色，核呈紫紅色;同時(shí)可見(jiàn)核呈紫紅色、胞質(zhì)呈淺紅色并有淡紫

10、紅色顆粒的中性粒細(xì)胞。A細(xì)胞純度95%(圖3)。圖2肺泡巨噬細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色(400)圖3肺泡巨噬細(xì)胞瑞氏-姬姆薩染色(600)3討論目前原代A培養(yǎng)在別離、培養(yǎng)過(guò)程中存在多種技術(shù)難題。在別離A時(shí)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了多種改進(jìn)措施，獲得了滿(mǎn)意的效果：灌洗前一定要把肺內(nèi)血液驅(qū)除徹底，減少灌洗液中紅細(xì)胞數(shù)量，減少雜質(zhì);重懸細(xì)胞單細(xì)胞懸液時(shí)，要充分吹打細(xì)胞使之分散均勻，利于細(xì)胞貼壁;PBS洗板及給細(xì)胞換液時(shí)，動(dòng)作要緩慢，以免貼壁細(xì)胞脫壁，影響搜集肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)量。為了保持培養(yǎng)的原代A的活力，在別離和培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，本研究采取了以下措施:大鼠麻醉處死后到灌洗肺的時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響細(xì)胞活力，整個(gè)過(guò)程要在

11、冰浴上進(jìn)展，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高將導(dǎo)致細(xì)胞死亡;大鼠浸泡乙醇消毒時(shí)，盡量在呼吸停頓后浸泡，防止由于誤吸乙醇破壞A;采用低速離心方法別離A，防止破壞細(xì)胞構(gòu)造，影響細(xì)胞活力;A種板時(shí)參加10%胎牛血清可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，增加細(xì)胞活力，促使細(xì)胞恢復(fù)其原來(lái)生理狀態(tài);在實(shí)驗(yàn)前去除血清，增加A對(duì)藥物的敏感性。另外，在培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中，菌室和超凈臺(tái)要常規(guī)消毒，整個(gè)過(guò)程要注意無(wú)菌操作，防止細(xì)胞污染。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用以上改進(jìn)措施后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)及瑞氏-姬姆薩染色方法鑒定，可以得到大量純度高、活性好的A，為開(kāi)展大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能及細(xì)胞生理、病理模型研究奠定了良好基?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1AsehnuneK

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