基礎(chǔ)生化實驗

1、蛋白質(zhì)純化一、目的：利用金屬親和性管柱(metal affinity column)來大量純化帶有affinity tag的基 因重組蛋白。二、原理：由于六個 Histidine 所組成的 His Tag (metal affinity tag)可與 Ni2+ bind，所 以利用基因重組技術(shù)在表現(xiàn)的蛋白質(zhì)加上His Tag，再以金屬親和性管柱 (Ni-NTA)(此His- tag序列可與帶二價正電的陽離子相螯和)及l(fā)iquid chromatography來大量純化蛋白質(zhì)。三、試劑與器材：1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,

2、50Mm Tris-HClPh7)細(xì)菌回溶成為蛋白質(zhì)的載體以保持活性wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上課補(bǔ)充： 蛋白質(zhì)很脆弱，需要在特殊的buffer里。四、儀器與設(shè)備：FPLC（速液相色譜儀）五、步驟：將管柱架在鐵架上，把親和性膠體懸浮裝填于管柱內(nèi)。以23倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白質(zhì)樣本。以 wash buffer 梳洗，2 到 3 倍 column 體積。用wash buff

3、er和elution buffer進(jìn)行線性梳洗，并收集流出液體，以FPLC UV monitor上的OD280數(shù)據(jù)讀取樣品流出與否，并觀察沖離液之 曲線圖。上課補(bǔ)充：胞內(nèi)型分泌需要用超音波破菌，因為會放熱所以要放在冰中使用。線性梳洗為加入elution buffer會有顏色變化會把竦離子跟imidazole沖 洗掉，剩下膠體溶液。其中imidazole和Histidine類似也會和竦離子結(jié)合所以會競爭，可拿來洗滌蛋白質(zhì)。（可詳見問題一及補(bǔ)充資料2）六、問題: 問題一:Imidazole的結(jié)構(gòu)與特性。Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一個五元雜環(huán)芳香性有機(jī)化合物，化學(xué)式c3h4n2。

4、它也是一個生物堿。白色或淺黃色固體結(jié)品，可溶于水、氯仿、醇、醚，具有酸性，也具有堿性。氫原子在兩個氮原子之間移動，因此存在兩個 互變異構(gòu)體。咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)在生物分子中廣泛存在，例如組氨酸和對應(yīng)的荷爾蒙組胺。很多 藥物也包含有咪唑環(huán)，例如硝基咪唑和咪唑類抗真菌藥物。咪唑43HHH21英文名ImidazoleIUPAC英文名1,3-diazoleIUPAC中文名1,3-二唑別名間二氮茂、在甘惡琳識別CAS號288-32-4RTECS 號N13325 1985-86性質(zhì)化學(xué)式C3H4N2摩爾質(zhì)量68.08 g mol 1外觀白色或淺黃色固體密度1.23 g/cm3熔點89-91 C (362-364 K

5、)沸點256 C (529 K)在水中的溶解度易溶PKa14.5Pt6.95結(jié)構(gòu)晶體結(jié)構(gòu)單斜分子構(gòu)型平面五元環(huán)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)咪唑為平面五元環(huán)狀化合物，易溶于水（以無限比例）和其它極性溶劑。咪 唑的兩個氮原子間存在永久偶極，極性很強(qiáng)，偶極矩為3.61D，并且分子間存在 氫鍵締合，導(dǎo)致了咪唑具有反常高的沸點（256 C）。分子中存在一個6電子共軛大n鍵，故具有典型的芳香性。與氫以。鍵相連的氮原子提供一對電子，環(huán) 內(nèi)其余四個原子各提供一個電子成鍵。1N上有氫的咪唑環(huán)中，氫原子可以在兩個氮原子間遷移，存在兩個互變異構(gòu)體，C-4和C-5是等同的。這兩個互變異構(gòu)體無法分離，當(dāng)有取代基時，常以4(5)-取代咪唑

6、(如4(5)-甲基咪唑)來命名。組氨酸生成組胺的反應(yīng)如下所示：咪唑一個用途是在金屬螯合親和層析(IMAC)中用于His標(biāo)簽蛋白的純化。標(biāo)簽蛋白與層析柱表面珠孔內(nèi)的竦離子介質(zhì)發(fā)生結(jié)合，過量的咪唑通過層析柱， 將與竦配位的標(biāo)簽蛋白洗脫下來，得到高純度的目標(biāo)蛋白。咪唑是許多藥品的重要組成部分。許多殺菌劑和抗真菌、抗原蟲和抗高血壓 的藥物中含有合成咪唑。咪唑是茶葉和咖啡豆中含有的茶堿分子的組成部分，具有刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。通過干擾DNA的活動抑制白血病的抗癌藥物巰嘌吟中也含有咪唑。問題二:2.ETDA的資料(整理)EDTA 又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic

7、 Acid)簡稱：EDTA俗名；依地酸（特別是它的鈣鹽 絡(luò)合物,醫(yī)學(xué)上稱為依地酸鈉鈣分子量：292.248 分子式： C10H16N2O8為白色無臭無味、無色結(jié)品性粉末，熔點240 C （分解）。不溶于冷水、醇及一般有機(jī)溶劑，微溶于熱水，溶于 氫氧化鈉，碳酸鈉及氨的溶液中， 能溶于160份100C沸水。為一種有機(jī)化合物。它是一個六齒配體，可以螯著多種金屬離子。它的4個酸和2個胺的部分都可作為配體的齒，與錳（II）、銅（II）、鐵（111）及鈷（111）等金屬離子組成螯合物化學(xué)家曾經(jīng)用多種不同的字來形容EDTA，例如將配體本身叫做EDTA4，而它的共軛酸叫做h4edta。配合物EDTA和金屬的螯

8、合物，EDTA和其他化合物如H2IDA （亞胺基二乙酸）和H3NTA （氨三乙酸）等屬于同類的螯合物，這些配體都是由一種叫做甘氨酸的胺基酸制成的。EDTA類的螯合物都極易溶于水。這些配體都為三或四齒配體，而 合成出來的螯合物都是光學(xué)異構(gòu)物。用途在1999年歐洲EDTA年消耗量為35,000噸，在美國為50,000噸，其重要的用 途如下：工業(yè)：清理重金屬離子及Ca2+和Mg2+離子。肥皂：與硬水中的Ca2+和Mg2+離子結(jié)合來降低硬度。攝影：以Fe(III)EDTA作為氧化劑。紡織品：與重金屬結(jié)合。食物：作為防腐劑來避免重金屬的氧化?；瘖y品：加上EDTA來保存化妝品。油生產(chǎn)：加上EDTA來防止礦

9、物沈淀。牛奶：清洗牛奶瓶。氮氧化物：廢氣的處理。生物醫(yī)學(xué)：o汞毒治療：使用EDTA的二鈉鈣鹽-乙二胺四乙酸二鈉鈣3 (EDTANa2-Ca )治療重金屬中毒。可治療汞中毒的人，也可治療鉛中毒的人。利用EDTA與重金屬結(jié)合的特性，生成穩(wěn)定而可溶的鹽， 隨尿液排出。o檢驗醫(yī)學(xué)：作為血液等液體類標(biāo)本的抗凝劑(如全血細(xì)胞計數(shù)時所 采用的血液標(biāo)本)。o牙醫(yī)學(xué)：在根管治療術(shù)中用來清除一些有機(jī)或無機(jī)的物質(zhì)。O生物化學(xué)：在分子生物學(xué)中用EDTA來防止金屬離子對酶的影響4。汽水：汽水中含有的維生素C和苯甲酸鈉有機(jī)會產(chǎn)生致癌物質(zhì)苯，可以EDTA來處理。水的測試：測試水的硬度。環(huán)境問題EDTA不能在污水處理中被分解

10、，不過在控制著pH值的情況下，經(jīng)長時間 后EDTA就會幾乎完全反應(yīng)了，當(dāng)其時要將其他微生物抽離，來讓EDTA完成 結(jié)合的過程。在水中，太多或太少的螯合物都會影響浮游生物和藻類的數(shù)量，可 以是增加或者減少。EDTA對細(xì)菌來說是有毒的，在哺乳類動物的糞便中會破 壞生物的細(xì)胞膜。問題三:Tris-HCL是甚么？答:Tris-HCl是三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的英文名稱的縮寫，用作生物緩沖劑,添加劑英文名Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride另|名 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochlori

11、de; Tromethanehydrochloride; Trizma hydrochloride別名：2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇鹽酸鹽三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽分子式:C4H11NO3.HC1分子量:157.59物理化學(xué)性質(zhì)熔點:150-152C為水溶性SOLUBLEch2ohHOHCNH34C|-結(jié)構(gòu)式：二.-IIpKa ( 25C ):pH ( 0.5M in water ) 3.5 5.0問題四：為何使用UV波長為280 nm?答:一般有機(jī)物質(zhì)，對于波長在250 nm以下的光才有吸收作用，但含有苯環(huán)的 胺基酸(aromatic amino acids)，對于波長250 nm以上的

12、光卻有吸收作用。凡 含有此等胺基酸的蛋白質(zhì)，其水溶液對于波長在260 nm至290 nm (通常取280 nm波長)之光，均有吸收作用，其吸收量與蛋白質(zhì)溶液的濃度成正比。所以含有 phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白質(zhì)，均可采用此法來定量。利用 UV光OD280(波長280nm)可偵測蛋白質(zhì)的特性，可以將從管柱流出的蛋白質(zhì)繪出吸收峰圖型，在對照圓盤內(nèi)所收集純化蛋白質(zhì)的tube，搭配蛋白質(zhì)電泳SDS觀測，取自tube內(nèi)的液體進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，可以更加確定蛋白質(zhì)的 分子量及純度。七、補(bǔ)充資料：1.快速液相色譜儀(FPLC)利用快速液相色譜儀搭配不同性質(zhì)和特性的純化

13、蛋白質(zhì)用的管柱，依照研究目標(biāo) 蛋白質(zhì)的特性，可以從已破菌的菌液中分離出來。純化蛋白質(zhì)用的管柱，可以分為：親和性管柱:經(jīng)典代表為竦金屬的樹脂，當(dāng)將研究目標(biāo)在其蛋白質(zhì)的頭尾端，加上6個His(與鑷金屬結(jié)合形成敖合物)，之后在利用與His類似的化合物，與竦金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)競爭，進(jìn)而分離出帶走6個His的研究目標(biāo)蛋白質(zhì) 分子篩管柱：可以依照分子量大小不同，導(dǎo)致流出管柱的時間點不同來分離 離子樹質(zhì)管柱：利用蛋白質(zhì)在不同pH值下，會使蛋白質(zhì)改變其本身的電荷， 來達(dá)到吸附管柱的效果，將研究目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他大腸桿菌本身所攜帶的蛋 白質(zhì)分離。-快速液相色譜儀(FPLC)2.組胺酸(Histidine)組胺酸縮寫

14、:His, H化學(xué)式:c6h9n3o2摩爾質(zhì)量：155.16 gmoilpKa2 = 6.0 （咪唑環(huán)）而這次實驗所使用的六個Histidine結(jié)構(gòu)與竦離子結(jié)合如下圖3.螯合物與螯合劑螯合物又稱內(nèi)絡(luò)合物，是螯合物形成體（中心離子）和某些合乎一定條件的 螯合劑（配位體）配合而成具有環(huán)類架構(gòu)的配合物。“螯合”即成環(huán)的意思，猶如 螃蟹的兩個螯把形成體（中心離子）鉗住似的，故叫螯合物。形成螯合物的第一個條件是螯合劑必須有兩個或兩個以上都能給出電子對 的配位原子（主要是N，O, S等原子）。第二個條件是每兩個能給出電子對的 配位原子，必須隔著兩個或三個其他原子，因為只有這樣，才可以形成穩(wěn)定的 五原子環(huán)或六原子環(huán)。例如，在氨基乙酸根離子（H2N-CH2-COO-）中，給出 電子的羥基氧和氨基氮之間，隔著兩