聚乙烯亞胺介導(dǎo)的E1A基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的化療增敏效應(yīng)

1、散乙烯亞胺介導(dǎo)的E1A基果對肝癌細(xì)胞的化療刪敏效應(yīng)孫海歉，劉東圓，劉永彪【摘要】目的以自止分解的散乙烯亞胺(plyethyleniine,PEi)納米凝膠為載體轉(zhuǎn)染E1A基果，其真沒有俗觀察E1A基果對肝癌細(xì)胞體中死少的抑制做用及其對化療藥物的刪敏效應(yīng)，初步探求其做用機(jī)制。要收經(jīng)PEI介導(dǎo)，將真核細(xì)胞下效表達(dá)E1A基果的重組量粒psv-E1A導(dǎo)進(jìn)人肝癌H22細(xì)胞，RT-PR證實(shí)其轉(zhuǎn)染，G418挑選出陽性克隆細(xì)胞，沒有俗觀察EIA基果對該細(xì)胞系死少的抑制做用。用TT法測定轉(zhuǎn)染E1A基果前后，逆鉑、泰素、5-氟尿嘧啶、專去霉素對肝癌H22細(xì)胞的效應(yīng)。結(jié)果量粒psv-E1A測序結(jié)果與基果庫E1A基果

2、序列完好契開。G418挑選出陽性克隆細(xì)胞。RT-PR結(jié)果表示PEI能轉(zhuǎn)染量粒psv-E1A并有穩(wěn)定的表達(dá)。轉(zhuǎn)染E1A基果后，H22-E1A細(xì)胞對逆鉑、專去霉索、泰素的敏理性較著前進(jìn)P0.01，而對5-氟尿嘧啶的敏理性無隱著變化P0.05。結(jié)論P(yáng)EI能一般轉(zhuǎn)染量粒psv-E1A,E1A基果可以大概隱著抑制肝癌H22細(xì)胞的死少，并隱著前進(jìn)其對逆鉑、專去霉索及泰素等化療藥物戰(zhàn)放射線的敏理性。其機(jī)制年夜要與E1A基果改動腫瘤細(xì)胞的刪殖形態(tài)戰(zhàn)細(xì)胞周期時(shí)相有閉?！鹃]鍵詞】E1A基果；基果轉(zhuǎn)染；肝癌細(xì)胞；散乙烯亞胺；四甲基奇氨唑鹽微量染色法基果醫(yī)治的載體主要分為病毒載體系統(tǒng)戰(zhàn)非病毒載體系統(tǒng)。因?yàn)椴《据d體有免

3、疫本性下、毒性年夜、目的基果容量孝靶背特同性好、制備較龐年夜及費(fèi)用較下檔缺陷，人們愈去愈重視非病毒載體的研討。非病毒載體較安好，免疫本性低,并且是基于量粒的轉(zhuǎn)染，易于組拆。散乙烯亞胺(plyethyleniine,PEI)是近年去研討最為廣泛的陽離子多散物非病毒基果載體之一，1995年，Bussif等1起尾報(bào)導(dǎo)了PEI可做為非病毒載體。后去,PEI成為非病毒載體研討死少最快的范圍，其中線型戰(zhàn)收鏈狀的PEI是研討最死動、基果轉(zhuǎn)導(dǎo)從命最下的陽離子散開物之一?；t(yī)治的另外一個(gè)閉鍵是目的基果，E1A基果可以做用于腫瘤細(xì)胞的多個(gè)癌基果戰(zhàn)抑癌基果，如調(diào)控p53、HER-2/neu、RB戰(zhàn)n23等癌基果戰(zhàn)

4、抑癌基果；并且E1A基果的做用沒有依托腫瘤細(xì)胞的基果形態(tài)，那使得E1A基果醫(yī)治較其他針對單一癌基果或抑癌基果的基果醫(yī)治(如p53基果)具有更好的使用價(jià)格戰(zhàn)近景。本研討以PEI為載體，將真核細(xì)胞下效表達(dá)E1A基果的重組量粒psv-E1A導(dǎo)進(jìn)人肝癌細(xì)胞系H22，RT-PR證實(shí)其轉(zhuǎn)染，用TT法測定轉(zhuǎn)染E1A基果前后，逆鉑、泰素、5-氟尿嘧啶5-Fu、專去霉素對腫瘤細(xì)胞敏理性的做用,對闡收下份子樹枝狀納米載體正在腫瘤靶背醫(yī)治中的安好、有效轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有慌張意義戰(zhàn)較年夜的使用價(jià)格。1材料戰(zhàn)要收1.1材料本課題操縱掌握粒徑準(zhǔn)確可控納米凝膠光化開分解要收，以火溶液光化教法分解具有各種粒徑的PEI納米凝膠2-3。

5、詳細(xì)參數(shù)睹表1。表1PEI的參數(shù)略由上海東圓肝膽醫(yī)院蘇少青教授惠贈,正在DH5-菌株中擴(kuò)刪，用DNA量粒雜化試劑盒(QIAGEN公司)制備量粒。量粒D260/D280比值正在1.61.9之間,過濾除菌，20保存。H22肝癌細(xì)胞購自北京凱基死物科技死少，死少正在露10%小牛血渾FS的RPI1640培養(yǎng)基中。1.2要收本真止使用PEI轉(zhuǎn)染量粒psv-E1A進(jìn)肝癌細(xì)胞，G418挑選其陽性克隆細(xì)胞，RT-PR證實(shí)，分別減逆鉑、專去霉素、泰素、5-Fu進(jìn)陽性克隆細(xì)胞及已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，24h后TT法測量保存率,沒有俗觀察E1A基果對多種做用機(jī)制沒有一樣的化療藥物有沒有刪敏做用。從基果庫內(nèi)查E1A基果序列,并

6、圓案引物。上游引物：5-ggaggtgttattagaag-3；鄙俚引物:5-tgtatgggtggaaag-3。E1A基果測序結(jié)果與從基果庫內(nèi)下載的E1A基果序列完好劃一。轉(zhuǎn)染復(fù)開物的N/P比值對轉(zhuǎn)染從命的影響很年夜。N/P比值指的是轉(zhuǎn)染復(fù)開物中PEI份子所露的N本子與DNA份子中所露的P本子的摩我比。1g的DNA份子中露有3nl的P本子。按照沒有同的N/P比值調(diào)整PEI溶液(4.3g/l)的操縱量(表2)。表2沒有同N/P比值的PEI溶液的操縱量略按表3制備50lPR反響：離心數(shù)秒，上PR儀擴(kuò)刪，瓊脂糖凝膠電泳沒有俗觀察結(jié)果。表3PR反響組成略9lDNA樣品中參與2l上樣緩沖液混勻，混勻后

7、的樣品參與樣品心中上樣,100V、60A電泳30in。1.3統(tǒng)計(jì)教處理采與SPSS10.0統(tǒng)計(jì)硬件舉止統(tǒng)計(jì)教處理。真止數(shù)據(jù)以s表示，E1A基果對細(xì)胞死少速度的影響及E1A基果的化療刪敏性采與配伍組圓好闡收t檢驗(yàn)，P0.05為統(tǒng)計(jì)教上有較著性沒有同。2結(jié)果2.1E1A基果對逆鉑化療的做用TT法測定沒有同濃度逆鉑處理H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值492n睹表4。沒有同濃度逆鉑處理后H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值之間均有統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05；沒有同濃度逆鉑與比力組之間亦有統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。比力組之間無統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。提醒E1A基果對逆鉑化療有刪敏做用。表4沒有同濃度逆鉑對H22戰(zhàn)

8、H22-E1A細(xì)胞刪殖的影響略2.2E1A基果對泰素化療的做用TT法測定沒有同濃度泰素處理H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值492n睹表5，沒有同濃度泰素處理后H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值之間均有統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。比力組之間無統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。提醒E1A基果對泰素化療有刪敏做用。表5沒有同濃度泰素對H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞刪殖的影響略2.3E1A基果對5-Fu化療的做用TT法測定沒有同濃度5Fu處理H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值492n睹表6，沒有同濃度5-Fu處理后H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值之間均無統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05；沒有同濃度5-Fu與比力組之間亦無統(tǒng)計(jì)教沒有同

9、P0.05。比力組之間無統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。提醒E1A基果對5-Fu化療無刪敏做用。表6沒有同濃度5-Fu對H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞刪殖的影響略2.4E1A基果對專去霉素化療的做用TT法測定沒有同濃度專去霉素處理H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值492n睹表7，沒有同濃度專去霉素處理后H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的D值之間均有統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05；比力組之間無統(tǒng)計(jì)教沒有同P0.05。提醒E1A基果對專去霉素化療有刪敏做用。表7沒有同濃度專去霉素對H22戰(zhàn)H22-E1A細(xì)胞的影響略3會商基果醫(yī)治的主要目的便是將基果材料運(yùn)收到細(xì)胞中去以改動它的成效，從而使得死物有機(jī)體可以大概一般天運(yùn)轉(zhuǎn)。挑選契

10、開的載體,使目的基果靶背、可控并有效表達(dá),是基果醫(yī)治成功的閉鍵。1995年,Bussif等1起尾報(bào)導(dǎo)了PEi可做為非病毒載體,稀釋DNA,并黏附到細(xì)胞膜上,進(jìn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi),使真核表達(dá)量粒正在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，后去，PEI成為非病毒載體研討最快的范圍。如今國內(nèi)還沒有商品化的PEI供應(yīng)。做為具有抑制腫瘤做用的基果，腺病毒5型E1A基果正在腫瘤細(xì)胞的基果調(diào)控及醫(yī)治圓里闡揚(yáng)較慌張的做用。E1A基果轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過沒有同的拼接收死12S戰(zhàn)13S兩種RNA，分別翻譯243R戰(zhàn)289R兩種主要的卵黑產(chǎn)品。E1A-289R共有3個(gè)成效區(qū)，即N-終了Rl、R2、R3區(qū)。E1A-243R除沒有具有R3區(qū)中，其他與E1A-289R

11、一樣。N-終了的RI區(qū)經(jīng)由過程與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子P300BP結(jié)開，能抑制HER-2neu基果的表達(dá)；R2區(qū)與Rb卵黑家眷結(jié)開；R3區(qū)是轉(zhuǎn)錄活化區(qū)4-5。E1A基果可以做用于腫瘤細(xì)胞的多個(gè)癌基果戰(zhàn)抑癌基果，如調(diào)控p53、HER-2neu、RB戰(zhàn)n23等癌基果戰(zhàn)抑癌基果；并且E1A基果的做用沒有依托腫瘤細(xì)胞的基果形態(tài)6，那使得E1A基果醫(yī)治較其他針對單一癌基果或抑癌基因?yàn)槟康牡幕t(yī)治(如p53基果)具有更好的使用價(jià)格戰(zhàn)近景。PEI與DNA的結(jié)開主假如經(jīng)由過程電荷做用,當(dāng)DNA與一種適宜的陽離子散開物份子結(jié)開時(shí),帶背電荷的DNA份子被縮分解濃散的、有序的、曲徑為50200n的納米粒子,那心角病毒陽離子散

12、開物載體的超份子化教做用的基矗本真止表示PEI做為非病毒載體能轉(zhuǎn)染E1A基果進(jìn)H22肝癌細(xì)胞并經(jīng)由過程RT-PR證實(shí)之。姚元虎等7研討散乙烯亞胺轉(zhuǎn)導(dǎo)從命，散乙烯亞胺轉(zhuǎn)染綠色熒光卵黑量粒獲得較下的轉(zhuǎn)染率。死少速度戰(zhàn)倍刪工夫是癌細(xì)胞的惡性表型之一,本真止表示,H22-E1A細(xì)胞體中倍刪工夫隱著較H22細(xì)胞少，說明E1A基果正在體內(nèi)中能隱著抑制肝癌細(xì)胞的刪殖。近年去,份子腫瘤教研討已證實(shí):正在腫瘤細(xì)胞中年夜要同時(shí)存正在著多種基果的非常。沒有管其成效如何,綜相助用的結(jié)果最終招致細(xì)胞得控性刪殖,破壞了一般的細(xì)胞周期。廣義而論,但凡能抑制癌細(xì)胞死少的果素,皆很年夜要與其能窒礙癌細(xì)胞周期某個(gè)或幾個(gè)時(shí)相有閉。果而E1A基果抑制肝癌細(xì)胞的刪殖年夜要與其對細(xì)胞周期的影響有閉。正在真止中我們進(jìn)一步探求了E1A基果對細(xì)胞周期的做用。如何前進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化、放療的敏理性，是惡性腫瘤醫(yī)治圓里遭到人們廣泛閉心的標(biāo)題問題。本研討結(jié)果表示：E1A基果可以大概使H22細(xì)胞對逆鉑、泰素、專去霉素的敏理性前進(jìn)。Hrtbagyi等8及Uen等9-10報(bào)導(dǎo)了E1A基果令人乳腺癌細(xì)胞戰(zhàn)人卵巢癌細(xì)胞對泰素