酵母培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、精品文檔酵母培養(yǎng)與酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆战湍概囵B(yǎng)與酒精發(fā)酵的基本原理和操作方法，了解影響酵母培養(yǎng)與酒精補(bǔ)料分批發(fā)酵的主要因素。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用生物工藝學(xué)課程中所學(xué)的基本原理和發(fā)酵方法， 對(duì)淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵過程進(jìn)行全程監(jiān)測(cè)， 模擬工業(yè)生產(chǎn)上的整個(gè)過程， 因此是一個(gè)綜合性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)。 要求學(xué)生較靈活地運(yùn)用基本知識(shí)， 解決實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題， 并在實(shí)驗(yàn)后系統(tǒng)總結(jié)獲得全面提高。麥芽中可供發(fā)酵的物質(zhì)主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應(yīng)的酶，所以不能直接利用淀粉進(jìn)行酒精發(fā)酵， 因此必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理， 通常包括蒸煮 （液化）、糖化等處理。蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細(xì)胞，形成均一的醪液，目

2、前多數(shù)廠家開始利用 -淀粉酶的液化作用來替代蒸煮過程，這樣可大大減少能源消耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖， 以便酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。-淀粉酶，又稱為1,4-D- 葡聚糖葡萄糖水解酶，廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物體中，如麥芽或動(dòng)物的唾液、脾臟中均含有較多的 -淀粉酶，而當(dāng)今 -淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)也主要是利用微生物工程菌進(jìn)行生產(chǎn)的。-淀粉酶容易溶解于水和較稀的緩沖液中， 它能夠切斷淀粉分子中的 -1，4 糖苷鍵，生成糊精及少量麥芽糖或葡萄糖， 從而使淀粉遇碘變藍(lán)的特異性顏色反應(yīng)逐漸消失，由此顏色反應(yīng)消失的速度即可測(cè)出該酶的活性。工藝流程如下：麥芽加水拌料液化糖化發(fā)酵蒸餾酒

3、精一級(jí)種子耐高溫酒精活性干酵母活化發(fā)酵醪中酒精含量的測(cè)定方法很多，如常規(guī)蒸餾法、碘量滴定法、比色法及改良康維法等，本實(shí)驗(yàn)采用第一種方法。三、器材與材料1、酵母菌種，使用前必須活化。.精品文檔2、 12oBx 麥芽汁培養(yǎng)基3、麥芽汁（見麥芽汁處理） ，生化培養(yǎng)箱，搖床，離心機(jī)，分光光度計(jì)，糖份、酒精測(cè)定試劑及裝置。四、實(shí)驗(yàn)步驟及方法1、培養(yǎng)基準(zhǔn)備麥芽汁培養(yǎng)基：將干麥芽粉，以 200g 麥芽加 700ml 去離子水，加入 1g 中溫 -淀粉酶，在 65水浴鍋中處理 3-4h，糖化程度可用碘滴定。將糖化液用 4-6 層紗布過濾，濾液如混濁不清，可用雞蛋白澄清，方法是將一個(gè)雞蛋白加水約20mL，調(diào)勻至

4、生泡沫時(shí)為止，然后倒入糖化液中攪拌煮沸后再過濾。將濾液調(diào)節(jié)至 pH 約 6.4。每組分裝后于121， 15min，滅菌備用。2、酵母活化3%酵母粉（ 7.5g），2%葡萄糖（ 5g），溶解于 250ml 去離子水中。在35復(fù)水 20min，降溫至 32培養(yǎng) 2h。3、一級(jí)種子培養(yǎng)250mL 三角瓶，12oBx 麥芽汁培養(yǎng)基，裝液量 50mL；接活化液約 4mL ，30， 150rpm/min 搖瓶培養(yǎng) 6-8h。細(xì)胞濃度達(dá) 1.5 108 個(gè)/mL 以上，無雜菌，無死細(xì)胞。采用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察和活菌計(jì)數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在無菌操作臺(tái)取培養(yǎng)液 0.5ml，加入 2 滴 0.05%美藍(lán)染

5、色液，置于裝有 4.5ml 無菌生理鹽水的試管中搖勻。 無菌操作用移液管滴取菌液于血球計(jì)數(shù)板中央， 放置 3 分鐘后用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，并且計(jì)算出芽率。詳見微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)P54。4、乙醇發(fā)酵接種：按 8%接種量將一級(jí)種子分別接入至2 只裝有 100ml 麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中靜止培養(yǎng)。 其中，一瓶用于測(cè)定發(fā)酵參數(shù)， 一瓶始終置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。補(bǔ)糖：發(fā)酵前期，接種 4h 后補(bǔ)加 5%葡萄糖 0.2ml，以后每 2h 補(bǔ)加 5%葡萄糖 0.2ml 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期（具體時(shí)間根據(jù)菌體生長(zhǎng)而定） 。發(fā)酵中后期，每 4h 可加入 5%左右的葡萄糖 2ml。溫度：發(fā)酵前期30，發(fā)酵中后期 34。細(xì)胞濃度：發(fā)酵

6、前期，接種 2 小時(shí)后每小時(shí)測(cè)定一次細(xì)胞濃度至穩(wěn)定期后，.精品文檔再間隔 2 小時(shí)測(cè)一次細(xì)胞濃度。 用血球記數(shù)板法測(cè)量菌體量及出芽率， 并繪制生長(zhǎng)曲線。濕菌體量的計(jì)算： 發(fā)酵結(jié)束，離心后，用無菌水洗滌 2 次，稱量濕菌體重。5、蒸餾 ,測(cè)酒精度五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程的檢測(cè)和記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。(2)濕菌體重(3)酒精度實(shí)驗(yàn)分組及詳細(xì)安排以 3-4 人為一組。周一和周二模塊 3 同學(xué)分為 7 組進(jìn)行培養(yǎng)基和一級(jí)種子制備等基礎(chǔ)工作， 模塊 1 同學(xué)進(jìn)行遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。 周三以后全體同學(xué)共同進(jìn)行酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，共分為 18 組，其中模塊 1 分為 11 組，模塊 3 分為 7 組。在周一和

7、周二模塊 3 同學(xué)也需要配制模塊 1 同學(xué)實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基、 試劑、一級(jí)種子液等。 以下列出每天每組的各實(shí)驗(yàn)器材及藥品準(zhǔn)備量。周一上午： 分發(fā)實(shí)驗(yàn)資料，老師講解。1）配制麥芽汁培養(yǎng)基（ 1 個(gè) 250ml 三角瓶裝液量為 50 ml ，其余數(shù)個(gè)（模塊 3 第 1-5 組 6 個(gè)，6 組和 7 組 4 個(gè)）250ml 三角瓶裝液量為 100 ml，滅菌待用）。2）同時(shí)，每組準(zhǔn)備好如下器材：250ml 三角瓶（模塊 3 第 1-5 組準(zhǔn)備 7 個(gè)， 6 組和 7 組準(zhǔn)備 5 個(gè)）； 1L 燒杯（模塊 3 每組準(zhǔn)備 1 個(gè)）； 1 塊血球計(jì)數(shù)板； 1 個(gè)蓋玻片； 1 臺(tái)顯微鏡；5ml 移液管 8 只，

8、 10ml 移液管 3 只；0.5ml 移液管 6-7 只； 試管 30 只； 離心管 2 只。周一下午：（ 1）干熱滅菌： 5ml 移液管 8 只，10ml 移液管 3 只，其中 5ml 移液管和 10ml 移液管使用時(shí)模塊 1 和模塊 3 共 18 組平分， 0.5ml 移液管 6-7 只，試管 30 只，輪換使用。離心管 2 支。滅菌待用。（ 2）酵母活化：以班級(jí)為單位制備，由第6 組同學(xué)完成。 3%酵母粉（ 7.5g），2%葡萄糖（ 5g），溶解于 250ml 去離子水中。在35復(fù)水 20min，降溫至 32.精品文檔培養(yǎng) 2h。然后置于冰箱冷藏。3）5%葡萄糖溶液：以班級(jí)為單位制備，

9、由第 7 組同學(xué)完成。配制 5%的葡萄糖液 300ml，分 3 瓶分別置于 3 只 100ml 三角瓶中。與麥芽汁培養(yǎng)基一起濕熱滅菌。（ 4）生理鹽水：以班級(jí)為單位制備，由第5 組同學(xué)完成。 9g NaCl 用去離子水定容至 1 L，分裝與試劑瓶中。每組將生理鹽水分裝于 30 只試管中，每管 4.5ml，包扎，與麥芽汁培養(yǎng)基一起濕熱滅菌待用。 余下未滅菌的生理鹽水置于試劑瓶中，室溫儲(chǔ)藏備用。周二：種子培養(yǎng)。 250mL 三角瓶， 12oBx 麥芽汁培養(yǎng)基，裝液量 50mL；接活化液約 4mL ，30，150rpm/min 搖瓶培養(yǎng) 6-8h。細(xì)胞濃度達(dá) 1.5 108 個(gè)/mL 以上，無雜菌，

10、無死細(xì)胞。培養(yǎng)至 2h 后開始取樣，以后每小時(shí)用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定一次細(xì)胞量和出芽率。 直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期培養(yǎng)結(jié)束， 將種子液取出置于室溫下儲(chǔ)藏備用。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求計(jì)算細(xì)胞濃度并繪制生長(zhǎng)曲線。需及時(shí)滅菌生理鹽水、移液管等物品。周三：酒精發(fā)酵。早6:30 需同學(xué)先來開紫外燈， 7:00 所有同學(xué)必須到。模塊 3 同學(xué)直接接種。 模塊 1 同學(xué)先在實(shí)驗(yàn)室聽老師講解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，而后接種。按8%接種量將一級(jí)種子分別接入至2 只裝有 100ml 麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中靜止培養(yǎng)。其中，一瓶用于測(cè)定發(fā)酵參數(shù)，一瓶始終置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（模塊 3第6、7 兩組都接種 3 瓶，多接的一瓶用于做對(duì)照實(shí)驗(yàn)）發(fā)酵前期，接種 4h 后補(bǔ)加 5%葡萄糖 0.2ml，以后每 2h 補(bǔ)加 5%葡萄糖 0.2ml至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期（具體時(shí)間根據(jù)菌體生長(zhǎng)而定，2 瓶都需補(bǔ)糖，但只有一瓶用于測(cè)生長(zhǎng)曲線）。其中，模塊 3 第 6、7 兩組同時(shí)做發(fā)酵前期不補(bǔ)糖，發(fā)酵中后期照常補(bǔ)糖的對(duì)照。對(duì)照需測(cè)定生長(zhǎng)曲線。通過顯微鏡計(jì)數(shù)觀測(cè)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)即補(bǔ)料5%左右的葡萄糖2ml，以促進(jìn)酒精生產(chǎn)，并將培養(yǎng)溫度升高至34。以后每 2h 可加入 5%左右的葡萄糖2ml 至發(fā)酵結(jié)束。生長(zhǎng)曲線的繪制：培養(yǎng)至2h 后開始取樣，以后每小時(shí)用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定一次細(xì)胞量和出芽率。直至穩(wěn)定期。至穩(wěn)定期后，再間隔2 小時(shí)測(cè)一次細(xì)胞濃度。.精品文檔以培養(yǎng)