人纖溶酶原kringle區(qū)缺失突變體的畢赤酵母表達(dá)、產(chǎn)物純化及鑒定

1、人纖溶酶原kringle區(qū)缺失突變體的畢赤酵母表達(dá)、產(chǎn)物純化及鑒定【關(guān)鍵詞】畢赤酵母kringle區(qū)纖溶酶原缺失突變體純化Keyrds:deletinutant;kringledain;Pihiapastris;plasingen;purifiatin人纖溶酶原(plasingen,PLG)是人體纖溶系統(tǒng)的主要成分，在體內(nèi)經(jīng)纖溶酶原激活劑(plasingenativatr,PA)激活后，轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasin,PL)，不僅發(fā)揮溶栓作用，還參與體內(nèi)一系列與蛋白水解有關(guān)的生理病理過程，如炎癥、組織修復(fù)、排卵、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。長期以來，纖溶酶被認(rèn)為是一種具有潛力的直接溶栓藥物，但由于分子量大、

2、構(gòu)造復(fù)雜、富含糖鏈且易自身降解，采用大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)效率較低1,2，因此對(duì)PLG進(jìn)展構(gòu)造改造是近年來研究的熱點(diǎn)。本室宋鋼等采用畢赤酵母表達(dá)了一種纖溶酶原kringle區(qū)缺失突變體(PLGK)，經(jīng)激活后，具有較好的纖溶活性3。本實(shí)驗(yàn)在此根底上，深化研究了高密度發(fā)酵和純化工藝，使其更合適大規(guī)模制備，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)展研究，為纖溶酶的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)基矗1實(shí)驗(yàn)材料2方法2.1PLGK表達(dá)菌7.5L罐批發(fā)酵甘油補(bǔ)加：初始速率為0.6LL-1h-1，2h內(nèi)逐漸升高至9LL-1h-1，此后維持此速率，待A600到達(dá)150左右，停頓補(bǔ)加甘油。甲醇誘導(dǎo)：初始速率為1LL-1h-1，8h內(nèi)逐漸升高至

3、12LL-1h-1，以后維持此速度，并根據(jù)溶氧值和pH值的變化，調(diào)整補(bǔ)加甲醇的速率，直至誘導(dǎo)20h。2.2PLGK的別離純化發(fā)酵液以8000r/in,4離心30in，上清用截留分子量50kD超濾膜除去殘留菌體及沉淀，再以截留分子量3kD超濾膜濃縮至原體積的1/10。2.3PLGK的鑒定2.3.3PLGK的等電點(diǎn)的測定采用固相pH梯度預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠(T=5%，=3%，pH310，1101101)，程度電泳的等電聚焦方法測定樣品的等電點(diǎn)。電泳條件：100V，15in;200V，15in;400V，60in。至電流讀數(shù)為0A。凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0g/L，每孔上樣5L，考馬斯亮藍(lán)R25

4、0染色。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4PLGK的酶學(xué)性質(zhì)2.4.1纖維蛋白板法測定PLGK比活性1%瓊脂糖凝膠板中含有0.05l/LpH7.4PBS、1.5%纖維蛋白、800U/L尿激酶、0.02%NaN3。凝膠打孔后，各孔中加等體積的樣品液或PLG標(biāo)準(zhǔn)品，37濕盒保溫過夜。游標(biāo)卡尺測定各孔溶圈直徑，以溶圈直徑的對(duì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品活性作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的比活性。3結(jié)果3.1發(fā)酵過程菌密度及比活性測定3.2發(fā)酵液PLGK的純化3.3純度鑒定及分子量、等電點(diǎn)測定4討論P(yáng)ihiapastris表達(dá)系統(tǒng)是近年來開展起來的極具潛力的酵母表達(dá)系統(tǒng)，既具有真核生物蛋白翻譯后加工的才能，又具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖

5、快、操作簡便的特點(diǎn)，通過分泌性載體可將目的蛋白釋放到培液中，方便下游的別離純化;而且酵母可以在高密度下生長良好，據(jù)報(bào)道在適宜的培養(yǎng)條件下，酵母菌密度A600可到達(dá)1000以上，外源蛋白表達(dá)量可達(dá)5g/L培液。本實(shí)驗(yàn)采用7.5L發(fā)酵罐進(jìn)展高密度培養(yǎng)，至發(fā)酵完畢時(shí)A600約為280，每升培液的表達(dá)量約為400g，比搖瓶培養(yǎng)進(jìn)步了10倍左右。由于巴斯德壁赤酵母沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以外源基因需整合入酵母染色體中，整合方式包括同源雙交換引起的基因置換和位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入。前者使宿主的AX1構(gòu)造基因被外源基因表達(dá)盒所交換，因此使宿主失去大局部甲醇利用才能，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，即uts(

6、ethanlutilizatinsl)表型：后者那么并未破壞宿主的AX1構(gòu)造基因，利用甲醇才能強(qiáng)，即ut+(ethanlutilizatinplus)表型。本實(shí)驗(yàn)所用工程菌的AX1基因被PLGK基因取代，表現(xiàn)為甲醇利用緩慢，在甲醇誘導(dǎo)后，菌體生長速度明顯減緩。此外，過高的甲醇會(huì)對(duì)uts酵母產(chǎn)生明顯的毒性作用，影響外源蛋白的表達(dá)。因此，優(yōu)化甲醇補(bǔ)加速率可進(jìn)一步進(jìn)步PLGK表達(dá)程度。此外，由于自然界中廣泛存在PA，如葡激酶、鏈激酶、凝血酶等，易激活表達(dá)的PLGK發(fā)生自身降解，以及酵母本身存在的蛋白酶，均會(huì)導(dǎo)致PLGK表達(dá)、分泌、純化過程中出現(xiàn)降解。因此，本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)參加1%的酪蛋白水解物，提供應(yīng)蛋白酶足夠的底物，有效地降低了酵母蛋白水解酶及PLGK的自身降解作用。當(dāng)然，也可以通過降低培液的pH值、突變或缺失酵母宿主主要蛋白酶基因等方法進(jìn)步外源表達(dá)蛋白在酵母菌中的穩(wěn)定性?？傊緦?shí)驗(yàn)初步建立了PLGKPihiapastris工程菌高密度發(fā)酵、產(chǎn)物純化工藝，并對(duì)制備的PLGK半成品進(jìn)展了理化鑒定，為大規(guī)模消費(fèi)提供了實(shí)驗(yàn)基矗目前，人PL及其突變體已用于