微生物實驗操作指導手冊：細菌代謝產(chǎn)物觀察和生長現(xiàn)象、紫外線殺菌實驗、革蘭染色等實驗

1、革蘭染色目的：掌握革蘭染色的原理及操作。材料：干凈玻片，接種環(huán)，葡萄球菌和大腸桿菌18-24h培養(yǎng)后的混合菌液，酒精燈，一套革蘭染液原理：主要為細胞壁結(jié)構(gòu)的差異。G+三維肽聚糖結(jié)構(gòu)的交聯(lián)度大，通透性低，脂質(zhì)少或無，酒精作用使孔徑縮小；而G-肽聚糖為二維疏松結(jié)構(gòu)，薄，外膜含大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，使細胞壁通透性增高，結(jié)晶紫-碘復合物被酒精溶解而脫色。步驟：1. 細菌標本的制作（1）涂片：無菌操作。取一接種環(huán)混合細菌懸液，涂布成直徑約1cm的涂片，涂片應薄而均勻。（2）干燥：涂片最好在室溫中自然干燥。必要時可將標本面向上，放在酒精燈上方微火處干燥。（3）固定：標本面向上，在酒精燈火焰外焰按鐘擺的速

2、度來回通過3次，放置待冷后染色。固定的目的是殺死細菌，使細菌與玻片黏附較牢固。菌體蛋白質(zhì)變性后，提高與染料的親和力。2. 革蘭染色 （1）初染：滴加結(jié)晶紫染液1-2滴于涂片上，1min鐘后用自來水緩緩沖洗。（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自來水緩緩沖洗。（3）脫色：加95%酒精數(shù)滴，擺動玻片使酒精與細菌充分接觸，約20-30s后，立即用自來水緩緩沖洗。（4）復染：滴加稀釋碳酸品紅液，30-60s后，自來水緩緩沖洗。用吸水紙吸干后，用油鏡觀察。鏡檢后，載片放入消毒缸。 細菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察目的：觀察并掌握細菌的形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)。材料：細菌鞭毛、芽孢、莢膜的標本片；革蘭陽性菌、革蘭陰性菌染色

3、標本片示教：革蘭陽性菌：葡萄球菌，紫色革蘭陰性菌：大腸桿菌，紅色細菌鞭毛細菌芽孢細菌莢膜 細菌的分布目的：了解細菌在自然界中的分布情況。材料： 普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血平板、鑷子、無菌棉拭子、革蘭染液。操作步驟：1.空氣中細菌的檢查（1）采用沉降法：取普通瓊脂平板培養(yǎng)基1只，任意置一處，啟蓋約15分鐘，再蓋上，37oC培養(yǎng)24小時，觀察有無細菌生長。 （2）結(jié)果判定：培養(yǎng)基表面可見多種大小、形態(tài)不一的菌落。2. 皮膚表面細茵檢查(1)采用涂抹法: 先在平板底面用記號筆分成兩區(qū)，作標記，將未消毒的手指在平板的12處表面輕輕涂抹劃線，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮膚，用消毒后的手指在平板另一12處進行涂

4、抹，操作完畢，置37培養(yǎng)24小時后，取出觀察結(jié)果。(2)結(jié)果判定：培養(yǎng)基表面有幾種大小及形態(tài)不同的菌落生長，注意比較消毒前后細菌的生長情況。 3.咽喉部細茵檢查(1)用無菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并劃線分離，37oC培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。注意觀察平板上菌落種類以及是否有溶血現(xiàn)象，并可挑取菌落進行革蘭染色檢查?？谇晃⑸餀z查也可用無菌牙簽直接挑取少量牙垢，制成涂片，進行革蘭染色檢查。(2)結(jié)果判定：血平板表面有大小和形態(tài)不同的菌落，有的菌落周圍可見溶血環(huán)。牙垢涂片鏡檢可見革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。 紫外線殺菌實驗目的：掌握紫外線殺菌的原理，熟悉紫外線殺菌實驗的操作。材料：大腸桿菌，瓊

5、脂平板，無菌回形狀紙片，接種環(huán)，鑷子，紫外燈.原理：紫外線波長范圍為240280nm,最適的波長為260nm，這與DNA吸收光譜范圍相一致。其殺菌原理是紫外線易被核蛋白吸收，使DNA的同一條螺旋體上相鄰的堿基形成胸腺嘧啶二聚體，從而干攏DNA的復制，導致細菌死亡或變異。紫外線特點：紫外線的穿透能力弱，不能通過普通玻璃、塵埃。步驟：1.平板密集劃線接種。2.在平板上貼無菌回形紙片。3.UV照射30min（打開平板蓋子）。4.取出回形紙，將回形紙放入消毒缸中。5.37oC培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 細菌代謝產(chǎn)物觀察和生長現(xiàn)象目的：掌握細菌代謝產(chǎn)物的檢測和結(jié)果的判斷。熟悉細菌在各種培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象。材

6、料：各種生化管，大腸桿菌、傷寒桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌等。原理：不同菌的酶系統(tǒng)不同，對底物的代謝產(chǎn)物也不同，用生化的實驗方法可將產(chǎn)物檢測出來，從而對細菌鑒定。步驟：一、細菌代謝產(chǎn)物觀察1. 糖發(fā)酵實驗 將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種在葡萄糖發(fā)酵管內(nèi)，37培養(yǎng)18-24h進行觀察。培養(yǎng)基中指示劑為溴甲酚紫。如能分解葡萄糖，則產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S色，記錄符合為“+”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。如能分解乳糖，則產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S色，記錄符合為“+”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中倒置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。如培養(yǎng)基未變色，仍為紫色，則表

7、明細菌不能分解乳糖不能分解乳糖。記錄符合“-”。2.枸櫞酸鹽利用實驗該培養(yǎng)基中提供的唯一碳源是枸櫞酸鈉。指示劑是澳麝香草酚蘭。分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，37培養(yǎng)24h進行觀察.若斜面有菌落出現(xiàn)，培養(yǎng)基由原來的綠色變?yōu)樯钐m色，表明細菌能利用枸櫞酸鈉，記錄符合“+”，反之“-”。3.靛基質(zhì)吲哚產(chǎn)生實驗能產(chǎn)生色氨酸酶的細菌，可分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)。將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)48h后，每管各加吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）3-4滴，若出現(xiàn)紅色化合物-玫瑰色吲哚，表明靛基質(zhì)產(chǎn)生陽性“+”；反之為陰性：“-”。4. 硫化氫產(chǎn)生實驗有的細菌能分解含硫氨基酸

8、（胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫。將大腸桿菌和變形桿菌分別接種在這樣的培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)18-24h。若培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀物即為陽性“+”，表明產(chǎn)生的硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽(或鐵鹽)結(jié)合，生成黑色的硫化鉛（或硫化鐵）。二、細菌生長現(xiàn)象1、在液體培養(yǎng)基上生長情況 (1)表面生長：液體清晰，細菌生長在液面形成菌膜。如枯草桿菌。 (2)混濁生長：液體均勻混濁，或有少量沉淀。如大腸埃希菌。 (3)沉淀生長：液體清晰，細菌生長在管底，形成沉淀。如鏈球菌。2、在固體培養(yǎng)基上的生長情況 (1)菌苔：在瓊脂斜面培養(yǎng)基上長成菌苔。(2)菌落：在平板上形成肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。觀察時要注意菌落的大小、形狀

9、、表面形狀、邊緣是否整齊、透明度、顏色等，可作為鑒別細菌的依據(jù)之一。(3)色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固體培養(yǎng)基上的生長情況 有鞭毛的細菌，由于能運動，在半固體培養(yǎng)基內(nèi)沿穿刺線彌漫性生長，使穿刺線變得模糊不清。無鞭毛的細菌，因為不能運動，接種生仍沒穿刺生長，穿刺線與周圍界限清楚。凝集實驗（玻片法）目的：掌握抗原抗體反應的基本原理和特異性，熟悉凝集反應的操作。材料：傷寒桿菌AF群O多價血清、志賀氏痢疾多價血清、生理鹽水、未知菌、玻片。原理：顆粒性抗原（凝集原）與相應的抗體（凝集素）直接結(jié)合，在一定的條件下形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。如紅細胞ABO血型的測定，測定細菌的細菌凝集實驗。步驟：1

10、.取清潔載物玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。于第一格和第二格內(nèi)各加約30ul傷寒桿菌AF群O多價血清及志賀氏痢疾多價血清，第三格內(nèi)滴加約30ul生理鹽水。2. 用接種環(huán)挑取待檢菌種少許，分別均勻地涂抹于1、2、3格內(nèi)的液體中。接種環(huán)每次使用前后均需經(jīng)酒精燈火焰燒灼滅菌。3. 輕輕搖動玻片，數(shù)分鐘后用肉眼觀察結(jié)果，出現(xiàn)灰白色凝集顆粒者即為陽性反應；仍為均勻混懸液者為陰性反應。如結(jié)果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。 沉淀反應（雙擴散）目的：掌握抗原抗體反應的基本原理和特異性，熟悉沉淀反應的操作。材料：干凈玻片，玻璃蠟筆、打孔器、微量加樣器、正常人血清IgG、羊抗人IgG原理：將抗原與

11、抗體分別加到電解質(zhì)凝膠板相鄰的兩孔中，抗原與抗體雙方自由擴散，在最適當比例處形成抗原抗體復合物（沉淀線）。步驟：1.制板：取干凈玻片一片，用蠟筆分為三格，用吸管將45ml加熱溶化的1.5%食鹽瓊脂充盈中格，制備瓊脂板。2. 打孔：待瓊脂板凝固后，用打孔器打孔。孔間距約為5mm。3. 封底：將打好孔的瓊脂板凝板過火焰三次。4. 加樣：用微量加樣器在三孔中加入生理鹽水，正常人血清IgG和馬抗人IgG。每孔加入約10l。注意：加樣時勿使液體溢出和孔內(nèi)出現(xiàn)氣泡。5. 擴散：將瓊脂板放入濕盤內(nèi)，置37溫箱中（均保持水平位置），于24小時后觀察結(jié)果。藥敏實驗(紙片法)目的：掌握紙片法藥敏實驗方法，熟悉微生

12、物培養(yǎng)，了解抗生素對細菌的作用機制。了解含藥紙片的制備材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打孔器(直徑6cm)，抗生素紙片。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種。2.貼4-5種含抗生素的紙片于平板上。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。3. 37oC培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑大小，判斷敏感性。 消毒劑對細菌的影響目的：掌握含藥紙片的制備。熟悉微生物培養(yǎng)，了解消毒劑對細菌的作用機制。材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打孔器(直徑6

13、cm)，濾紙紙片(直徑約6 mm)，70%酒精，金星消毒水，紫藥水、紅藥水。原理：藥物在瓊脂上擴散，形成濃度涕度，在一定的濃度下，對細菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1.平板上密集劃線接種細菌。2. 將無菌干燥的濾紙片放入各種消毒劑中浸濕，在容器邊緣瀝干，即為含藥的濾紙片。3. 將以上含藥濾紙片貼于平板上，每塊貼4種。藥片與平板邊緣相距至少1.5cm，藥片之間相距至少2cm。4. 37oC培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑大小，判斷抑菌效果。油鏡的使用和維護目的：掌握油鏡的使用與維護，熟悉油鏡的使用原理。材料：顯微鏡，拭鏡紙，液體石蠟油，二甲苯原理：油鏡的透鏡極小，工作焦距最短，光線通過玻璃和空氣，由于介質(zhì)密度不同發(fā)生折射，射入鏡筒的光線極少，視野暗，物象不清晰。如在玻片與鏡頭（透鏡）之間加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可減少光線的折射，加強視野的亮度，獲得清晰的物象。步驟：顯微鏡油鏡的使用和維護1.將顯微鏡平穩(wěn)地安放在實驗臺適宜處。識別油鏡頭：標有100、OIL、HI等字樣。2. 打開電源，用低倍鏡對光，打開光圈，調(diào)節(jié)聚光鏡的位置，使視野光線充足。3. 標本上加鏡