分子生物學(xué)檢驗(yàn)：第四節(jié) 核酸分子標(biāo)志物

1、第四節(jié) 核酸分子標(biāo)志物 核酸分子標(biāo)志物的分類 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的研究，引入了核酸分子標(biāo)志物（nucleic molecular biomarker）的概念。某些分子標(biāo)志物可反映患者基因功能、蛋白質(zhì)功能及代謝功能，對(duì)疾病的早期診斷、指導(dǎo)臨床治療、提高療效、減輕患者負(fù)擔(dān)以及節(jié)省醫(yī)療資源，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療有重要意義。 根據(jù)檢測(cè)的特點(diǎn)將核酸分子標(biāo)志物分為：基因突變位點(diǎn)、基因多態(tài)性位點(diǎn)、等位基因等。（一）基因突變基因突變的發(fā)生與DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)、單基因遺傳病、癌變及衰老有關(guān)?；蛲蛔兾稽c(diǎn)是常用的分子標(biāo)志物。致病基因突變中，70%是點(diǎn)突變（49%為錯(cuò)義突變），2

2、3%為小片段插入/缺失，7%為大片段插入/缺失。HBB基因突變正常成人的血紅素是由兩條-肽鏈和兩條-肽鏈所構(gòu)成。鐮形細(xì)胞貧血癥患者的-鏈完全正常，但-鏈的DNA序列在起始端的第20位核苷酸發(fā)生點(diǎn)突變，由原來(lái)的GAG-變?yōu)?GTG-（A-T），則在翻譯時(shí)，-鏈近N 端的第6位氨基酸由谷氨酸-纈氨酸。BRCA1基因突變BRCA1基因定位于17q21，約100個(gè)kb，BRCA1編碼蛋白的N末端序列含有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，能夠與BRCA1相關(guān)蛋白結(jié)合。野生型BRCA1基因?qū)儆谝职┗颍?BRCA1基因突變使其具有的抑癌功能受影響，已發(fā)現(xiàn)的BRCA1/2的突變有數(shù)百種之多，其中有BRCA1基因突變者，患乳腺癌

3、和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)分別是50%85%和15%45% 。F基因突變 在F基因的2535位核苷酸發(fā)生了CA堿基置換，導(dǎo)致826Asp(GAC)Glu(GAA)錯(cuò)義突變。A 正常對(duì)照B 血友病A患者（二）基因多態(tài)性位點(diǎn)人類基因多態(tài)性來(lái)源于基因組中重復(fù)序列拷貝數(shù)的不同、單拷貝序列的變異以及雙等位基因的轉(zhuǎn)換或替換。 分為：DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、微衛(wèi)星多態(tài)性（STR）、單核苷酸多態(tài)性（SNPs）及拷貝數(shù)多態(tài)性（CNVs）。基因多態(tài)性位點(diǎn)與疾病的易感性有關(guān)。F基因多態(tài)性位點(diǎn) 利用致病基因內(nèi)外的RFLP作為特異分子遺傳標(biāo)志物，通過(guò)家系成員間的連鎖分析確定血友病基因A的遺傳情況。鼻咽癌基因多態(tài)性位點(diǎn)鼻咽

4、癌是一種常見于中國(guó)南方的上皮性惡性腫瘤，常見為3號(hào)染色體結(jié)構(gòu)異常。用STR分析方法發(fā)現(xiàn)低分化鼻咽癌患者在染色體3p21-26區(qū)域的的等位基因雜合性丟失頻率為66.7%，提示該區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)或多個(gè)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的抑瘤基因。鼻咽癌患者染色體3p21-26的16個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)等位基因雜合性丟失檢測(cè)結(jié)果（三）等位基因基因的多態(tài)性導(dǎo)致相關(guān)的基因座位形成多個(gè)等位基因（復(fù)等位基因），這些等位基因成為了分子標(biāo)志物的一種。等位基因的檢測(cè)是針對(duì)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行。臨床上常用于基因分型和腫瘤靶向藥物的“靶標(biāo)”檢測(cè) 。等位基因與疾病的易感性有關(guān)。CYP2D6基因及等位基因CYP2D6是乳腺癌化療藥物他莫昔芬（TAM

5、）的代謝關(guān)鍵酶。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)100種CYP2D6等位基因的變異，主要為SNPs。CYP2D6基因的多態(tài)性決定了代謝表型的多態(tài)性。使酶的活性表現(xiàn)為缺失、降低、正常或增強(qiáng)等類型。分為：強(qiáng)代謝者（含2以上個(gè)正常功能等位基因）、正常代謝者（ 2個(gè)正常功能等位基因）、中等代謝者（含1個(gè)正常功能1個(gè)無(wú)效等位基因/ 2個(gè)功能降低等位基因/1個(gè)功能降低1個(gè)無(wú)效等位基因）和弱代謝者（2個(gè)無(wú)效等位基因）。 TAM療效依次降低。因此CYP2D6基因多態(tài)性成為評(píng)價(jià)乳腺癌患者接受TAM治療療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。有助于早期確定那些無(wú)功能的或存在嚴(yán)重功能損害的CYP2D6變異體,避免無(wú)效用藥。CYP2D6基因突變型UGT1

6、A1基因及其等位基因在結(jié)直腸癌治療中，UGT1A1基因的多態(tài)性與藥物伊立替康 (CPT-11)表達(dá)活性相關(guān)，可用于臨床預(yù)測(cè)CPT-11嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率。患者在伊立替康治療前檢測(cè)UGT1A1*28，可預(yù)測(cè)伊立替康藥物的毒性，從而選擇用藥劑量： UGT1A1*28為純合子，使用伊立替康藥物毒性較大，應(yīng)減少劑量； UGT1A1*28為雜合子，使用伊立替康藥物毒性一般，須臨床觀察用藥； 沒(méi)有檢測(cè)到UGT1A1*28，使用伊立替康標(biāo)準(zhǔn)劑量。 （四）RNA有些基因的一個(gè)mRNA前體通過(guò)不同的剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體（可變剪接 ），可變剪接是導(dǎo)致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因 。實(shí)驗(yàn)

7、研究表明，可變剪接與許多遺傳疾病相關(guān)。其中約15%的變異影響pre-mRNA的剪接。 地中海貧血 由于非編碼區(qū)IVS-1和IVS-2突變，影響前mRNA剪接等加工過(guò)程不能準(zhǔn)確進(jìn)行，產(chǎn)生異常的mRNA，導(dǎo)致0或+地貧。 BCR/ABL融合基因mRNA的表達(dá)量檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(reverse transcriptase PCR，RT-PCR)方法檢測(cè)BCR/ABL融合基因mRNA的表達(dá)量，定量結(jié)果用BCR/ABL mRNA拷貝數(shù)和內(nèi)參基因mRNA拷貝數(shù)的比值表示。RT-PCR方法檢測(cè)mRNA的拷貝數(shù)，能夠有效地定量反映腫瘤細(xì)胞的負(fù)荷量。 （五）線粒體DNA人類線粒體基因組DNA是一個(gè)長(zhǎng)為1

8、6,569 bp的雙鏈閉合環(huán)狀分子，編碼37個(gè)基因。mtDNA突變與多種母系遺傳疾病有關(guān)，可作為分子標(biāo)志物。mtDNA損傷是導(dǎo)致氧化磷酸化（OXPHOS）功能紊亂的主要原因之一，隨著體細(xì)胞mtDNA突變的不斷積累，當(dāng)OXPHOS功能紊亂達(dá)到某一閾值時(shí)，表現(xiàn)出線粒體疾病。 Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)11778GA導(dǎo)致編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第340位的Arg精His組，從而影響線粒體能量的產(chǎn)生。ND4G11778A、ND6T14484C和ND1G3460A 三個(gè)位點(diǎn)突變可引起Leber遺傳性視神經(jīng)病。（六）病原生物基因組對(duì)病原微生物基因組的檢測(cè)，是診斷感染性疾病的分子標(biāo)記

9、，同時(shí)還對(duì)指導(dǎo)用藥、監(jiān)測(cè)病程及耐藥性檢測(cè)有重要意義。如：HBV DNA、HPV DNA檢測(cè)16S rRNA鑒定 菌種鑒定16S rRNA 普遍存在于原核生物中，含有高度保守的序列和高度變化的序列區(qū)域。根據(jù)可變區(qū)序列的差異，可鑒定細(xì)菌種屬。通過(guò)細(xì)菌基因組DNA提取、16S rRNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟獲得細(xì)菌種屬信息。16S rRNA鑒定高危型HPV DNA檢測(cè)高危型HPV感染是宮頸癌及癌前病變的主要病因，持續(xù)的高危型HPV感染可導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）進(jìn)而發(fā)展為宮頸鱗癌。高危型HPV感染已列為許多國(guó)家宮頸癌及癌前病變常規(guī)篩查指標(biāo)。 利用雜交捕獲二代技

10、術(shù)（HC2）證實(shí)宮頸病變嚴(yán)重程度與高危型HPV 感染密切相關(guān)，宮頸病變程度較重者，病毒載量水平愈較高。（七）循環(huán)核酸（circulating nucleic acid） 循環(huán)核酸是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外，且部分降解的機(jī)體內(nèi)源性DNA。又稱外周血游離DNA。循環(huán)DNA存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA兩種形式存在。 外周血游離DNA在疾病的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)及腫瘤防治等方面具有重要潛在價(jià)值。 已證實(shí)惡性腫瘤患者血清循環(huán)DNA明顯高于正常人，因此，血漿腫瘤循環(huán)DNA可能是一種潛在的惡性腫瘤標(biāo)志物。乳腺癌

11、患者血漿循環(huán)DNA研究 乳腺癌患者、乳腺良性病變患者、健康自愿者的循環(huán)DNA濃度分別為(55.159.85)，(19.09.5）和(13.07.3) gml，乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度顯著高于乳腺良性病變患者和健康自愿者。microRNA與癌癥外周血中存在穩(wěn)定的microRNA，是潛在的分子標(biāo)志物。結(jié)腸癌干細(xì)胞的分裂早期研究，發(fā)現(xiàn)一種腫瘤抑制microRNA（miR-34a），能夠調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化。研究顯示，高水平的miR-34a可促進(jìn)干細(xì)胞分化，低水平的miR-34a使細(xì)胞保持干細(xì)胞狀態(tài)。胎兒游離DNA的檢測(cè)在妊娠過(guò)程中，胎盤中的細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性細(xì)胞死亡而不斷向母體血液中釋放

12、大量核酸，因此孕婦血液中既含有自身的DNA，也含其胎兒的DNA。根據(jù)胎兒基因組分別來(lái)自母親的單體型和父親的單體型的原理，通過(guò)對(duì)母親血漿中的游離DNA進(jìn)行測(cè)序，就可以確定胎兒的全基因序列。如果某種變異的單體型大量存在于母體血液中，則表明胎兒與母體都擁有這段變異的DNA。 基于診斷的分子標(biāo)志物 疾病的診斷或鑒別出危險(xiǎn)患者 相關(guān)病毒DNA /RNAmicroRNA 疾病基因及其產(chǎn)物 基于治療的分子標(biāo)志物 疾病分期或嚴(yán)重性判別；觀察疾病預(yù)后（癌癥患者生存率評(píng)估）；藥物毒性監(jiān)測(cè)或預(yù)測(cè)及療效評(píng)估。 與病程相關(guān)的標(biāo)志物 指導(dǎo)用藥的標(biāo)志物 分子標(biāo)志物的特點(diǎn)分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法 在癌癥研究領(lǐng)域，分子標(biāo)志物可取材

13、于腫瘤組織或正常組織，也可取材于血液和各種漿膜腔的病理性液體，如胸腔積液、心包積液等。 常用檢測(cè)方法：1、檢測(cè)蛋白表達(dá) 免疫組化(IHC) 、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 2、檢測(cè)基因拷貝數(shù) 熒光/發(fā)光原位雜交方法(FISH/CISH) 3、檢測(cè)基因表達(dá) 芯片技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR) 4、基因測(cè)序分子標(biāo)志物的臨床研究方法“3M”策略：多重分析(multiplex)多標(biāo)志物(multi- biomarker)多中心驗(yàn)證(multi-validaton) 分子標(biāo)志物臨床研究策略分子標(biāo)志物與腫瘤靶向治療腫瘤分子靶向治療是當(dāng)今治療腫瘤的熱點(diǎn)，靶向藥物不斷被發(fā)現(xiàn)，在分子靶向治療中，分子生物標(biāo)志物作為靶向藥物的“靶標(biāo)”起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用 。分子標(biāo)志物的識(shí)別有助于為患者選擇最有效治療藥物，把握最佳治療時(shí)機(jī)，制定最有效的治療方案。腫瘤十大特征及靶向治療理想分子標(biāo)志物的特點(diǎn)具有高度多態(tài)性，在整個(gè)基因組廣泛分布；共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型，能明確辨別等位基因；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速，重復(fù)性好；敏感度、特異性高；無(wú)創(chuàng)性，成本盡量低廉。 分子標(biāo)志物的發(fā)展有賴于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)將有更