酶法合成阿莫西林原理

1、 /8酶法合成阿莫西林介紹B-內(nèi)酰胺抗生素經(jīng)過多年的發(fā)展，己成為抗生素中的最主要類型之一。由于具有良好的抗菌效力，較低的毒副作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，其發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)全世界耗用量已過萬噸，預(yù)計(jì)今后還會(huì)增長。其中，青霉素和頭孢菌素為最重要的兩大類B-內(nèi)酰胺抗生素。酶法合成技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末70年代初，經(jīng)過30多年的發(fā)展，現(xiàn)在酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面取得很大的發(fā)展，配套技術(shù)日益完善，具備了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。全球著名的B-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)廠家如荷蘭DSM公司已有酶法合成的商品頭抱氨芐、阿莫西林等產(chǎn)品面世。由于酶法應(yīng)用于B-內(nèi)酰胺抗生素合成，不僅可減少反應(yīng)步驟，而且

2、還可減少廢棄物的產(chǎn)生，有利于保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)異，所含雜質(zhì)極少。因此，21世紀(jì)B-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成將是發(fā)展的必然趨勢(shì)。我國酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，與國外先進(jìn)廠家差距較大。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們對(duì)自身居住環(huán)境的要求，政府對(duì)環(huán)保的重視，政府和越來越多的企業(yè)加大“綠色化學(xué)制藥”的研究開發(fā)，特別是加快工業(yè)化生產(chǎn)的推進(jìn)進(jìn)程。酶法產(chǎn)品主要有三大特點(diǎn)：一是產(chǎn)品含量穩(wěn)定、變化小，可降低制劑在有效期內(nèi)的檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)，并且雜質(zhì)低，降解速度慢，對(duì)制劑的安全性，尤其是特殊制劑的穩(wěn)定性尤為重要。二是酶法產(chǎn)品生產(chǎn)批量能夠達(dá)到化學(xué)法產(chǎn)品的23倍，這既能夠大幅度節(jié)省制劑生

3、產(chǎn)商的檢驗(yàn)成本，粗略估算原料檢測(cè)成本能夠節(jié)約人民幣9元/kg；同時(shí)，也便于物流、倉儲(chǔ)和生產(chǎn)管理。三是酶法產(chǎn)品是通過生物酶一步到位生產(chǎn)而得，以純凈水為介質(zhì)，不使用傳統(tǒng)化學(xué)工藝中的特殊化工原料，有機(jī)溶劑的使用量大幅度減少90%,廢水排放減少80%，品質(zhì)更純凈。青霉素?；傅陌l(fā)展青霉素酰化酶是從微生物或其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素?；傅奈⑸飶V泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽抱桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌(Kluyvera)等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、柑橘黃單胞菌和大腸桿菌,

4、尤以大腸桿菌最為常用。為了獲得廉價(jià)高效的青霉素酰化酶,人們對(duì)大腸桿菌等進(jìn)行了選育和基因改造,用獲得的大腸桿菌天然或工程菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)而得到所需要的酶。從大腸桿菌或其他微生物獲得的酶可以以游離的形式使用,也可以被固定在載體上制成固定化酶(ImmobilizedEnzyme)使用。與液體酶(酶溶液)相比,固定化酶的主要優(yōu)點(diǎn)是：酶和反應(yīng)液易于分離,酶可重復(fù)使用。穩(wěn)定性高于天然酶。有利于反應(yīng)過程的連續(xù)化和自動(dòng)化控制。反應(yīng)液中殘留雜質(zhì)少,有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制。產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低廉。從微生物發(fā)酵提純的酶溶液制備固定化酶的方法大致可分為吸附法、包埋法和共價(jià)結(jié)合法三大類。共價(jià)結(jié)合法具有酶與載體結(jié)合牢固、不易脫

5、離等優(yōu)點(diǎn),因此應(yīng)用較多。其工藝過程為：濃縮酶溶液在緩沖溶液中與交聯(lián)劑(如戊二醛)和高分子載體進(jìn)行振蕩偶合,然后過濾洗滌得到固定化酶,所得固定化酶因其載體形態(tài)不同大致分為纖維狀和顆粒狀2種。近年來使用顆粒狀固定化酶比較普遍。用做固定化酶載體的高分子材料有：聚丙烯纖維、醋酸纖維、聚氨酯泡沫樹脂、環(huán)氧樹脂、丫內(nèi)酯樹脂等。青霉素催化內(nèi)酰胺抗生素合成研究酶法合成一內(nèi)酰胺類抗生素可以通過動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)控制完成。動(dòng)力學(xué)控制的合成反應(yīng)的產(chǎn)量取決于酶催化的3種不同反應(yīng)的速率：(1)一內(nèi)酰胺類化合物的合成反應(yīng)；(2)活化的?；w的水解反應(yīng)；(3)合成的抗生素的水解反應(yīng)。反應(yīng)過程中青霉素?；竿瑯泳哂兴饣钚裕?/p>

6、過固定生物催化劑，選擇適宜的溶劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，提供高濃度的活化側(cè)鏈供體及一內(nèi)酰胺核等一系列條件可以減少水解反應(yīng)。合成過程涉及適宜的親核試劑(如6一氨基青霉烷酸、7一氨基頭抱霉烷酸、7一氨基脫乙酰氧頭抱霉烯酸)，在低pH值條件下的直接酰化作用。低pH值條件下，大多數(shù)底物以非解離狀態(tài)存在，有利于合成，因此采用水有機(jī)溶劑混合溶劑減少了離子化形式的底物，從而有助于一內(nèi)酰胺抗生素的合成。Fernandez等在含50(體積分?jǐn)?shù))的有機(jī)溶劑的非常規(guī)介質(zhì)中，利用來自于Ecoli及Kluyveracitrophila的固定化青霉素G?；赋晒Φ睾铣闪丝股亍Ｈ欢?，有機(jī)溶劑對(duì)酶有一定的抑制作用，從而使酶的活性降

7、低。目前的解決方法主要是利用固定化技術(shù)增強(qiáng)酶在不利介質(zhì)中的穩(wěn)定性，如將酶共價(jià)結(jié)合到載體上，使其穩(wěn)定性大大提高。當(dāng)存在高濃度的有機(jī)助溶劑時(shí)，在固定化酶分子周圍人工建立一個(gè)微環(huán)境可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，并使酶活性損失最小。酶法縮合過程是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過程,它既可以發(fā)生底物間的縮合反應(yīng),同時(shí)又使產(chǎn)物發(fā)生酶解反應(yīng),此種可逆反應(yīng)過程又由同一種酶來催化完成。除了酶本身的因素外,反應(yīng)體系中的其他條件都會(huì)對(duì)反應(yīng)程度有不同的影響,如:反應(yīng)體系溫度、pH值，反應(yīng)底物的純度及濃度,反應(yīng)原料帶入的雜質(zhì)和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物及反應(yīng)體系電解質(zhì)濃度,反應(yīng)產(chǎn)物的濃度等等。阿莫西林研究現(xiàn)狀自20世紀(jì)90年代以來,阿莫西林己

8、進(jìn)入快速發(fā)展的黃金時(shí)期,從原料到制劑,該品種每年均以超過20%的幅度增長,已成為抗生素品種中最引人注目、發(fā)展最快的品種之一。工業(yè)上通常使用化學(xué)方法合成阿莫西林,這個(gè)過程步驟繁多,條件苛刻,而且需要大量有毒、難于降解的有機(jī)試劑,成本很高,污染嚴(yán)重。酶促合成可以簡化合成工藝,降低所需成本。而且目前的阿莫西林酶法合成工藝是一種懸濁液懸濁液體系(Suspension.SuspensionSystem),這一體系指的是反應(yīng)前的混合物主要由懸浮在過飽和液相中的固體反應(yīng)物所組成，反應(yīng)后的混合物則主要由固體產(chǎn)物所組成，也稱為固.固體系(Solid.SolidSystem)。在這種體系中，底物和產(chǎn)物主要以不溶的

9、微粒存在，而酶促反應(yīng)則在液相中發(fā)生。與一般的酶促反應(yīng)相比，其單位體積溶劑的產(chǎn)率獲得了很大提高。在熱力學(xué)控制合成的懸濁液.懸濁液體系中，如果達(dá)到平衡時(shí)的理論產(chǎn)物濃度比溶解度高，產(chǎn)物會(huì)在平衡之前達(dá)到過飽和狀態(tài)并從反應(yīng)混合物中沉淀出來。這個(gè)過程一直持續(xù)到一種反應(yīng)物濃度降到溶解度以下，新的平衡建立為止。這樣，起始混合物中的固體反應(yīng)物幾乎都轉(zhuǎn)化成了固體產(chǎn)物，產(chǎn)率得到很大提高。由于反應(yīng)平衡是由產(chǎn)物沉淀推動(dòng)的，這種懸濁液一懸濁液體系又被稱為沉淀推動(dòng)法(PrecipitationDrivenSynthesis)。動(dòng)力學(xué)控制合成的懸濁液.懸濁液體系則要復(fù)雜的多，包括多個(gè)子過程，比如底物和產(chǎn)物的溶解和結(jié)晶，產(chǎn)物的

10、酶促合成，底物和產(chǎn)物的酶促水解等。而且，由于反應(yīng)物和產(chǎn)物都是弱電解質(zhì)，動(dòng)力學(xué)懸濁液.懸濁液體系的各個(gè)子過程受pH值的影響特別大，同時(shí)也反過來影響pH值。酶法阿莫西林國內(nèi)外生產(chǎn)概況：阿莫西林自問世以來，因療效確切、抗菌譜廣、治療方便的優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用上迅速取代青霉素成為用量第一的B內(nèi)酰胺抗生素。從國際市場(chǎng)總需求量（可實(shí)現(xiàn)銷售產(chǎn)量）來看，阿莫西林近年來依然平穩(wěn)增長，表明該品種仍處產(chǎn)品生命周期的穩(wěn)定期，全球市場(chǎng)年銷量超過3萬噸。阿莫西林的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝為化學(xué)合成。在生產(chǎn)過程中，需要使用大量的有毒有害有機(jī)溶劑，以及為實(shí)現(xiàn)反應(yīng)順利而必須加入的保護(hù)基團(tuán)。反應(yīng)條件在低溫下運(yùn)行，一方面增加了動(dòng)力消耗，另一方面需

11、要使用鹵烴制冷劑。這些，均不符合現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展、綠色工藝的理念。為此，自上世紀(jì)80年代起，業(yè)內(nèi)一直探求阿莫西林綠色生產(chǎn)工藝。2002年8月，DSM率先將酶法阿莫西林生產(chǎn)工業(yè)化。Almeria工廠產(chǎn)能估計(jì)為3000噸/年；印度Toansa工廠生產(chǎn)，產(chǎn)能估計(jì)為3000噸/年。國內(nèi)酶法阿莫西林研究雖然起步較晚，但進(jìn)展較快。目前，聯(lián)邦、石藥、華藥、威奇達(dá)、魯抗企業(yè)都已建成不同規(guī)模的酶法阿莫西林西林生產(chǎn)線且完成注冊(cè)工藝變更實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品上市銷售。隨著酶法阿莫西林的大規(guī)模上市，因其在產(chǎn)品質(zhì)量、生產(chǎn)成本、環(huán)保方面的明顯優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)正在快速取代目前的化學(xué)阿莫西林市場(chǎng)。酶法阿莫西林反應(yīng)機(jī)理：1、反應(yīng)路線：阿莫西林動(dòng)力學(xué)控

12、制的合成是同一酶催化下的三個(gè)反應(yīng)過程。即1.阿莫西林的合成，2.對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯水解，3.阿莫西林水解，酶法合成阿莫西林的過程中產(chǎn)物與底物均被水解形成副產(chǎn)物對(duì)羥基苯甘氨酸4，反應(yīng)方程式見圖1.1H2N+COOHHONH2OOCH3MethanolHONH2OCCHHCOOH6-Aminopenicillanicacid(6-APA)CCHCOHydroxyphenylglycine(HPG)OHH6-Aminopenicillanicacid圖1.1酶法合成阿莫西林反應(yīng)路線圖2、反應(yīng)機(jī)理據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌青霉素G酰化酶催化合成阿莫西林的機(jī)理如下，首先具有活性的SerB：OY羥基親核進(jìn)攻對(duì)羥

13、基苯甲酸酯上的羰基碳原子，形成一種四面體結(jié)構(gòu)的反應(yīng)中間體，由于兩個(gè)氨基酸的氫鍵作用使得氧負(fù)離子空穴穩(wěn)定。當(dāng)釋放甲醇，羰基復(fù)原后形成共價(jià)的酰基-酶復(fù)合體中間體。在接下來的步驟中，酰基與6-APA中的氨基結(jié)合生成酰胺鍵，合成阿莫西林，酶復(fù)原，當(dāng)然若?；c水中的羥基結(jié)合，則生成羧基，即發(fā)生對(duì)羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)生成對(duì)羥苯甘氨酸9。從反應(yīng)的歷程可以推測(cè)，在進(jìn)行阿莫西林的合成過程中，對(duì)羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)是不可避免的，只能是通過改變其它條件盡可能降低水解反應(yīng)的速率，進(jìn)而降低側(cè)鏈酯的消耗，當(dāng)然最根本的還是通過酶特性的改進(jìn)，改善S/H值。具體反應(yīng)歷程見圖1.2Asn|3241NIHHOHNIHNIH

14、佇HHOAsn241Asn0241N一HOHr.2HOSerBI圖1.2酶法合成阿莫西林反應(yīng)機(jī)理參考文獻(xiàn)Influenceof6-aminopenicillanicacidonamoxicillinsynthesisandp-hydroxyphenylglycinemethylesterhydrolysisBi2005,23(2)AKineticStudyofSynthesisofAmoxicillinUsingPenicillinGAcylaseImmobilizedonAgaroseMathematicalmodelingofbatchandsemibatchreactorsforthee

15、nzymicsynthesisofamoxicillinUseofneuralnetworksinthemathematicalmodellingoftheenzymicsynthesisofamoxicillincatalysedbypenicillinGaJourrnalofMicrobiology&Biotechnology,24(9),1761-1767;2008ProcessforpreparationofB-lactamsatconstantlyhighconcentrationofreactantsUS6048708酶法阿莫西林質(zhì)量研究，河北化工，2008，31(4)分離干燥阿莫

16、西林工藝路線簡述：將水、側(cè)鏈活性酯（或酯的鹽酸鹽）和6-APA加入反應(yīng)罐，在固定化酶的作用下，反應(yīng)生成阿莫西林。反應(yīng)過程中，以氨水/鹽酸控制pH。反應(yīng)完畢，將分離出的固體阿莫西林及反應(yīng)液混勻、加鹽酸溶解過濾，加氨水進(jìn)行等電點(diǎn)結(jié)晶。將濕晶進(jìn)行分離、洗滌、干燥、混粉、磨粉、檢驗(yàn)、包裝（出口產(chǎn)品可干壓加工成重粉）得成品。1.3酶的實(shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展歷程青霉素酰化酶是從微生物或其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素?；傅奈⑸飶V泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌（Kluyvera）等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、