人表皮生長因子hEGF在大腸桿菌中的高效表達工藝研究醫(yī)學畢業(yè)論文

1、第 頁 共 23 頁第 頁 共 23 頁人表皮生長因子 hEGF 在大腸桿菌中的高效表達工藝研究王文杰廣州大學生命科學學院摘要 目的：為了提高hEGF （human epidermal growth factor）的產(chǎn)量，本次實驗主 要從培養(yǎng)基優(yōu)化，IPTG誘導濃度和誘導時間的摸索等方面來提高重組大腸桿菌hEGF表達量， 并進行了 5 L 發(fā)酵罐的小試發(fā)酵研究。 方法：采用搖瓶培養(yǎng)方式，先通過單 因子實驗從甘油，乳糖，葡萄糖三種碳源中選出兩種效果顯著的碳源作為混合碳源。 從玉米漿，蛋白胨，酵母膏三種氮源中選出兩種效果顯著的碳源作為混合氮源。通 過“四因素三水平 ”正交實驗確定最佳的培養(yǎng)基配方。

2、并在此優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎上進 行 IPTG 濃度和誘導時間摸索。 結(jié)果：單因子實驗確定了乳糖和甘油作為有效的混合 碳源，蛋白胨和酵母膏作為有效混合氮源， “四因素三水平 ”正交實驗確定最佳的培 養(yǎng)基配方（甘油 1.5%，乳糖 2%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 1.5%，氯化納 1%）時表達 量達到14.8 %。同時，最佳的IPTG濃度為1.0 g/ml和最佳誘導時間為4h。5 L發(fā) 酵罐的小試發(fā)酵放罐時菌重（濕重）為 42.3 g/L,表達量為15.7 %。關鍵詞 人表皮生長因子（hEGF）;大腸桿菌表達系統(tǒng)；培養(yǎng)基優(yōu)化；發(fā)酵High-level expression of recombinati

3、on human EGF in E. coliWang wen jieSchool of Life Sciences， Guangzhou UniversityABSTRACT Objective: In order to improve the yield of hEGF, which was expessed in recombinant Escherichia coli. Studies include optimization of culture medium, searching for optimization concentration of IPTG and inductio

4、n time, were carried out. Also, a small-scale fermentation was carried out in 5 L fermentor. Methods: To study the optimal cultivation condition, single factor and orthogonal experiment had been combined to research by shake-flask cultivate. Two kinds of carbon source and nitrogen source was selecte

5、d from lactose, glycerol, glucose, corn steep liquor, peptone and yeast extract by single factor screen experiment as mixed carbon and nitrogen source. Then, the optimized formula of the culture medium was confirmed through the 4-factors and 3-levels orthogonal experiment. Based on this optimization

6、 of culture medium, the optimized concentration of IPTG and induction time was investigated.Results:Lactose and glycerol were selected as mixed carbon source, peptone and yeast extract were selected as mixed nitrogen source. The expression of hEGF reached 14.8 % at the optimized formula of the cultu

7、re medium (glycerin 1.5 %, lactose 2 %, peptone 0.5 %, yeast extract 1.5 %, NaCl 1%). Meanwhile, the result showed the optimized concentration of IPTG is 1.0 mmol/L and the optimized induction time is 4 h. Finally, wet cell weight of recombinant E.coli in 5 L fermentor was high as 42.3 g/L, and the

8、expression of hEGF reached 15.7 %.KEY WORDS hEGF; E. coli expression system; Medium optimization； Fermentation目錄 TOC o 1-5 h z 前 言 4 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 材料與方法 5實驗材料 5實驗儀器 51.2 實驗試劑 61.3培養(yǎng)基及試劑配制 6實驗方法 8高表達菌株的篩選 8培養(yǎng)基篩選 9誘導物 IPTG 濃度對 hEGF 表達的影響 11誘導時間對 hEGF 表達的影響 115L 發(fā)酵罐小試 11 HYPE

9、RLINK l bookmark16 o Current Document 結(jié)果與分析 123.1 高表達菌株的篩選 12培養(yǎng)基篩選 133.2.1 碳源篩選 13氮源篩選 14正交實驗 14誘導物 IPTG 濃度對 HEGF 表達的影響 17誘導時間 173.55L 發(fā)酵罐小試 18 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document 討論 20 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 參考文獻 22 HYPERLINK l bookmark46 o Current Document 致謝 23人表皮生長因子(hum

10、an epidermal growth factor)是由53個氨基酸殘基組成的單 鏈多肽，全長120 kb,分子量為6045 Da,是一種具有廣泛生物活性的多肽，能激活 胞外大分子的合成細胞增殖等作用 1。刺激外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細胞增值和分化， 促進組織生長、發(fā)育和成熟，因此 hGEF 在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)上都有廣泛的應用前 景，醫(yī)藥上，能加速創(chuàng)傷的修復，可用于燒傷創(chuàng)傷或角膜移植等治療中，能抑制胃 酸分泌，增強表皮細胞的蛋白質(zhì)和 RNA 的合成及促進細胞代謝等。 在化妝品工業(yè)中， 可減少皮膚皺紋，減少陽光對皮膚的傷害，可加速皮膚新生細胞替代衰老細胞的進 程, 使皮膚年輕化，起到護膚，抗皺，

11、美白，祛斑，防曬，抑制粉刺和青春痘生長，去除斑痕等作用。hEGF作用機理：hEGF通過與細胞膜受體結(jié)合，在細胞內(nèi)的傳遞過程中，構(gòu)成 一個復雜的代謝網(wǎng)絡來控制細胞的代謝，分化和癌變。當一個體系中有hEGF存在時，它會和 hEGF-R 結(jié)合形成復合物，這一復合物有個橫向擴散的副效應，平均每 毫秒相碰撞一次，從而導致一些復合物相互聚集形成微叢。 hEGF 受體被固定，經(jīng)吞 噬作用，微叢中的復合物被細胞吞飲，形成吞飲小泡，吞飲小泡最后與溶酶體融合， 之后酶解，酶解的產(chǎn)物能不斷移行到細胞核內(nèi)，刺激DNA的合成3。hEGF受體的三級結(jié)構(gòu)區(qū)具有特異性的酪氨酸蛋白酶活性，hEGF與受體結(jié)合誘導受體磷酸化，激

12、活酪氨酸蛋白酶。hEGF受體不僅能自身磷酸化，而且還可以使依賴于Ca2+的分子量 是 35Kd,36Kd 的蛋白質(zhì)或磷脂酰肌醇磷酸化。使靶細胞核內(nèi)基因活化， 作用于 DNA 復制相關的酶和細胞增殖有關的基因表達，從而促進細胞的增殖分化。雖然 hEGF 廣泛存在于正常生理狀態(tài)下的幾乎所有體液中，如血液，精液，前列 腺液，唾液羊水，組織液，胃液等。體內(nèi)的多種細胞和腺體也能分泌hEGF，但含量低且提取困難，因此利用基因工程菌生產(chǎn) hEGF 很具現(xiàn)實意義。目前已有大量文獻 報道了 hEGF在重組大腸桿菌中的克隆和表達，證明了其可行性。早在1982年，Smith等人首先用磷酸三脂合成的hEGF部分基因片

13、段置于TrpE 基因下游，形成TrpE-hEGF基因，轉(zhuǎn)化進E.coli k-12菌株，但是表達分泌的hEGF 在胞內(nèi)即被子蛋白酶分解。1922 年，中科院上海生化所甘人寶等人 5構(gòu)建 E.coli 堿性磷酸酶啟動子及信號肽第 4 頁 共 23 頁序列-hEGF基因的pAE-8質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化該酶缺失的E.coli變異株K539，得表達菌株EEB, hEGF 產(chǎn)量 1.5 mg/L。在重組短芽抱桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)中，1922年，Ebisu等人使用Bacillus brevis47的e 基因的信號肽序列，與合成的 hEGF基因組成一個融合基因，插入表達載體 e的 Hpal-Bam I，將構(gòu)建出的大小為5.7

14、 kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Bacillus brevis HPD31宿主菌中， 胞外表達產(chǎn)量最大可達1.1 g/L。2001年，阮文權(quán)等人用質(zhì)粒(UV 5par8egf)菌種(E.coli, JM101)能過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得 重組菌，并對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，實驗得出重組菌的hEGF產(chǎn)率最高可達到102 mg/Lo2006年，張海毅等人 用一株大腸桿菌 BL21(DE3)pBLMV-EGF生產(chǎn)hEGF研 究葡萄糖的供應速率對 hEGF的表達分泌的影響。實驗結(jié)果得出，單位菌株產(chǎn)生的 hEGF水平最高為葡萄糖供應速率為 0.196 g/h時，達hEGF占42 %。2010年，張海淼等人9將重組表達載體 pET3c-

15、SUMO-hEGF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(AI)中，以阿拉伯糖為誘導劑，對誘導表達參數(shù)進行優(yōu)化，最終表達量約為 20.2%。一直以來，hEGF的表達水平都不高，致其產(chǎn)量低，價格昂貴。因此hEGF的高效表達很有研究價值。本次實驗將先通過平板劃線獲得單菌落，再通過搖瓶培養(yǎng)確 定高效表達菌株，然后通過搖瓶培養(yǎng)確定最佳的培養(yǎng)基碳氮源及其比例。在優(yōu)化培 養(yǎng)基基礎上再進行最佳誘導時間，最佳誘導溫度及最佳IPTG誘導濃度等方面進行研 究，確定各參數(shù)后在5L機械攪拌通風發(fā)酵罐進行小試發(fā)酵。2材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗儀器儀器廠商SW- CJ- IFD單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司3K30

16、高速臺式冷凍離心機Sigma公司第5頁共23頁第 頁 共 23 頁第 頁共23頁TGL 16G臺式高速離心機上海安亭科學儀器廠KDC-160HR高速冷凍離心機科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司JJ500電子天平Sartorius 公司臺式天平美國雙杰兄弟有限公司可調(diào)式水浴鍋寧波自動化儀器廠SKD-01電熱恒溫培養(yǎng)箱寧波機電工業(yè)研究設計院Arium611純水發(fā)生器Sartorius 公司BCD 268WA低溫冰箱華凌公司SHZ-82A恒溫振蕩器富華公司MDF-V40865超低溫冰箱SANYO公司Power Pac-300蛋白電泳槽及電源Bio-RAD 公司微波爐廣東順德格蘭氏5 L發(fā)酵罐上海咼機實業(yè)總公

17、司2.1.2實驗試劑名稱廠家IPTGPromega丙烯酰胺SigmaN,N-亞甲雙丙烯酰胺SigmaAgar廣東環(huán)凱微生物科技公司LB05酵母膏（總氮8.0 %）安琪乳糖國產(chǎn)分析純玉米漿（總氮3.5 %）國產(chǎn)分析純氯化鈉國產(chǎn)分析純葡萄糖國產(chǎn)分析純蛋白胨（總氮14.5 %）OXOID氨芐青霉素廣州市威佳生物科技有限公司1.3培養(yǎng)基及試劑配制IPTG貯備液：用滅菌去離子水配成1 mol/L保存于-20 C冰箱。氨芐貯備液：用滅菌去離子水配成100 mg/L保存于-20 C冰箱。LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L ,蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L ,調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2，高壓滅 菌12

18、1 C 20 min, 4 C保存。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g/L。SDS試劑：30丙烯酰胺貯備液：丙烯酰胺29 g, N,N-亞甲雙丙烯酰胺1 g，蒸餾水定容至100 ml2Xoad ing buffer：Tris Cl(pH 6.8) 100 mmol/L , SDS 4 % (w/v),溴酚藍 0.2 %(w/v),甘油 20 %(w/v) ，巰基乙醇 5 %(v/v)濃縮膠緩沖液：1M Tris CI(pH6.8)分離膠緩沖液：1.5M Tris Cl(pH8.8)電極緩沖液( 1 L)：Tris-base 3.03 g Gly 14.4 g, SDS 1 g,加水定容到 1 L。染

19、色液：考馬斯亮藍 G-250 0.25%(w/v)，甲醇 45%(v/v)，冰醋酸 10%(v/v)脫色液：95%乙醇(v):冰醋酸(v):水(v) = 25:8:67過硫酸胺( Aps)0.1g溶于1ml超純水TEMED發(fā)酵種子培養(yǎng)基 (1 L)：蛋白胨 10 g,酵母粉 10 g, KH2PO4 2.5g, K2HPO4 1.0 g, NaCl 4 g, pH 7.2，高壓滅菌 20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基( 3 L)：甘油45 ml,乳糖60 g,蛋白胨15 g,酵母膏45 g,氯化鈉30 g,消泡劑 1 ml，力卩NaOH調(diào)pH調(diào)至7.2，高壓滅菌121 C 20 min；發(fā)酵流加培養(yǎng)基:

20、碳源：50 %甘油400 ml，高壓滅菌121C 20min;氮源：10 g蛋白胨，30 g酵母膏溶于400 ml水，高壓滅菌121 C 20min2.2實驗方法2.2.1高表達菌株的篩選1）通過劃線平板培養(yǎng)，獲得單菌落，挑取單菌落分別接種到3 ml LB培養(yǎng)液（含氨芐青霉素100血/ml）中，37 C振蕩培養(yǎng)8 h,保種（甘油終濃度10 %）,于-80 C凍 存作種子菌；2）菌種按1 %比例接種到3 ml新鮮LB培養(yǎng)液（含氨芐青霉素100舊/ml）中，37 C,250 rpm 振蕩培養(yǎng) 5 h（OD6oo= 0.6-0.8），取菌液 1 ml, 12,000 rpm,離心 2 min 收集菌

21、體作為誘導前樣品；3）加IPTG至終濃度1.0 mmol/L , 37 C, 250 rpm振蕩培養(yǎng)，誘導表達4 h后取菌液1 ml, 12,000 rpm,離心2 min收集菌體作為誘導后樣品；4）15 % SDS凝膠電泳：樣品處理方法：-20 C冰箱中取出離心好樣品，加100瓦水重懸，再加入20卩l(xiāng)6Xoading buffer混勻，沸水中煮10 min, 12000rpm離心10 min，備用于電泳。15%SDS蛋白電泳凝膠配方分離膠（15 %）濃縮膠（4 %）30%丙烯酰胺溶液5mL0.67mLddH2O2.3mL2.7mL1.5M Tris (PH8.8)2.5mL-0.5M Tri

22、s (PH6.8)-0.5mL10%SDS溶液0.1mL0.04mL10%APS溶液0.1mL0.04mLTEMED10d5d電泳操作：將灌注凝膠的玻璃板清洗干凈后放在晾架上晾干，按照BIO-RAD公第 頁共23頁第 頁共23頁司蛋白質(zhì)電泳操作說明書的要求，安裝好玻璃板。注意檢漏，如果有滲漏就要重新 安裝玻璃板，確認玻璃板不會漏膠后立即配置按照配方配制15% SDS分離膠,用移液槍迅速并小心加至已安裝好的兩玻璃板的間隙中，緩慢加入，盡量不要讓膠 中有氣泡，加到一定位置后預留出灌注濃縮膠所需的空間（大概是泳道的梳子齒長 再加1 cm左右的長度），然后用移液器在兩玻璃板的間隙加蒸餾水封住膠面，注意

23、 不要用力太大，讓蒸餾水流出壓平分離膠的平線，室溫垂直放置30 min左右，待分離膠完全聚合后，可以從玻璃表面上看出一條明顯清晰的界面，這表示濃縮膠已經(jīng) 聚合，傾出剛灌注的用來壓膠的水，用濾紙或移液器吸凈殘留液體。再按照配方配 置15 %的濃縮膠，迅速用移液槍在兩玻璃板的間隙灌注濃縮膠，液面與一塊較矮的 玻璃板平行，立即在插入梳子，小心操作，避免混入氣泡，室溫下垂直放置。15 min左右待濃縮膠完全聚合后，垂直的拔出梳子，夾板固定在電泳槽上。內(nèi) 外槽加入已配好的1 XTris-甘氨酸電泳緩沖液，內(nèi)槽一定要加滿，外槽按照規(guī)定的體 積添加。最后按預定設計的順序點樣 10瓦，點樣時要留心加樣的順序，

24、然后連接好 電源，按恒壓方式進行電泳。電泳條件：開始時恒壓60 V，當Maker前沿進入分離膠后（大概25-30分鐘），提高電壓到120V，直至溴酚藍到達分離膠的底部，關閉電 源，停止電泳。電泳結(jié)束后，從電泳裝置上卸下玻璃板，標記凝膠方向，小心取出 凝膠，用考馬斯亮藍染色液染色 5-10 min。蒸餾水清洗兩次，再用脫色液脫色，過 20 min換一次脫色液，一直脫至能看清楚電泳的條帶。2.2.2培養(yǎng)基篩選單因子碳源篩選，單因子氮源篩選和正交實驗過程：100 ml搖瓶，20 ml裝液量，加20 ul氨芐青霉素（100 mg/ml），接種后37C, 200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)5 h后（OD600

25、 值到0.8左右）取樣1 ml，離心收集體，-20 C保存。然后加20止IPTG（1 mol/L）誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，停止培養(yǎng)，取樣1 ml離心，收菌體，-20 C保存。培養(yǎng)基的單子篩選按表一和表三進行碳源和氮源的篩選；表一單因子碳源篩選培養(yǎng)基試驗號碳源蛋白胨氯化鈉1甘油1 %1 %1 %2乳糖1 %1 %1 %3葡萄糖1 %1 %1 %高壓滅菌121 C, 20 min。單因子氮源篩選培養(yǎng)基：以氮源為基準折算含氮量表二實驗用氮源含氮量氮源總氮蛋白含量（總氮x 6.25）酵母膏8.0 %50 %蛋白胨14.5 %90.625 %玉米漿3.5 %21.875 %表三氮源篩選培養(yǎng)基（20 ml）

26、試驗號乳糖氮源氯化鈉10.2 g酵母膏0.6 g0.2 g20.2 g蛋白胨0.33 g0.2 g30.2 g玉米漿1.37 ml0.2 g高壓滅菌121C 20min.培養(yǎng)基的正交實驗按表四進行混合碳源和氮源的篩選:表四正交實驗培養(yǎng)基試驗號甘油乳糖蛋白胨酵母膏氯化鈉11 %1 %0.5 %1 %1 %21 %1.5 %1 %1.5 %1 %31 %2 %1.5 %2 %1 %41.5 %1 %1 %2 %1 %51.5 %1.5 %1.5 %1 %1 %61.5 %2 %0.5 %1.5 %1 %72 %1 %1.5 %1.5 %1 %82 %1.5 %0.5 %2 %1 %92 %2 %1

27、 %1 %1 %高壓滅菌121 C，20 min。223誘導物IPTG濃度對hEGF表達的影響最佳誘導濃度實驗：采用正交實驗培養(yǎng)基6作基礎培養(yǎng)基，100 ml搖瓶，20 ml裝液量，加20瓦氨芐青霉素（100 mg/ml），接種后37 C ,200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)5 h后 （OD值到0.8左右）取樣1 ml，離心收集體，-20 C保存。然后按下表加IPTG誘 導，37 C 200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后取樣1 ml，12000 rpm離心2 min,收集菌體。15 % SDS凝膠電泳分析hEGF的表達量。表5不同濃度IPTG作為誘導物試驗號IPTG 終濃度(um/ml)加入IPTG

28、的體積（d）10020.23.830.47.640.611.450.815.261.01971.222.881.426.82.2.4誘導時間對hEGF表達的影響最佳誘導時間實驗：選用正交實驗培養(yǎng)基 6為基礎培養(yǎng)基，100 ml搖瓶，20 ml 裝液量，加20瓦氨芐青霉素（100 mg/ml），接種后37 C ,200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)5 h后（OD值到0.8左右）加IPTG 20 d誘導，然后每隔1 h取樣一次，離心收集菌體，-20 C 保存。6 h后停止培養(yǎng)，取樣1 ml，12000 rpm離心2 min，收集菌體。15 % SDS凝膠電泳分析hEGF的表達量。5L發(fā)酵罐小試發(fā)酵種子培養(yǎng)

29、：1 L搖瓶，200 ml裝液量。加100 d氨芐青霉素后接種，37 C ,200r/min 培養(yǎng) 10 h.發(fā)酵罐發(fā)酵：往罐中加入 3ml氨芐青霉素，通過蠕動泵補料方式將種子移入發(fā)酵罐，維持溫度37 C，通過調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量控制溶氧在30 %左右。觀察pH變化。每隔1 h取樣，離心，測濕重，保存樣品。發(fā)酵進入生長期時溶氧持續(xù)下降，當溶氧開始回升時，開始補料。濕重至 30 g/L左右時，加3 ml IPTG進行誘導，每 隔1 h取樣待分析。誘導4 h后放罐，離心收集菌體-20 C保存。3結(jié)果與分析3.1高表達菌株的篩選通過劃線平板培養(yǎng),獲得單菌落，挑取單菌落接種到含100 ug/ml氨芐青

30、霉素的LB培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)10 h，再按2%接種量接種新LB培養(yǎng)基（含100 ug/ml氨芐青霉 素）中，培養(yǎng)至ODgoo0.6后取樣1 ml，離心取沉淀保存于-20 C冰箱中，作為誘導 前樣品。然后加IPTG誘導（終濃度為1 mmol/L） 4 h后取樣1 ml，離心取沉淀。誘 導前與誘導后樣品處理后進行15 % SDS電泳，檢測目標蛋白的表達情況。電 泳結(jié)果經(jīng)拍照后BandScan掃描分析，1-7號菌目的蛋白占總蛋白含量分別約為 7.5 %，8.7 %，10.5 %，10.3 %，0 %，14.1 %，12.3 %。其中表達量最高的是 6號菌株，因 而用來作為本次實驗種子菌。（圖1）kDa

31、 前 1234 M 567116. 0圖1 SDS電泳分析表達菌株的表達水平前：誘導前樣品；1-7:菌株號M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.2培養(yǎng)基篩選321碳源篩選以蛋白胨為唯一氮源，分別用甘油、乳糖、葡萄糖為不同的碳源，按表一配制培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取各誘導前后樣品處理后，經(jīng) 15 % SDS電泳后，拍照得到 下圖（圖2），再經(jīng)BandScan掃描分析后得出各配方hEGF的表達量：1號誘導前， 誘導后；2號誘導前，誘導后；3號誘導前，誘導后中hEGF分別約占總蛋白含量0 %，3.2 %； 2.5 %，15.2 %； 0 %，11.6 %。其

32、中2號和3號培養(yǎng)基明顯比1號培養(yǎng)基的 hEGF表達量更高，2號培養(yǎng)基因為選用乳糖為碳源，乳糖對菌體（含有乳糖操縱子） 起到誘導作用，因而誘導前菌體也有表達。綜合考慮，以 2號3號培養(yǎng)基碳源（即 乳糖，甘油）作為本次實驗的混合碳源。圖2 SDS電泳分析碳源的篩選1前2前3前：1,2,3號試驗誘導前樣品；1后2后3后：1,2,3號試驗誘導后樣品；M: Middle Molecular Weight Protein Markers322氮源篩選選用乳糖作為唯一碳源，分別用酵母膏，蛋白胨，玉米漿作為不同的氮源，按 表三配制培養(yǎng)基進行單因子試驗。實驗過程中發(fā)現(xiàn)以玉米漿為氮源時，菌濃度很低 或不生長，經(jīng)多

33、次實驗確定玉米漿不適合作為本次實驗氮源。在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng) 并進行誘導，取各誘導前后樣品處理后經(jīng)15 % SDS電泳后拍照得下圖（圖3）， 再經(jīng)過BandScan掃描分析后得出各試驗號誘導前后 hEGF占總蛋白的含量：1號誘13.4 %；因而選導前，誘導后；2號誘導前，誘導后；3號誘導前，誘導后，分別為10.7 %，10.2 %，12.5 %； 0 %，0 %。1號2號配方中誘導后hEGF表達量差異不大, 用1號，2號配方氮源（即蛋白胨，酵母膏）作為本次實驗的混合氮源。66. 245.035.025.0圖3 SDS電泳分析氮源的篩選LkDa16.018.414.41前2前3前：1-3號試驗誘導

34、前樣品；1后2后3后：1-3號誘導后樣品；M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.2.3正交實驗實驗以甘油、乳糖作為混合碳源，以酵母膏、蛋白胨作為混合氮源。分別的1 %和 2 %三個水平作 四因素三水平”正交實驗（氮源比例以蛋白胨為準折算含氮 量），按表四配制培養(yǎng)基后作試驗。在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進行誘導，取各誘導前后樣品處理后經(jīng)15 % SDS電泳后拍照得下圖（圖4-6），再經(jīng)BandScan掃描后得出各試驗誘導前后hEGF的表達量。表6正交實驗各種不同培養(yǎng)基對hEGF表達量的影響拉傘甘 培養(yǎng)基1號后2號3號4號誘導刖刖后刖后刖后表達量（%）1.

35、59.88.79.89.612.36.58.05號6號7號8號9號前后刖后刖后刖后刖后9.012.13.314.810.211.510.012.89.412.5由此可知，配方6較其它配方hEGF表達量更高，因而選用配方 6作為本次實驗的基本培養(yǎng)基。1前1后366.215.035.025.0184144圖4: SDS電泳分析正交實驗的篩選 （1-4號）M kDa116.01前-4前：1-4號實驗誘導前樣品；1后-4后：1-4號實驗誘導后樣品;M: Middle Molecular Weight Protein MarkerskDa116.0gflft7后7前6,后6前54神M8J66. 245.

36、 035. 025.018. 414*4圖5: SDS電泳分析正交實驗的篩選 （5-8號）5前-8前：5-8號實驗誘導前樣品；5后-8后：5-8號實驗誘導后樣品;M: Middle Molecular Weight Protein Markers圖6: SDS電泳分析正交實驗的篩選 （9號）9前：9號實驗誘導前樣品9后：9號實驗誘導后樣品M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.3誘導物IPTG濃度對hEGF表達的影響以正交配方6為基本培養(yǎng)基，接種培養(yǎng) 5 h (OD6000.8)取樣1 ml，離心取沉淀 作為誘導前樣品，然后按表5添加IPTG量進

37、行誘導，培養(yǎng)4 h后取樣與誘導前樣品 一起，處理后經(jīng)15 % SDS電泳后，拍照得下圖(圖 7)，經(jīng)BandScan掃描分 析后得出各種IPTG濃度誘導后hEGF的表達量：誘導前約為3.5 %，誘導濃度0 mmol/L , 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L , 0.6 mmol/L, 0.8 mmol/L，1.0 mmol/L，1.2 mmol/L，mmol/L 時 hEGF表達量分別約為：5.3 %，6.8 %，8.4 %，11.5 %，13.0 %，14.8 %， 15.0 %，15.1 %。由此可知，hEGF的表達量在范圍內(nèi)隨IPTG濃度增加而增加，誘 導濃度為1.0 mmo

38、l/L時hEGF的表達隨著IPTG濃度影響不大，從節(jié)約成本角度考慮， 最終確定1.0 m/ml的誘導濃度為最適IPTG誘導濃度。kDa1!6.066245.035.025.018.414.4圖7: SDS電泳分析IPTG濃度對表達量的影響前：誘導前；1-8 : IPTG 終濃度分別為 0,0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 mmol/L 誘導后;M: Middle Molecular Weight Protein Markers3.4誘導時間以配方6為基本培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)5 h后，加IPTG誘導至終含量為1.0 um/ml，6 h內(nèi)每隔1 h取樣一次，離心取沉淀

39、于 -20 C冰箱保存。樣品經(jīng)處理后進行SDS電泳，拍照得下圖（圖8）,再經(jīng)Ba ndSca n掃描分析，得出各樣品中hEGF 含量分別為：誘導前3.1 %; 1 h約4.8 %; 2 h約8.0 %; 3 h約11.6 %; 4 h約14.1 %;5 h約14.3 %; 6 h約14.5 %。由此可知，誘導后 4 h-6 h，hEGF表達量較高，5 h和 6h比4 h略高，但從生產(chǎn)節(jié)省能耗角度考慮，最終確定誘導后 4 h為最適誘導時間。前 12 M 3116.066.2圖8: SDS電泳分析不同誘導時間對hEGF表達量的影響45.035+025.018.414.4前：誘導前；1-6 :分別為

40、誘導后1h, 2h, 3h, 4h,5h, 6h樣品M: Middle Molecular Weight Protein Markers5 L發(fā)酵罐小試取-80 C凍存甘油菌種1支，1： 1000接種于LB培養(yǎng)基中（200 ml裝液量/1 L 搖瓶），37 C, 200 r/min培養(yǎng)8 h-10 h后移入發(fā)酵罐（3L裝液量/5 L罐）。發(fā)酵結(jié)果如圖9-11所示，工程菌接種后0-3 h內(nèi)，菌體濕重增加緩慢，菌種處 于適應期；3 h后，菌體進入開始高速生長期，開始流加氮源；4.5 h左右，開始補加碳源；當濕菌重達到30 g/L時，暫停流加甘油使菌體處于饑餓狀態(tài)并維持30 min。加入1 mmol

41、/L終濃度的IPTG進行誘導，并于誘導1 h后開始緩慢流加甘油，使pH 值維持在7.2左右，此時，菌體仍有緩慢生長，但其比生長速率要遠低于高速生長期。 目的蛋白hEGF的表達，隨著時間的增加而也增加。在誘導 4 h后，融合蛋白表達量 達到最大值15.7 %，始時的菌體濕重為42.3 g/L。g(重濕time(h)圖9發(fā)酵過程濕重隨時間關系123456789105 0 5 0 量達11time(h)圖10發(fā)酵過程hEGF表達量隨時間關系M kDa97.266444.329,020.114.3圖11 5 L發(fā)酵罐中SDS分析hEGF的表達情況1:發(fā)酵誘導前，2:發(fā)酵誘導后4 hM: Middle

42、Molecular Weight Protein Markers4討論目前，人們通過基因重組技術(shù)，利用酵母菌，大腸桿菌等都能成功生產(chǎn)hEGF,但就目前而言，相對于其它表達系統(tǒng)來說大腸桿菌表達系統(tǒng)更加適合用于生產(chǎn)。因 為大腸桿菌表達系統(tǒng)有以下優(yōu)勢：（1）人們對大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究 已相當徹底，便于生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)問題，解決問題。（2）盡管大腸桿菌細胞的空間小，但 繁殖能力強，在營養(yǎng)條件充足時，2030min即可繁殖一代，發(fā)酵周期短，而且大規(guī) 模發(fā)酵成本低，具有巨大的生產(chǎn)潛力。（3）表達水平一般較其它表達系統(tǒng)高，某些 外源基因在大腸桿菌中的表達量可達總蛋白的5%30 %，且下游工藝簡單、易于

43、控制。因而用重組大腸桿菌生產(chǎn) hEGF更利于生產(chǎn)的控制及降低生產(chǎn)成本。傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝都是以葡萄糖為單一碳源，但由于葡萄糖被菌體利用后低謝產(chǎn) 生乙酸，乙酸的生成和積累不僅抑制了菌體的生成，而且降低外源蛋白的表達效率， 使得hEGF表達量降低。因而實驗用甘油，葡萄糖和乳糖三種碳源作比較，設計單第 頁 共 23 頁第 頁共23頁因子實驗，實驗結(jié)果得出甘油和乳糖相對葡萄糖更適合用于生產(chǎn)hEGF。以乳糖為碳源的實驗中，由于乳糖本身起誘導作用，因而培養(yǎng)開始后菌體合成 和表達同時進行，這樣優(yōu)點是單位菌體的表達量上升了，缺點是菌總濃度會因此降 低，大腸桿菌在培養(yǎng)時，乳糖啟動乳糖操縱子，進行蛋白質(zhì)的表達，消耗的

44、能量除 了用在菌體合成方面，還用于蛋白質(zhì)表達方面，使大腸桿菌的生物量（菌體）有所 下降，因而在總表達量上，用乳糖為碳源時的優(yōu)缺點需另作研究。在氮源篩選中，發(fā)現(xiàn)用玉米漿作為氮源時，菌體濃度過低甚至不生長。也沒有 發(fā)現(xiàn) hEGF 的表達。原因是玉米漿的酸度過高，大腸桿菌在培養(yǎng)基中難以生長，且 與 hEGF 表達階段 pH 要求的 7.2 左右相差太遠，因而不適用作為生產(chǎn)用氮源。在研究IPTG誘導濃度對hEGF表達量的影響中，發(fā)現(xiàn)所選范圍內(nèi)hEGF表達量 隨誘導濃度的增加而增加，但 1.4 mmol/L 的誘導濃度和 1.0 mmol/L 的誘導濃度對 hEGF 產(chǎn)量的影響相差不大，由于誘導物 IPTG 價格較昂貴，因此生產(chǎn)過程中應盡量 節(jié)省 IPTG 的用量。因此選用濃度較低而效果顯著的 1.0 mmol/L 終濃度作為生產(chǎn)的 最適誘導濃度。在探索誘導時間內(nèi) hGEF 表達量的實驗