分析化學(xué) 高效液相色譜

1、分析化學(xué) 高效液相色譜第1頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一3-1 概 述 HPLC是60年代在GC和經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。 GC柱效高，且能分離、定量，但有些熱穩(wěn)定性差，不易揮發(fā)的組分不能用GC直接分析，人們想到模仿GC，用細(xì)顆粒固定相，薄殼固定液，以增加柱效。 模仿LC用液體作流動(dòng)相，在室溫下進(jìn)行，但阻力太大，液體流動(dòng)相難以通過(guò)，所以又想到加高壓泵，加快流動(dòng)相流速，這樣即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓寬了應(yīng)用范圍，把柱子、高壓泵、檢測(cè)器配成儀器，就形成高效液相色譜儀。 第2頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 HPLC與LC的比較

2、LC HPLC柱徑 1 2cm 2 5mm顆粒 150 200m 5 10 m壓力 常壓 高壓 tR 1 20h 1h內(nèi) n 2 50 105 / 米用途 初步分離 高效分離、高靈敏度定量裝置 非儀器化 精密儀器，自動(dòng)化.智能化 HPLC 優(yōu)點(diǎn)： 柱效高 分析時(shí)間短 可定量 儀器分析第3頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 HPLC與GC的比較 GC HPLC 流動(dòng)相 g l溫度 高溫 室溫組分 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好 不受限制可測(cè)有機(jī)物 20% 75%80% tR 130min 160min靈敏度 10-1210-14g/ml 10-910-11g流出物 不易收集 易收集

3、HPLC 優(yōu)點(diǎn)： 應(yīng)用范圍廣，組分易回收第4頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 GC與 HPLC選擇：小分子熱穩(wěn)定性好GC大分子熱穩(wěn)定性差HPLC tR 短GC優(yōu)點(diǎn)： g 廉價(jià) 靈敏度高第5頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 二.HPLC法的特點(diǎn)： 1. 高效分離 n =105 /米 2. 高速 使用高壓泵，出峰時(shí)間幾分鐘到幾十分鐘 3. 高靈敏度 檢測(cè)下限：10-910-13g（最小檢測(cè)量） 4. 自動(dòng)化程度高（儀器分析、電腦控制、色譜工作站） 5. 應(yīng)用范圍廣 可測(cè)有機(jī)物75%80%一. HPLC法的分類 吸附色譜 l s 離子交換色譜法 尺

4、寸排阻色譜法l l 正向色譜 反向色譜第6頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一二、高效液相色譜法的特點(diǎn) feature of HPLC 特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度 高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。第7頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一分配系數(shù) K=組分在固定相中的濃度 /組分在流動(dòng)相中的濃度 =CS / CM分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實(shí)質(zhì)性原因3-2 影響分離的因素 factors influenced separation第8頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑

5、 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。第9頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。第10頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 2.流速 流速大于0.5 cm/s時(shí), Hu曲線是一段斜率不大的直

6、線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。 3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。第11頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一高效液相色譜儀 由五大部分組成：高壓輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢側(cè)系統(tǒng) 記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 分析流程：流動(dòng)相1 高壓泵 進(jìn)樣器 流動(dòng)相貯液槽 壓力表流動(dòng)相2 微機(jī) 梯度洗 脫裝置 色譜柱餾分收集器 檢測(cè)器第12頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星

7、期一儲(chǔ)液瓶分布器過(guò)濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過(guò)濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器HPLC儀器詳解第13頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一第14頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一第15頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 一. 高壓輸液系統(tǒng) 1. 高壓輸液泵：恒壓泵（流量隨阻力變化重現(xiàn)性差） 恒流泵（多用）：往復(fù)式 注射式 作用：將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。 性能：有足夠的壓力 輸出流量恒定，可調(diào) 輸出壓力平穩(wěn) 泵室體積小 泵體抗腐蝕、耐酸馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵

8、示意圖第16頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 2. 梯度洗脫裝置 作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動(dòng)相極性、離子強(qiáng)度、 PH值、提高分離效率。 低壓梯度洗脫（常壓混合，高壓進(jìn)柱，1個(gè)泵。） 高壓梯度洗脫（高壓混合，高壓進(jìn)柱，2個(gè)泵。） 貯液槽1 貯液槽2 貯液槽1 貯液槽2 梯度洗脫裝置 程序控制 高壓泵1 高壓泵2 混合室 高壓泵 梯度洗脫裝置 進(jìn)柱 進(jìn)柱 低壓梯度洗脫 高壓梯度洗脫不易改變流動(dòng)向配比,自動(dòng)化程度低 隨時(shí)改變流動(dòng)向配比,自動(dòng)化程度高第17頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 二.進(jìn)樣系統(tǒng) 注射進(jìn)樣：裝置

9、簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。 六通閥進(jìn)樣：目前最常用，由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。 圖12-5 六通閥進(jìn)樣示意圖a載樣(樣品進(jìn)入定量管) b倒閥(樣品導(dǎo)入色譜柱) 1定量管 2樣品進(jìn)入口 3流動(dòng)相進(jìn)口 4色譜柱1. 載樣管第18頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱第19頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 三.分離系統(tǒng)：色譜柱 不銹鋼 直型 分析：內(nèi)徑 26mm 長(zhǎng)1030cm 制備：內(nèi)徑 1025mm 長(zhǎng)1550cm 恒溫器：電熱恒溫裝置（室溫150） 恒溫水浴類套（70以

10、下） 作用：保證分析時(shí)溫度恒定，否則對(duì)tR影響較大 第20頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 四. 檢測(cè)系統(tǒng) 1.紫外可見(jiàn)光度檢測(cè)器： 固定波長(zhǎng)：254nm ， 低壓汞燈。 可調(diào)波長(zhǎng)：190800mm， 鎢燈，氘燈。 光電二極管矩陣檢測(cè)器： 190700nm。 石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液第21頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 光電二極管矩陣檢測(cè)器特點(diǎn)： 靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準(zhǔn)確，可掃描得三維流出曲線 紫外檢測(cè)器的應(yīng)用： 對(duì)紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。 紫外檢測(cè)器的特點(diǎn)： 靈敏度高 最小檢測(cè)濃度10-9g/ml 線性

11、范圍寬 對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫 應(yīng)用范圍廣第22頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖第23頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 2. 熒光檢測(cè)器：多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器（濾光片） 熒光分光檢測(cè)器（光柵分光） 氘燈作激發(fā)光源，波長(zhǎng)范圍250600nm 應(yīng)用：組分吸收一定波長(zhǎng)紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強(qiáng)度與濃度成正比。 特點(diǎn)：靈敏度更高 檢測(cè)限10-1210-13g/ml（靈敏度比UV檢測(cè)器高23個(gè)數(shù)量級(jí)） 選擇性好 對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫 所需試樣量

12、少，適于痕量分析 應(yīng)用范圍廣 3、電化學(xué)檢測(cè)器 電導(dǎo)、庫(kù)侖、極譜、安培、電位等檢測(cè)器。第24頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一一、液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph二、液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatograph三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph四、離子色譜ion chromatograph五、離子對(duì)色譜ion-pair chromatograph六、排阻色譜size- exclusion chromatograph七、親和色譜(AC)A

13、ffinity chromatograph3-3 主要分離類型與原理basic principle and main separating types第25頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一一、 液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；第26

14、頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一二、 液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatography 固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配； 流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。第2

15、7頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一三、 離子交換色譜ion-exchange chromatography 固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂； 流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽(yáng)離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第28頁(yè)，

16、共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一四、 離子色譜ion chromatography 離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。 第29頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一五、 離子對(duì)色譜ion pair chromatography 原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配； 陰離子分離：常采用烷

17、基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子； 陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子； 反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X(jué)-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+ X -后；在兩相間分配。第30頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一六、 排阻色譜size- exclusion chromatography 固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最

18、快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 第31頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一七、 親和色譜(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第32頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一一、液相色譜固定相stationa

19、ry phase of HPLC二、液相色譜流動(dòng)相 mobile phase of HPLC3-4 液相色譜的固定相與流動(dòng)相stationary phase and mobile phase of HPLC第33頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一一、液相色譜固定相 stationary phases of LC 1. 液-液分配及離子對(duì)分離固定相 （1）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見(jiàn)； 現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料； （2）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體） 3040m的

20、玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；第34頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一（3）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN第35頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊； 耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性

21、好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫； 存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主； 第36頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 2.液-固吸附分離固定相 種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：510 m； 第37頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一3.離子交換色譜分離固定相 結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹(shù)脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹(shù)脂；（2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)） 樹(shù)脂類別：（1）

22、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）第38頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一 4. 空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。第39頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一二、液相色譜的流

23、動(dòng)相 mobile phases of LC 1. 流動(dòng)相特性 （1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 第40頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一2. 流動(dòng)相類別 按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、

24、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第41頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一3. 流動(dòng)相選擇 在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)第42頁(yè)，共48頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)32分，星期一4. 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免