大二下生化課件新dna

1、動物基因組DNA、總RNA的提取及含量測定呂 明，張作明吉林大學生命科學學院2014年生物化學實驗II目的要求 學習和掌握從動物組織中提取核酸的原理和操作技術；了解提取DNA/RNA的幾種方法，原理和優(yōu)缺點；學習測定DNA/RNA含量的基本原理及具體方法。理論基礎核酸是遺傳信息的攜帶者，是生命的最基本物質(zhì)，它和蛋白質(zhì)是構成生物體的主要成分；按化學組成可以將核酸分成兩大類： 含脫氧核糖核酸（DNA）； 含核糖核酸（RNA）； 在生物體中核酸以結合成核蛋白的形式存在，但核酸極不穩(wěn)定，在較劇烈的物理、化學因素和酶的作用下都很易降解。核酸的分布：細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、游離。核酸分離、純化原則

2、在生物體中核酸以結合成核蛋白的形式存在，但核酸極不穩(wěn)定，在較劇烈的物理、化學因素和酶的作用下都很易降解。 保持核酸分子一級結構的完整性 意義：遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的一級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。 排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染 ； 無雜核酸分子的污染（如純化DNA分子時應去除RNA分子）。核酸的測定方法核酸是由糖（核糖和脫氧核糖）、磷酸以及含氮堿基（嘌呤、嘧啶）所組成的。測定核酸制品中的糖、磷、氮的含量即可計算出核酸的含量及純度。糖：地衣酚法，二苯胺法磷酸：鉬藍反應堿基：微量凱氏定氮法，紫外吸收法，熱變性法（GC含量測定），HPLC法。地

3、衣酚 (orcinol)，又稱“3，5-二羥基甲苯”、“5-甲基間苯二酚”、“苔黑酚”?；瘜W式C7H8O2.H2O。原理：當RNA與濃鹽酸共熱時，即可發(fā)生降解，形成核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與地衣酚反應，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復合物，反應在670nm處有最大吸收峰，RNA濃度在20 200g/mL范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。干擾：與戊糖均有反應，DNA及其它干擾物也能給出類似顏色，故測定前盡量去除。地衣酚試劑要使用前配制。地衣酚法測定RNA含量（本次試驗）RNA 含量測定 管號試劑 123456789RNA標準溶液（100ug/ml）00.61.21.82.43.0000蒸

4、餾水3.02.41.81.20.602.92.82.7地衣酚試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.0RNA待測液0.10.20.3搖勻，100攝氏度水浴保溫25min，670nm處測量OD值OD670RNA含量（ug）060120180240300二苯胺法測定DNA含量-本實驗原理：DNA分子中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成-羥基-酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍色化合物（max=595nm）。DNA在40 400微克范圍內(nèi)，光吸收值與DNA的濃度成正比。乙醛可增加二苯胺法測定DNA的發(fā)色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯糖的干擾，能顯著提高測定的靈敏度。樣品中含有少量RNA并不影

5、響測定，但因蛋白質(zhì)、多種糖類及其衍生物、芳香醛、羥基醛等能與二苯胺反應形成有色化合物，故能干擾DNA定理。DNA含量測定1、DNA標準曲線的制定 6支試管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mL DNA標準溶液。添加蒸餾水，使之都成為2mL。然后各加入4mL 二苯胺試劑，混勻。于60恒溫水浴中保溫1h，冷卻后于595nm處進行比色測定。以DNA量為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。 2、制品的測定 取2支試管，各加0.3ml、0.6ml 待測液，加水至2mL（內(nèi)含DNA應在標準曲線的可范圍之內(nèi)）和4mL 二苯胺試劑，搖勻。其余操作同標準曲線的制作。 3、根據(jù)測得的

6、光吸收值，從標準曲線待測上查出相應該光吸收值DNA的含量. 管號試劑 123456789DNA標準溶液（200ug/ml）00.40.81.01.21.62.000蒸餾水2.01.61.21.00.80.401.71.4二苯胺試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待測液00000000.30.6搖勻，60攝氏度水浴保溫60min，595nm處測量OD值OD595DNA含量（ug）080160200240320400DNA 含量測定磷的測定-鉬藍反應RNA含磷質(zhì)量分數(shù)為9.0%；DNA含磷質(zhì)量分數(shù)為9.2%，故測得磷的量，即可求得核酸量。 生物有機磷材料中有時含有無機磷

7、雜質(zhì)，故用定磷法來測定該有機磷物質(zhì)的量時，必須分別測定該樣品的總磷量，即樣品經(jīng)過消化以后所測得的含磷量，以及該樣品的無機磷含量，即樣品未經(jīng)消化直接測得的含磷量。將總磷量減去無機磷才是該有機磷物質(zhì)的含磷量。 原理：無機磷在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應生成磷鉬酸鹽絡合物。用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡合物被還原生成鉬藍，在660nm處有最大光吸收峰。在一定濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與磷含量成正比關系。 紫外吸收法測定核酸的含量及純度嘌呤和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)決定了其具有吸收紫外光的特性，其吸收峰為260 nmDNA: 0.020 ug-1mlRNA: 0.022 ug-1mlDNA: 26

8、0/280=1.8RNA: 260/280=2.0260/280比值與pH有關，在酸性條件下，比值降低0.2-0.3，堿性條件下，增加0.2-0.3與堿基的組成相關。 將樣品配制成含5 50g/mL核酸的溶液，于紫外分光光度計上測定260nm吸收值（使用石英比色杯），計算核酸濃度： 核酸濃度（g/mL）=式中：O.D260為260nm波長處吸收值；L為比色杯的厚度；E260nm為每毫升溶液內(nèi)含1微克核酸的光吸收值，DNA為0.020，RNA為0.022； 上述樣品于于紫外分光光度計上測定280nm吸收值。核酸純度： O.D260/ O.D280 稀釋倍數(shù)紫外吸收法測定核酸濃度與純度-選作DNA

9、堿基比例的測定-測“GC比” (G+C ) mol% = （G+C ）/（A+T+ G+C ） 100% 分類學上，用G+C占全部堿基的克分子百分數(shù)來表示各類生物的DNA堿基組成特征。 DNA堿基組成是各種生物的一個穩(wěn)定特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。熱變性法浮力密度法高效液相色譜法注意：在低溫下進行操作；減少物理因素對核酸的機械剪切力；防止過酸、過堿引起核酸降解，控制pH值范圍（pH值5-9），并要保持一定離子強度；防止核酸的生物降解； 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。因此，所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑，

10、如檸檬酸鹽、氟化物、乙二胺四乙酸鹽（EDTA）。 進行核酸分離時最好新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應將材料貯存于液氮中或-70冰箱中。1、RNA的提取與測定RNA廣泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各種動物組織中。常見方法（依據(jù)RNA的種類和來源）： 苯酚法（實驗室最常用的方法） 去污劑法 鹽酸胍法苯酚法：組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被苯酚飽 和的水相中， DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮狀沉淀析出。優(yōu)點：較好除去DNA和蛋白質(zhì)，且獲得生物活性的RNA。工業(yè)提取RNA的方法酵母細胞富含RNA，是工業(yè)上提取RNA的主要原料。工業(yè)上制

11、備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的濃鹽法或稀堿法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝較簡單。濃鹽法：使用10氯化鈉的溶液，同時在90攝氏度熱處理3-4小時，以改變細胞壁的通透性，使核酸從細胞內(nèi)釋放出來。經(jīng)冷卻，離心后上清液用乙醇沉淀RNA。稀堿法：使用0.2氫氧化鈉裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌體，上清液用乙醇沉淀RNA，或調(diào)體系pH值至RNA的等電點PI 2.5 ，沉淀目的樣品。工業(yè)提取RNA的方法原理：動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/L氯化鈉），但在0.14mol/L氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核

12、蛋白（RNP）則在0.14mol/L氯化鈉中溶解度最大，利用這一性質(zhì)可將其分開。方法：先用組織搗碎機將動物肝臟制成組織勻漿，再用0.14mol/L 氯化鈉溶液把細胞中的 RNP 提取出來，最后用酚將RNA和蛋白質(zhì)分開。本實驗提取RNA的原理及方法RNA 提取勻漿：稱取（3克？）牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化鈉溶液10000r/min左右勻漿1分鐘左右；離心：勻漿后4攝氏度下，溶液離心8000 r/min（RCF？）離心7分鐘，量取上清液（體積？），沉淀物留做提取DNA（質(zhì)量？）；除雜質(zhì)：于上清液中加入等體積80苯酚溶液（操作注意），攪拌充分混合10-15分鐘，置冰箱冷卻靜止10-

13、15分鐘，離心取含有RNA上層水相（顏色？），棄下層酚相（顏色？）（操作注意）；沉淀RNA：取上層水相含RNA溶液（體積？），加入2倍體積95冷乙醇，攪拌（操作注意），充分混合，置冰箱中冷卻(約10-15分鐘)，至出現(xiàn)白色絮狀物RNA，8000r/min 離心7分鐘，取沉淀物；溶解：用少量去離子水（約2毫升）溶解沉淀物，用以測定其含量。試劑和器材材料：牛肝試劑：0.14mol/L 氯化鈉標準RNA溶液：100g/mL地衣酚（3,5-二羥基甲苯）試劑 （現(xiàn)用現(xiàn)配）80苯酚溶液95乙醇器材：組織搗碎機、離心機、分光光度計、燒杯、量筒等思考題RNA 提取方法有幾種？有什么優(yōu)缺點？RNA 提取過程中應

14、注意什么？DNA的提取及含量測定在動植物中，小牛胸腺、動物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%10%。本實驗：將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質(zhì)分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)，也可重復該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法變性劑法：用SDS等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白質(zhì)和DNA，分層、離心。因蛋白變性，抑制了核酸酶活性，并且操作過程比較緩和

15、，可以得到較好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白，使乳化，離心除蛋白，DNA在上層水相，用乙醇沉淀上層，可將DNA沉淀出來。DNA的提取溶解：將離心后除去RNA的沉淀(質(zhì)量？)，用30ml生理鹽水溶解，充分攪拌后，勻漿一次。加4毫升10SDS溶液，使溶液的SDS濃度達到1左右，邊加邊攪拌(溶液變得粘稠并略透明)，放置60 水浴保溫10分鐘（不停攪拌），冷卻。加固體氯化鈉（質(zhì)量?），使溶液氯化鈉濃度達到1mol/L，充分攪拌10分鐘（體積？）；除雜質(zhì)：加等體積氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩10分鐘， 8000 r/min離心7分鐘，取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管）（現(xiàn)象？

16、），加同體積的氯仿-異戊醇混合液，重復上次操作（現(xiàn)象？）。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止；沉淀：準確量取上清液體積， (1/10體積3mol/L NaAC溶液), 加2倍體積95冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現(xiàn)，約10-15分鐘，離心8000 r/min離心7分鐘，得白色沉淀（質(zhì)量？）；溶解：將沉淀物用0.1mol/L NaOH約10毫升溶解。試劑和器材試劑：生理鹽水10SDS氯化鈉95乙醇氯仿-異戊醇混合液DNA標準溶液：用0.01mol/L NaOH配成200g/mL溶液二苯胺試劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）器材：恒溫水浴、分光光度計、移液管等思考題二苯胺法測定DNA，為什么加乙醛，作用是什

17、么？除雜質(zhì)常用那些方法？DNA濃度測定與RNA濃度測定實驗中，核酸樣品分別用什么溶解？顯色反應時，標準曲線組各樣品的pH值是否相同？按照實驗操作流程圖，說明每一步操作的實驗目的、現(xiàn)象、原理和進一步操作的依據(jù)。工 藝 圖3g肝臟 + 20mL0.14mol/L 氯化鈉 勻漿, 1min 離心 8000r/min, 7min 等體積80苯酚攪拌10-20min，冰箱靜置30min8000rn/min，7min上清RNA、多糖沉淀DNA、蛋白加2倍體積95冷乙醇冰箱至出現(xiàn)白色沉淀離心沉 淀離心冰箱至出現(xiàn)白色沉淀加2倍體積95冷乙醇等體積氯仿/異戊醇，震蕩10min/離心加氯化鈉至1mol/L，攪拌10min4ml 10SDS，60，10min30ml生理鹽水溶解上 清DNARNA注意事項RNA最終用2ml去離子水溶解，加樣量不變；DNA測定，加樣量改為0.3ml、0.6ml組織搗碎機的使用；苯酚、氯仿加入速度、有腐蝕性；沉淀和上清避免互相污染；移液管的使用；提取溫度、冷卻時間；二苯胺反應物及時清