單克隆抗體制備流程

1、單克隆抗體制備流程Preparation of monoclonal antibodies第1頁單克隆抗體介紹單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體應(yīng)用01020304制備流程目錄第2頁01單克隆抗體介紹第3頁1.1 抗原（antigen）定義： 能夠刺激機體產(chǎn)生(特異性)免疫應(yīng)答，并能與抗體和致敏淋巴細胞結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)(特異性反應(yīng))物質(zhì)。類型（起源）：異種抗原：病原微生物、類毒素等不一樣種族之間抗原；同種異型抗原：存在于同一個族不一樣個體之間抗原，如 ABO 血型抗原、Rh抗原,、MHC等；本身抗原：本身成份，分為隱蔽本身抗原、改變本身抗原等，如眼晶狀體蛋白等；異嗜性抗原：又稱 Forssman 抗原

2、，存在于不一樣物種間表面無種屬特異性共同抗原，可存在于動物、植物、微生物及人類中，如溶血性鏈球菌于人心內(nèi)膜或腎小球基底膜所含有共同抗原就是異嗜性抗原。 在單克隆抗體制備中： 通常選取每只小鼠/大鼠每次注射 1050ug 重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特 異性單克隆抗體。第4頁1.2 抗體（antibody）定義： 由效應(yīng)B細胞分泌，用來判別與中和抗原大型 Y 形蛋白質(zhì)，僅在脊椎動物血液等體液中及其 B 細胞細胞膜表面發(fā)覺。類型（按理化性質(zhì)和生物學(xué)功效）：IgM：免疫應(yīng)答中首先分泌抗體。與抗原結(jié)合后開啟補體級聯(lián)反應(yīng)。它們還把入侵者相互連接起來，聚成一堆便于巨噬細胞吞噬；IgG：激活

3、補體（輔助和補充特異性抗體），中和各種毒素。IgG連續(xù)時間長，是唯一能在母親妊娠期穿過胎盤保護胎兒抗體。他們還從乳腺分泌進入初乳，使新生兒得到保護；IgA：進入身體黏膜表面，包含呼吸、消化、生殖等管道黏膜，中和感染因子。還能夠經(jīng)過母乳初乳把這種抗體輸送到新生兒消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最為主要一類抗體；IgE：抗體尾部與嗜堿細胞、肥大細胞細胞膜結(jié)合。當抗體與抗原結(jié)合后，嗜堿細胞與肥大細胞釋放組織胺一類物質(zhì)促進炎癥發(fā)展。這也是引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)抗體；IgD：作用還不清楚。主要出現(xiàn)在成熟 B 淋巴細胞表面上，可能與 B 細胞分化相關(guān)。 在單克隆抗體制備中：通常是產(chǎn)生 IgG 型抗體第5頁1

4、.3 特異性免疫-體液免疫第6頁1.4 單克隆抗體定義： 由單一 B 細胞克隆產(chǎn)生高度均一、僅針對某一特定抗原表位抗體。類型（起源）：鼠源性單克隆抗體：將免疫接種過小鼠 B 細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出既能無限增殖又能分泌抗體雜交瘤細胞，進而進行篩選、抗體制備和抗體純化。嵌合性單克隆抗體：用人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)，保留鼠單抗可變區(qū)序列，形成一個人-鼠雜合抗體?？纱蠓档彤愒纯贵w免疫原性，卻幾乎保持親本鼠單抗全部特異性和親和力。人源化單克隆抗體：利用現(xiàn)有已詳細分析過小鼠抗體，取其與抗原直接接觸抗體片段（互補決定區(qū)，CDR）與人抗體框架嫁接，經(jīng)親和力重塑，可維持特異性和大部分親和力，同時幾乎去除免

5、疫原性和毒副作用。全人源單克隆抗體：抗體可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體制備相關(guān)技術(shù)有：人雜交瘤技術(shù)、EBV 轉(zhuǎn)化 B 淋巴細胞技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)（phage display）、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)（transgenic mouse）和單個B細胞抗體制備技術(shù)等。第7頁1.5 雜交瘤技術(shù)雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)： 在細胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上，將含有分泌特異性抗體能力致敏B細胞和含有沒有限繁殖能力骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特征單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一個抗原表位特異性抗體即單克隆抗體。第8頁02制備流程第9頁 試驗原理第10頁2.1

6、抗原準備2.1.1 分子克隆與蛋白純化提取目基因：在數(shù)據(jù)庫中查找目基因序列，設(shè)計引物，PCR擴增目基因構(gòu)建載體：將擴增目標基因構(gòu)建到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入宿主中誘導(dǎo)表示：經(jīng)過化學(xué)試劑誘導(dǎo)宿主大量表示蛋白蛋白純化：用特定方式將目標蛋白提取出來并純化第11頁2.2 動物免疫2.2.1 動物免疫與效價測定抗原乳化：將抗原與佐劑混合，在乳化器上進行乳化腹腔注射：將乳化好抗原經(jīng)過腹腔注射進入小鼠體內(nèi)，兩周后再注射一次測定效價：尾部取血后分離血清，經(jīng)過ELISA法測定小鼠血清效價加強免疫：融合前三天進行加強免疫，不加佐劑，只注射抗原第12頁2.3 細胞融合2.3.1 細胞融合與培養(yǎng)骨髓瘤細胞培養(yǎng)：提前復(fù)蘇并擴大培養(yǎng)

7、SP2/0細胞取脾臟：處死小鼠，取其脾臟并研磨制成細胞懸液細胞融合：將骨髓瘤細胞與脾細胞按百分比混合后，加入PEG促進融合選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)：融合好細胞移至96孔板中培養(yǎng)，一段時間后，未融合成功細胞死亡第13頁2.3 細胞融合2.3.2 細胞篩選效價測定：取細胞上清液，ELISA法測定抗體效價細胞擴培：將效價高孔轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)擴大培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)：將融合細胞制成懸液移入96孔板中，盡可能確保每孔只含一個細胞復(fù)篩：ELISA+免疫組化雙重篩選，挑選效價高、定位清楚克隆擴培第14頁2.4 亞型判定2.4.1 亞型判定 采取ELISA 法分別對單克隆抗體輕鏈和重鏈亞型進行判定。 輕鏈：分為(kappa)和(lambda) 重鏈： IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA/x/page/b0506iyb6b9.html/v/XMjI4NzE5NjE0OA=.html/v_show/id_XMTU3OTUzOTI0.html第15頁03單克隆抗體生產(chǎn)第16頁3.1 生產(chǎn)方式：體內(nèi)/體外第17頁3.2 抗體純化親和層析法純化抗體：第18頁04單克隆抗體應(yīng)用第19頁4.1 單克隆抗體應(yīng)用檢驗醫(yī)學(xué)診療試劑病原微生物腫瘤檢測細胞因子檢測免疫抑制劑治療本身免疫疾病和抗器官移