基因工程復(fù)習(xí)資料

1、第一章基因工程概述一、名詞解釋基因、基因操作、基因工程、重組DNA技術(shù)基因：是編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的一段具有遺傳效應(yīng)的DNA片段，是控制生物性狀的基本遺傳單位?；虿僮鳎菏侵笇?duì)基因進(jìn)行分離、分析、改造、重組、轉(zhuǎn)移、檢測(cè)和表達(dá)等操作的簡(jiǎn)稱?；蚬こ蹋簩Ｖ笧閷?shí)踐應(yīng)用而進(jìn)行的基因重組事件，具體是指通過基因操作來定向改變或修飾生物體，并具有明確應(yīng)用目的的活動(dòng)。重組DNA技術(shù)：又稱基因工程。二、思考題1、簡(jiǎn)述基因工程操作的基本步驟。（1）獲得目的基因（2）目的基因與克隆載體連接，形成重組子（3）將重組子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子（4）轉(zhuǎn)化子檢測(cè)和篩選（5）目的基因在受體中被表達(dá)，獲得所

2、需的遺傳性狀或產(chǎn)物2、簡(jiǎn)述基因工程操作的理論依據(jù)。（1）基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可轉(zhuǎn)移的（4）多肽與基因之間有對(duì)應(yīng)關(guān)系（5）遺傳密碼通用（6）基因可以復(fù)制遺傳3、簡(jiǎn)述基因工程誕生理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。理論三大發(fā)現(xiàn)：遺傳物質(zhì)是DNA（基因） DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制 中心法則和氨基酸技術(shù)三大發(fā)明：限制性核酸內(nèi)切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶第二章基因工程的工具酶一、名詞解釋限制性內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶限制性內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部某種特殊的核苷酸序列，并使每個(gè)核酸鏈上特定部位相鄰的兩個(gè)核苷

3、酸之間的磷酸二酯鍵斷開的一類核酸內(nèi)切酶。同裂酶：指來源不同，但識(shí)別相同靶序列，切割產(chǎn)生不同或相同末端的限制性內(nèi)切酶。即不同來源的限制性內(nèi)切酶可切割相同的序列。同尾酶：指來源各異，識(shí)別靶序列各不相同，但切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。同尾酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進(jìn)行互補(bǔ)連接。DNA連接酶：催化DNA片段兩側(cè)（相鄰）核苷酸的3羥基和5磷酸基之間形成磷酸二酯鍵，使斷開的DNA連接起來的酶。DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶二、思考題1、簡(jiǎn)述限制性內(nèi)切酶命名的基本原則。第一個(gè)字母：取宿主屬名首字母，大寫斜體。第二、三個(gè)字母：取宿主種名前兩個(gè)字母，小寫斜體第四個(gè)字母：為宿

4、主的株號(hào)，正體第五個(gè)字母：發(fā)現(xiàn)順序號(hào)，大寫羅馬字體，正體2、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素主要有哪些？（1）DNA樣品的純度（2）DNA樣品的甲基化程度（3）DNA的分子結(jié)構(gòu)（4）反應(yīng)緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端ph值等（5）酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間3、影響連接反應(yīng)效率的因素主要有哪些？（1）DNA的濃度（2）反應(yīng)溫度與時(shí)長（3）ATP濃度（4）連接酶濃度4、大腸桿菌DNA聚合酶有哪些活性？分別簡(jiǎn)要說明其主要用途。53聚合酶活性：合成雙鏈DNA或c DNA的第二鏈，補(bǔ)平5突出端53外切酶活性：形成3突出端，切平5突出端，降解RNA35外切酶活性：形成5突出端，切平3突出端，降

5、解單鏈DNA5、簡(jiǎn)述切口平移法標(biāo)記DNA的原理。答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I處理雙鏈DNA，隨機(jī)產(chǎn)生少量切口；然后，利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53外切酶活性在切口處向3端平移去除核苷酸，同時(shí)，其53聚合酶活性則將切口作為引物沿53方向催化DNA合成；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5端核苷酸不斷去除，3端核苷酸不斷摻入，導(dǎo)致切口沿著DNA合成方向移動(dòng)，即切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入標(biāo)記dNTP，則這些標(biāo)記dNTP將取代原有的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA分子。6、簡(jiǎn)述交換（置換）法標(biāo)記DNA的原理。答：反應(yīng)體系中只有一種標(biāo)記的dNTP存在時(shí)，可利用大腸桿菌DNA聚合酶I或T4/T7

6、 DNA聚合酶的35外切酶活性從3端降解DNA，當(dāng)露出與該標(biāo)記dNTP互補(bǔ)的堿基時(shí)，上述酶的53聚合酶活性則催化該位置發(fā)生合成反應(yīng)，用標(biāo)記的dNTP置換原來的核苷酸殘基，產(chǎn)生3端標(biāo)記的DNA。第三章基因工程的載體一、名詞解釋載體、質(zhì)粒、噬菌體、噬菌體溶菌周期、噬菌體溶原周期、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、整合載體、表達(dá)標(biāo)簽載體：在基因工程操作中，能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子質(zhì)粒：獨(dú)立于染色體外的能夠自主復(fù)制的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子噬菌體：是感染細(xì)菌，真菌，藻類，放線菌，螺旋菌等微生物的病毒的總稱噬菌體溶菌周期：感染宿主細(xì)胞后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆

7、粒，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解，釋放出大量子代噬菌體。噬菌體溶源周期：感染宿主細(xì)胞后，將自己的DNA整合到宿主的基因組中，與宿主染色體一起復(fù)制，并隨宿主細(xì)胞的分裂而傳遞給子代?？寺≥d體：具有復(fù)制區(qū)（包含復(fù)制起點(diǎn)），多克隆位點(diǎn)和選擇標(biāo)記等基本元件，用于擴(kuò)增和保存DNA片段的載體。表達(dá)載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加按表達(dá)元件（如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，終止子等），用于表達(dá)目的基因的載體。穿梭載體：能夠在兩類不同的宿主中復(fù)制，增殖和選擇的載體。整合載體：將某個(gè)基因或某些基因插入到宿主的染色體中的載體。表達(dá)標(biāo)簽：用作分離的載體蛋白。二、思考題1、簡(jiǎn)述克隆載體具備的基本條件。（1）具有復(fù)制區(qū)（含復(fù)制起點(diǎn)）

8、，在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠自主復(fù)制（ori）（2）具有多克隆位點(diǎn)，便于插入外源DNA（MCS）（3）具有選擇標(biāo)記，便于篩選（4）分子量小，拷貝數(shù)多（5）易從宿主細(xì)胞中分離純化2、以大腸桿菌為例，解釋利用互補(bǔ)篩選重組質(zhì)粒的原理。答：在IPTG的誘導(dǎo)作用下，lacZ基因編碼產(chǎn)生-半乳糖苷酶，可以分解Xgal產(chǎn)生藍(lán)色的產(chǎn)物。當(dāng)大腸桿菌宿主細(xì)胞中僅攜帶一個(gè)lacZ M15基因，編碼產(chǎn)生無活性的-半乳糖苷酶C端肽段，而質(zhì)粒載體上含有一個(gè)lacZ基因，編碼產(chǎn)生無活性的-半乳糖苷酶N端肽段（即-肽）時(shí)，兩者可以在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合形成有活性的-半乳糖苷酶，從而在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌斑，稱為-互補(bǔ)作用

9、。而當(dāng)把外源DNA片段插入到質(zhì)粒載體的lacZ基因中獲得的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致-互補(bǔ)功能喪失，從而在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上形成白色菌斑。3、解釋TA克隆的基本原理。大部分DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3末端添加一個(gè)“A”堿基，根據(jù)這一特點(diǎn)，人為的在線性化平末端質(zhì)粒載體每條鏈的3末端添加一個(gè)“T”堿基，使它們之間可以堿基互補(bǔ)配對(duì)，在DNA連接酶的催化下，連接形成含有目的基因的重組DNA分子，即TA克隆。4、簡(jiǎn)述利用質(zhì)粒載體進(jìn)行基因克隆的基本步驟。（1）目的基因克?。ㄔO(shè)計(jì)引物PCR）（2）質(zhì)粒載體提?。〒u菌提取質(zhì)粒）（3）目的基因和質(zhì)粒載體酶切

10、（選擇內(nèi)切酶酶切）（4）目的基因和質(zhì)粒載體連接（5）連接片段轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)）（6）陽性單克隆菌篩選（挑菌PCR檢測(cè)送測(cè)序）5、簡(jiǎn)單描述噬菌體的溶原狀態(tài)和裂解生長，及其在構(gòu)建載體中的作用。答：噬菌體溶原周期是指感染宿主細(xì)胞后，將自己的DNA整合到宿主的基因組中，與宿主染色體一起復(fù)制，并隨宿主細(xì)胞的分裂而傳遞給子代。利用噬菌體DNA定點(diǎn)整合到宿主基因組DNA上的重組原理建立Gateway重組技術(shù)用于載體的構(gòu)建。噬菌體溶菌周期是指感染宿主細(xì)胞后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制，并合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。利用噬菌體作為載體，在構(gòu)建載體時(shí)，

11、外源DNA片段可插入或替換控制溶原狀態(tài)的基因區(qū)段。6、簡(jiǎn)述利用噬菌體載體進(jìn)行基因克隆的基本步驟。（1）目的基因克隆（外源DNA片段）（2）噬菌體載體的提?。?）外源DNA片段與載體的酶切（4）外源DNA片段與載體的連接（5）重組噬菌體載體的體外包裝（6）包裝噬菌體感染受體細(xì)胞（7）陽性重組子篩選7、以大腸桿菌為例，說明表達(dá)載體比克隆載體多了哪些功能元件？各有什么生物學(xué)功能？答：表達(dá)載體是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加了啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子等表達(dá)元件。啟動(dòng)子：DNA上與RNA聚合酶結(jié)合的一段序列，啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄，包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄生成的mRNA上與核糖體結(jié)合的位點(diǎn)，

12、啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯。終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，終止轉(zhuǎn)錄。8、什么是表達(dá)標(biāo)簽，有何作用？列舉2類用作表達(dá)標(biāo)簽的蛋白。答：表達(dá)標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或蛋白，用于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤、分離和純化等。例如，純化標(biāo)簽（GST、HIS、FLAG）、報(bào)告標(biāo)簽（GUS、GFP、RFP）、定位標(biāo)簽（信號(hào)肽、核定位信號(hào)）。第四章核酸操作的基本技術(shù)一、名詞解釋瓊脂糖凝膠電泳：是以瓊脂糖為介質(zhì)，帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向與其電荷相反的電極水平移動(dòng)聚丙烯酰胺凝膠電泳：是以聚丙烯酰胺為介質(zhì)，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向與其電荷相反的電極垂直移動(dòng)。Southern雜交;D

13、NA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象是DNA，探針為DNA。Nouthern雜交：將瓊脂糖凝膠上的RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上從而能夠與互補(bǔ)二、思考題1、簡(jiǎn)述CTAB法提取DNA的原理。答：CTAB是一種陽離子去垢劑，可以溶解細(xì)胞膜，使DNA釋放出來，并形成溶于高鹽溶液的CTAB-核酸復(fù)合物。通過有機(jī)溶劑（酚/氯仿/異戊醇）抽提，去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類等雜質(zhì)。然后加入乙醇或異丙醇破壞DNA的水化層，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗滌DNA沉淀，去除鹽等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中利用EDTA螯合Mg2+來抑制DNase對(duì)DNA的降解作用。2、簡(jiǎn)述SDS法

14、提取DNA的原理。答：SDS是一種陰離子去垢劑，可以溶解細(xì)胞膜，使DNA釋放出來，還可以變性蛋白質(zhì)，并形成溶于有機(jī)溶劑的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。DNA溶于水，通過有機(jī)溶劑（酚/氯仿/異戊醇）抽提，可以去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類等雜質(zhì)。然后加入乙醇或異丙醇破壞DNA的水化層，使DNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗滌DNA沉淀，去除鹽等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中利用EDTA螯合Mg2+來抑制DNase對(duì)DNA的降解作用。3、簡(jiǎn)述堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理。答：質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外的、能夠自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，是一種共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。強(qiáng)堿性條件下，質(zhì)粒DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而

15、變性，但兩條環(huán)狀的互補(bǔ)鏈不完全分離；當(dāng)酸中和至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配對(duì)重新恢復(fù)原來構(gòu)型，溶于水中。強(qiáng)堿性條件下，染色體DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，兩條線性互補(bǔ)鏈完全分離；當(dāng)酸中和至中性時(shí)，染色體DNA不能復(fù)性，而與破裂的細(xì)胞壁，蛋白質(zhì)相互纏連成不溶物，經(jīng)離心除去。4、簡(jiǎn)述瓊脂糖凝膠電泳中DNA遷移的原理。答：遷移方向電荷效應(yīng)：DNA分子是兩性電解質(zhì)，在堿性（pH8.0）緩沖液中，磷酸基團(tuán)解離，帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。遷移速率分子篩效應(yīng)：DNA分子遷移速率同其與凝膠介質(zhì)間的摩擦系數(shù)呈反比，同一介質(zhì)中，摩擦系數(shù)主要與DNA分子的大小和構(gòu)型相關(guān)。5、比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰

16、胺凝膠電泳用途的異同。答：瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠電泳分辨率低，分辨DNA片段大小為100-50000bp，聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高，分辨DNA片段大小為1-1000bp。瓊脂糖凝膠電泳采用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠的制備和電泳操作比瓊脂糖的困難。6、簡(jiǎn)述紫外分光光度法檢測(cè)核酸濃度和純度的原理。答：核酸在紫外線260nm波長處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm波長處有最大吸收峰，鹽和其它雜質(zhì)的吸收峰則聚集在230nm波長處，通過A260/A280和A260/A230的比

17、值可以判定出核酸的純度。1OD260分別對(duì)應(yīng)50g/mL的dsDNA，33g/mL的ssDNA，40g/mL的ssRNA含量，通過260nm處的吸光值可以推定處核酸的濃度。7、簡(jiǎn)述Trizol法提取RNA的原理。答：Trizol試劑是一種直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，其主要成分為異硫氰酸胍和酸性苯酚。其中異硫氰酸胍可以裂解細(xì)胞，解離核糖體，而苯酚可以變性蛋白質(zhì)，從而使核酸與蛋白質(zhì)分離，酸性條件下，DNA在酚相，RNA在水相，兩者就分開了。然后加入氯仿抽提，可以去除蛋白質(zhì)、脂類、酚類等雜質(zhì)，離心后，樣品分為水樣層和有機(jī)層，其中RNA在水相中，蛋白

18、質(zhì)和DNA留在有機(jī)相中。收集水樣層，加入異丙醇破壞RNA的水化膜，使RNA失水而聚合沉淀。最后用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，去除鹽、多糖等雜質(zhì)。8、印記分子雜交主要有哪些類型，并分別說明其用途。答：Southern雜交：檢測(cè)DNANorthern雜交：檢測(cè)RNAWestern雜交：檢測(cè)蛋白質(zhì)菌落雜交或噬菌斑雜交：檢測(cè)陽性克隆基因芯片：檢測(cè)mRNA的含量和結(jié)構(gòu)，重測(cè)序，SNP檢測(cè)。第五章目的基因的獲取一、名詞解釋目的基因:準(zhǔn)備要分離，改造，擴(kuò)增或表達(dá)的基因?；蚪MDNA文庫:是指將某種生物的整個(gè)基因組DNA進(jìn)行酶切片段化，然后與特定載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞產(chǎn)生的克隆載體，包含全基因組DNA上的所有

19、編碼區(qū)與非編碼區(qū)序列。cDNA文庫:是指將某種生物的總mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后與特定載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞產(chǎn)生的克隆載體。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：是一種體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，可以選擇性的擴(kuò)增DNA某個(gè)區(qū)域的序列。Tm值：是指溶液中有半數(shù)的DNA分子解鏈為單鏈時(shí)的溫度。二、思考題1、簡(jiǎn)述基因組DNA文庫構(gòu)建的基本步驟。（1）載體的選擇和制備（2）基因組DNA的提?。?）DNA片段的制備（酶切）（4）載體與DNA片段的連接（5）重組DNA分子轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞（6）重組克隆的篩選和保存2、簡(jiǎn)述cDNA文庫構(gòu)建的基本步驟。（1）載體的選擇與制備（2）細(xì)胞總RNA的提取（3）mRNA的分

20、離（4）雙鏈cDNA的合成（5）雙鏈cDNA與載體的連接（直接平末端或添加帶有限制性切酶位點(diǎn)接頭后酶切連接）（6）重組DNA分子轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞（7）重組克隆的篩選與保存3、簡(jiǎn)述自身引導(dǎo)法合成第二鏈cDNA的基本過程。自身引導(dǎo)合成第二鏈cDNA時(shí),首先用氫氧化鈉水解雜合雙鏈中的mRNA鏈,解離的第一鏈cDNA的3端形成一個(gè)發(fā)夾環(huán),作為合成第二鏈cDNA的引物,在Klenow DNA聚合酶的作用下合成第二鏈cDNA,再利用S1核酸酶切掉發(fā)夾環(huán)4、簡(jiǎn)述置換法合成第二鏈cDNA的基本過程。首先RNaseH在雜合雙鏈的mRNA鏈上切出很多切口,作為一系列RNA引物,在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合

21、成多個(gè)第二鏈cDNA的片段,再利用DNA連接酶連成完整的第二鏈cDNA5、簡(jiǎn)述引物-銜接頭法合成第二鏈cDNA的基本過程。引物-銜接頭合成法合成第二鏈cDNA是由引導(dǎo)合成法改進(jìn)而來的,第一鏈cDNA合成后,直接利用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA的3端加上一段poly(dC)尾巴,然后以帶接頭序列的poly(dG)短核苷酸鏈作為引物,在Klenow DNA聚合酶的作用下合成第二鏈cDNA。6、簡(jiǎn)述常規(guī)PCR的基本原理。答：PCR是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)制，體外模擬DNA復(fù)制的技術(shù)?；疽匕ǚ磻?yīng)緩沖液、模板DNA、引物DNA、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+等組分。模板DNA的高溫變性、引物與模板低溫退火（結(jié)合）、子鏈中溫延伸個(gè)基本步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。新合成的DNA鏈經(jīng)變性后又可以作為下一輪PCR循環(huán)反應(yīng)的模板，如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA呈倍性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。21、簡(jiǎn)述普通PCR的基本程序答：預(yù)變性：92-98，DNA解螺旋；變性：92-98，雙鏈DNA解鏈成