復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)02細(xì)胞的遺傳物質(zhì)

1、PAGE PAGE 80第二篇細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第一章細(xì)胞內(nèi)核酸的提取人類基因組計(jì)劃的完成以及后基因組學(xué)研究的不斷深入，標(biāo)志著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展已逐步進(jìn)入“基因組醫(yī)學(xué)”的時代。疾病分子機(jī)制的研究也將為包括疾病的分子診斷、分子治療在內(nèi)容的“分子醫(yī)學(xué)”的發(fā)展提供動力。核酸是遺傳信息以及基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是重要的生物信息分子,也是分子生物學(xué)研究的主要對象。它與生命的正?；顒?，如種族遺傳、生長等有密切聯(lián)系；它與生命的異?；顒樱缒[瘤的發(fā)生、放射損傷以及抗癌、抗病毒藥物的作用機(jī)理等也有密切的關(guān)系。因此，核酸是現(xiàn)代生命科學(xué)體系中重點(diǎn)研究的課題之一。核酸分為DNA和RNA兩大類。核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中基

2、本的操作之一，第一節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離與純化DNA主要在細(xì)胞核內(nèi)，核外也有少量稱為核外基因的線粒體DNA等。真核細(xì)胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白體形式存在于細(xì)胞中。真核細(xì)胞基因組DNA提取的主要步驟包括裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是去除體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的過程。一、裂解細(xì)胞破碎的手段常為超聲波、組織勻漿、液氮破碎以及包埋組織的超薄切片等方法。為了獲得大量完整的DNA，一般采用裂解液等溫和的方法破碎細(xì)胞。裂解液一般都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-1

3、00、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污劑的作用是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及去除與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。鹽的作用，一方面提供一個合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 。裂解體系中還可以加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。二、純化根據(jù)DNA本身的特征使用不同方法進(jìn)行核酸提純。三、DNA提取的實(shí)驗(yàn)步驟（一）材料與設(shè)備1.試劑 消化液（100mmo

4、l/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES飽和酚；氯仿；異戊醇； 95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1g/ml RNA酶；2.儀器 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、微量離心管、滴管；刻度吸管；加樣器；槍頭；離心機(jī)、液氮罐、組織勻漿器、恒溫培養(yǎng)箱（二）主要步驟1.如果材料為組織塊，可將組織塊（約2001000mg）剪碎后，置入液氮中。隨后用冰冷的組織搗碎器搗碎，每100mg組織加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L

5、 Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。2.如果材料是懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞于微量離心管中，500g5min離心；如果材料是貼壁細(xì)胞，棄上清后，胰酶消化收集細(xì)胞，500g5min離心。隨后用冰冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，500g5min離心，棄上清，重復(fù)一次，并用一倍體積的消化液重懸細(xì)胞。3.組織或細(xì)胞混懸液移入帶蓋的離心管中，50消化1218h。4.冷卻至4，加等體積15 mo1L TES飽和酚。5.輕輕振搖，使水相和酚層充分混勻。6. 45000rpm8000rpm離心15min20min。此時DNA溶液在上層，酚位于下層，中間是變

6、性蛋白層。7.用吸管小心吸取上層粘稠溶液，移至另一離心管。注意盡量不要帶出中間蛋白層。8. DNA溶液再加等體積15 mo1L TES飽和酚抽提一次，按6、7離心并吸至另一離心管。9.加等體積氯仿/異戊醇按步驟（5、6）抽提，離心5min。10.吸出DNA溶液后，再步驟（9）抽提一次。11.用吸管將DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0。12.加2.5倍體積95%冷乙醇震搖，可見DNA白色沉淀析出。13.用75%冷乙醇清洗34次。14.室溫干燥或冷凍干燥DNA。15.加適量TE溶液溶解DNA。四、結(jié)果鑒定1紫外分光光度計(jì)檢測：可檢測DNA的純度和含量。一般而言核酸在260nm時吸光度最大

7、，而蛋白質(zhì)在280nm時吸光度最大。取2l DNA溶解液，適量稀釋，紫外分光光度計(jì)測定260nm、280nmOD值，計(jì)算OD260/OD280比值，比值在1.72.0:1之間，說明DNA純度可。在260nm處，1OD雙鏈DNA的濃度為50g /ml，據(jù)此可計(jì)算DNA的濃度（g /ml）=50(OD260) 稀釋倍數(shù)。2電泳檢測：可檢測核酸的完整性和大小。取2l DNA溶解液與適量上樣緩沖液混合后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后紫外光下觀察，拍照；如果觀察到一條清晰的電泳帶，無明顯的拖尾，說明DNA完整性好。第二節(jié)真核細(xì)胞總RNA的分離提取RNA是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rRNA（占

8、細(xì)胞總RNA的80%85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占1015%）、mRNA（占15%）。其中mRNA是分子生物學(xué)的主要研究對象，分離制備mRNA是克隆基因，分析基因表達(dá)以及建立cDNA文庫的首要步驟。真核細(xì)胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關(guān)鍵是盡量減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性的RNA酶外，環(huán)境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍

9、或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。一、RNA提取 的關(guān)鍵真核細(xì)胞RNA的提取過程有四個關(guān)鍵點(diǎn)，即 = 1 * GB3 樣品（細(xì)胞或組織）的有效破碎； = 2 * GB3 有效地使核蛋白復(fù)合體變性； = 3 * GB3 對內(nèi)源RNA酶的有效抑制； = 4 * GB3 有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關(guān)鍵的是抑制酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。二、組織RNA提取的基本步驟1.儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧化氫、甲酰

10、胺、RNA上樣緩沖液。3.主要步驟（1）取組織50100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。（2）加0.2ml氯仿，充分震蕩混勻，靜置3min，4，12000g15min離心。棄沉淀。（3）取上清，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻。20靜置2h，4，12000g10min離心。（4）棄上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4，7500g5min離心。（5）棄上清，沉淀真空干燥10min。（6）加40l DEPC溶液，充分溶解RNA。4.結(jié)果鑒定（1）紫外分光光度計(jì)檢測：取RNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計(jì)測定260nm、280n

11、mOD值，計(jì)算OD260/OD280比值，如果比值在1.72.0：1之間，說明RNA純度可。標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)OD2601時，RNA濃度約為40g/ml，根據(jù)下述公式計(jì)算RNA濃度：RNA濃度（g/ml）OD260稀釋倍數(shù)40。（2）電泳檢測：1%甲醛變性膠電泳觀察RNA質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用3%過氧化氫浸泡過夜；制1%甲醛變性凝膠板：4.5l RNA，2ul 5甲醛膠電泳緩沖液，3.5l 37%甲醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65變性15min后，迅速置冰浴中；再加入2l RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳12h；暗室內(nèi)紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA

12、電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品70保存?zhèn)溆?。三、注意事?xiàng)1、所有玻璃器皿160180高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經(jīng)0.1% DEPC液浸泡后，經(jīng)高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。2、實(shí)驗(yàn)用水要經(jīng)DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。3、實(shí)驗(yàn)操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀、大小約1kb200kb 的DNA，存在于 HYPERLINK /search1.asp?k=細(xì)胞 o 細(xì)胞文章 細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的可自主復(fù)

13、制的遺傳成份。通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過 HYPERLINK /search1.asp?k=細(xì)胞 o 細(xì)胞文章 細(xì)胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒是目前最常用的 HYPERLINK /search1.asp?k=基因 o 基因相關(guān)文章 基因克隆的載體分子之一，獲得大量純化的質(zhì)粒DNA是 HYPERLINK /search1.asp?k=基因 o 基因相關(guān)文章 基因克隆的前提條件。一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理 堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)?/p>

14、學(xué)性質(zhì)不同。在PH1212.5時,線性DNA會完全變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA只是氫鍵斷裂，經(jīng)酸中和后，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA可迅速準(zhǔn)確的復(fù)性。而線性DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，只能聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后與變性的蛋白質(zhì)、RNA一起沉淀下來。上清液中的質(zhì)粒DNA可用乙醇沉淀出來。二、基本步驟1材料：含質(zhì)粒的大腸桿菌2試劑：溶液（ 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）)、溶液（0.2N NaOH，1% SDS）用時臨時配制。pH 4.8的醋酸鉀（KAc）緩沖液（5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml）、 TE緩沖液（10

15、mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)）、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）、 5TBE（Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml）。10mg/ml溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、10mg/ml RNase A（RNA酶A）、6上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。3儀器：離心機(jī)、電泳儀、水平式電泳槽 4.主要步驟 （1）挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過

16、夜。（2）取1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入微量離心管中，室溫離心8000g1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。（3）將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩。（4）加200l新鮮配制的溶液于離心管中，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使 HYPERLINK /search1.asp?k=細(xì)胞 o 細(xì)胞文章 細(xì)胞膜充分裂解。（5）加入150l預(yù)冷的醋酸鉀（KAc）緩沖液，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。（6）加入450l的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，振蕩混勻，4離心12000g 10min。（7）小心移出上清于另一微量離心管

17、中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4離心12000g15min。（8）加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，4離心8000g7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。（9）沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩?.結(jié)果鑒定：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。方法同前核酸DNA的鑒定。第四節(jié)線粒體DNA的提取線粒體DNA是染色體遺傳物質(zhì)，哺乳類動物的線粒體DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA。它變異快、結(jié)構(gòu)相對簡單，經(jīng)母系遺傳，對真核生物基因組的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控機(jī)理等方面都起著重要作用。近年來被廣泛用于近緣

18、種間或種內(nèi)種群間親緣關(guān)系的研究。線粒體DNA最早是用氯化銫梯度離心方法獲得，該法提取的線粒體DNA純度高，但所需儀器設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)周期長，限制其在群體遺傳研究中的應(yīng)用。繼而出現(xiàn)了Triton法、堿變性法與改進(jìn)高鹽沉淀法等線粒體DNA的提取方法。一、堿變性法線粒體DNA提取的原理 線粒體DNA的結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)相似，均為共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA，實(shí)驗(yàn)原理與質(zhì)粒DNA提取相同 。二、主要實(shí)驗(yàn)步驟1、材料：新鮮小鼠肝組織2、儀器：玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、離心管、吸管3、試劑：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%SDS、0

19、.2N NaOH、3M NaAc pH4.8、95%乙醇、75%乙醇、TE緩沖液4、主要步驟（1）取50mg新鮮小鼠肝組織，加1ml冷勻漿液，用玻璃勻漿器勻漿，隨即以1000g3min， 4，離心，棄沉淀。（2）取上清，12000g10min，4，離心，沉淀即為粗線粒體。（3）將沉淀溶于100ml（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0）溶液中，充分混勻。（4）加200ml新鮮配制的（1%SDS，0.2N NaOH）溶液，輕輕搖勻，冰浴5min。（5）再加150ml（3M NaAc pH4.8）溶液，輕輕搖勻，冰浴5min。12

20、000g10min，4，離心（6）取上清加等體積（酚、氯仿、異戊醇之體積比為25:24:1）溶液，抽提24次，界面無白色物質(zhì)，10000g5min離心。（7）取上清加2倍體積95%乙醇，室溫靜置15min，然后12000g10min離心。（8）棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌1次，以12000g5min離心。（9）棄上清，取沉淀，真空干燥后即得線粒體DNA。將其溶于適量的TE緩沖液中，20保存。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定用紫外分光光度儀測定，A260：A280為2.0左右。若純度較高，能直接用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切圖譜分析。（上海中醫(yī)藥大學(xué)王曉玲）第二篇細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第二章核酸雜交技術(shù)自Southern于19

21、75年創(chuàng)建了檢測特異DNA的核酸雜交技術(shù)以來，Southern雜交以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的其它核酸雜交技術(shù)已成為分子生物學(xué)的基本技術(shù)。核酸雜交（hybridization）是兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈在特定的條件下退火形成異質(zhì)雙鏈的過程。核酸雜交是建立在以堿基互補(bǔ)為基礎(chǔ)的、以雙鏈核酸分子在特定條件下的變性和復(fù)性為手段的，對核酸分子進(jìn)行定性和定量檢測的技術(shù)。即把經(jīng)酶切的、電泳分離的、經(jīng)堿變性后生成單鏈分子的待檢測核酸片段轉(zhuǎn)印到特定的膜上，用已知特定序列的標(biāo)記探針與之雜交，以檢驗(yàn)該核酸片段是否與已知的探針有同源序列。核酸雜交既可以是DNA與DNA鏈、RNA與RNA鏈之間的雜交，又可以是DNA與RNA鏈之

22、間的雜交（圖2-2-1）。待檢核酸既可以是內(nèi)源的又可以是外源的，既可以是細(xì)胞生物的基因組又可以是質(zhì)粒和病毒的核酸。探針或是用基因克隆技術(shù)分離獲得的特異的DNA序列，或是特異DNA序列在體外轉(zhuǎn)錄出的RNA序列或cDNA序列，或是人工合成的寡核苷酸片段；探針的標(biāo)記物或是放射性同位素，或是一些非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛和熒光素等。核酸雜交可進(jìn)行染色體圖譜分析，測定特異DNA序列的拷貝數(shù)（甚至可檢測到哺乳動物基因組中的單拷貝基因），鑒定與疾病有關(guān)的限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)行基因克隆的篩選，檢測不同濃度的DNA，鑒別特異基因的表達(dá)部位，進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)的初步分析、特異RNA的定量檢測，分析基因轉(zhuǎn)錄的

23、含量變化，末端標(biāo)記的寡核苷酸探針可檢測點(diǎn)突變，確定有無病毒感染等。圖2-2-1 核酸雜交路線圖第一節(jié) 核酸探針一、核酸探針的概念 核酸探針是含有標(biāo)記物的已知特定序列的核酸片段，因?yàn)榕c待檢測核酸片段具有高度同源性而結(jié)合，可以對待檢測核酸進(jìn)行定性、定量和定位的工具。二、探針的種類及選擇根據(jù)核酸探針分子性質(zhì)的不同可分為DNA探針和RNA探針，根據(jù)核酸探針來源的不同又分為基因組DNA探針、人工合成的寡核苷酸探針和cDNA探針?？梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌蛠碓词欠窠?jīng)濟(jì)，選擇不同性質(zhì)或來源的探針。選擇探針時所應(yīng)遵循的基本原則是核酸探針與待檢測核酸片段間要具有高度同源性。三、探針的標(biāo)記 核酸探針如今已被廣泛應(yīng)用

24、于分子生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域中。最早使用的放射性同位素標(biāo)記的核酸探針具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但因放射性同位素半衰期短、具放射性污染、成本高等原因，逐漸被非放射性的探針標(biāo)記物生物素、地高辛和熒光素等替代。（一）標(biāo)記物的種類1放射性標(biāo)記物 放射性同位素是最早使用的核酸探針標(biāo)記物?？晒┻x擇的用于探針標(biāo)記的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I、或131I，前三種較常用。但放射性同位素在探針標(biāo)記中由于存在放射性污染、半衰期短及在儲存、運(yùn)輸和后期處理上的不便利因素，而逐漸被安全性較高的非放射性標(biāo)記物所替代。2非放射性標(biāo)記物 （1）生物素：生物素是一種生物小分子，可與親和素（Avidin

25、，Av）發(fā)生特異性的結(jié)合，形成生物素-親和素的生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，而用于對標(biāo)記有生物素的核酸探針的顯示。親和素是一種堿性的糖蛋白，由四個相同的亞基組成，每個亞基都可以結(jié)合一個生物素分子，這種四價(jià)反應(yīng)產(chǎn)生了放大效應(yīng)。生物素與親和素相互結(jié)合的親和力高、穩(wěn)定性很好。但親和素是一種糖蛋白，應(yīng)用中往往有較高的非特異性結(jié)合。1963年，Chaiet在從鏈球菌培養(yǎng)液中篩選抗菌素時發(fā)現(xiàn)了一種能與生物素結(jié)合的類親和素蛋白質(zhì)-鏈酶親和素（Streptavidin, Sa）。鏈酶親和素與親和素的結(jié)構(gòu)相似，但不含糖基，因而以鏈酶親和素代替親和素，彌補(bǔ)了親和素非特異性結(jié)合高的缺點(diǎn)。根據(jù)生物素與親和素或鏈酶親和素間特異性結(jié)

26、合的屬性，通過與偶聯(lián)有熒光素或特定的報(bào)道酶如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）相互作用，形成“靶核酸-探針-生物素-親和素-報(bào)道酶（或熒光素）”連接復(fù)合體。之后，通過檢測熒光物質(zhì)的存在或使報(bào)道酶發(fā)生水解生色或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而完成對目的核酸的檢測。但是，由于生物素普遍存在于生物體內(nèi)，因此在Southern、Northern和原位雜交中造成本底升高。另外，生物素化的探針可牢固地結(jié)合于尼龍膜上，也可造成本底升高。鑒于生物素的以上缺點(diǎn)，促使人們?nèi)ふ姨禺愋詮?qiáng)于生物素的其它探針標(biāo)記物。（2）地高辛：地高辛(digoxige

27、nin, Dig)是一種類固醇半抗原分子，可以通過一連接臂被人工連接于dUTP上，如形成Dig-11-dUTP，在酶學(xué)反應(yīng)中可代替dTTP摻入到探針中去。自然界中只有洋地黃類植物產(chǎn)生地高辛，所以相對來說，以地高辛標(biāo)記的探針在Southern、Northern和原位雜交中本底較低，它的特異性優(yōu)于生物素。地高辛標(biāo)記的雜交復(fù)合體，可用與報(bào)道酶如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛的抗體加以檢測，如使報(bào)道酶發(fā)生水解生色或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。（3）熒光素：核酸探針可以直接用熒光素(fluorecein)標(biāo)記，如羅丹明或FITC。熒光素標(biāo)記的探針系統(tǒng)，使用的是熒光素-12-dUTP或熒光素-12-UTP（也

28、有用熒光素-11-dUTP或熒光素-11-UTP）代替dTTP或TTP在酶學(xué)反應(yīng)中摻入到探針中去，然后用連接有報(bào)道酶如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）的抗熒光素抗體檢測。（二）探針標(biāo)記的方法總體看來，核酸探針標(biāo)記的方法有兩大類：酶促法和光化學(xué)標(biāo)記法。酶促法是通過酶促反應(yīng)預(yù)先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸分子上，常用的核酸探針標(biāo)記的酶促法有缺口平移法、PCR末端填補(bǔ)法、隨機(jī)引物標(biāo)記法和轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法等。光化學(xué)標(biāo)記法是將生物素的衍生物連接有硝基苯疊氮的生物素光敏生物素在UV或強(qiáng)可見光（350nm）照射激發(fā)下，形成的一個芳香硝基

29、中間化合物（氮賓）可以非特異性地與DNA或RNA形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵而將生物素引入已經(jīng)合成好的核酸探針中，這樣，標(biāo)記有生物素的探針可以被親和素標(biāo)記的報(bào)道酶或熒光物質(zhì)所檢測。用光化學(xué)標(biāo)記法制備的核酸探針因?yàn)槠骄?00個左右核苷酸才帶有一個生物素殘基，所以不會影響探針與靶核酸的雜交，足以用于在針對哺乳動物基因組中的Southern雜交中檢測出單拷貝序列。相比之下，光化學(xué)標(biāo)記法的標(biāo)記效率遠(yuǎn)低于酶學(xué)標(biāo)記法，另外，光化學(xué)標(biāo)記法較酶學(xué)標(biāo)記法所獲得的探針的信號強(qiáng)度要弱許多，所以，在進(jìn)行探針標(biāo)記時，人們首選的是酶學(xué)標(biāo)記法。 四、探針的純化一般情況下，用于雜交的核酸探針在制備完成后，可直接用于進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。但如果

30、探針過長的話（25nt），在制備過程中就會有一些不符合長度要求的核苷酸片段被合成，對于某些探針精度要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要進(jìn)行探針純化。常用的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、柱層析、陽離子去垢劑沉淀法和乙醇沉淀法。 第二節(jié) Southern雜交技術(shù) 一、Southern雜交的概念Southern雜交技術(shù)是將凝膠電泳分離的酶切DNA片段通過印記法（imprinting）轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，檢測標(biāo)記過的探針是否與變性后的DNA發(fā)生雜交，而對靶DNA進(jìn)行定性和定量的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，包括DNA的印記轉(zhuǎn)移和DNA的雜交兩部分內(nèi)容。二、Southern雜交的一般程序首先從組織或培養(yǎng)細(xì)胞分離基因組DNA，并以一

31、種或多種限制性核酸內(nèi)切酶消化基因組DNA，消化后所得的DNA片段以標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分離，再對DNA進(jìn)行原位變性，以印記法將DNA片段從膠上轉(zhuǎn)移至固相支持物上（如尼龍膜或硝酸纖維素膜）（圖2-2-2），用標(biāo)記的DNA或RNA探針在膜上與轉(zhuǎn)印后的DNA片段雜交，最后，針對不同的探針標(biāo)記物選擇特定的檢測方法如放射自顯影法、比色法、熒光檢測或化學(xué)發(fā)光檢測來確定與探針互補(bǔ)的靶DNA的存在及位置（圖2-2-3）。圖2-2-2 印記轉(zhuǎn)移圖 2-2-3 Southern雜交路線圖三、Southern雜交的實(shí)驗(yàn)步驟：（一）材料與設(shè)備1PBS：0.137 mol/L NaCl 2.68 mmol/L K

32、Cl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4 (pH 7.2)2STEL緩沖液：0.2% SDS 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5) 10 mmol/L EDTA 100 mmol/L LiCl35 mol/L LiCl4TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl (8.0) 1 mmol/L EDTA (8.0)5限制酶高鹽緩沖液（1）：100 mmol/L NaCl 50 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT6限制酶中鹽緩沖液（1）：50 mmol/L NaCl 1

33、0 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT7限制酶低鹽緩沖液（1）：10 mmol/L Tris-HCl (7.5) 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT8牛血清白蛋白：1 mg/ml9限制性內(nèi)切酶10上樣液（6）：0.25% 溴酚藍(lán)0.25% 二甲苯氰FF30%甘油水溶液1110TBE：Tris 545g 硼酸 278g EDTA 46.5g 去離子水 5L12亞精胺：100 mmol/L13溴化乙錠（EB）：10 mg/ml的母液14脫嘌呤緩沖液：0.25 mol/L HCl15變性緩沖液：1.5 mol/L

34、 NaCl 0.5 mol/L NaOH16轉(zhuǎn)移緩沖液：1.5 mol/L NaCl 0.5 mol/L NaOH1720SCC：3 mol/L NaCl 0.3 mol/L 檸檬酸鈉 調(diào)節(jié)pH為7.018100Denhardt氏溶液：2%（w/v）BSA 2%（w/v）聚蔗糖 2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮 貯存于-20。1910%SDS20預(yù)雜交液：6SSC 5Denhardt溶液 0.5%（m/v）SDS 1g/ml Poly（A） 100g/ml 鮭魚精子DNA 50%（v/v）甲酰胺21標(biāo)記探針22洗膜液A：2SSC 0.5% SDS23洗膜液B：2SSC 0.1% SDS24洗膜液C

35、：0.1SSC 0.1% SDS25酚:氯仿（1:1 v/v）26雜交液：在預(yù)雜交液中加入10%（w/v）硫酸葡聚糖。27抗地高辛溶液：2.5l 抗地高辛抗體/堿性磷酸酶結(jié)合物 1 mol/L Tris-HCl（pH9.5） 1 mol/L MgCl2 5 mol/L NaCl28檢測緩沖液：0.1 mol/L二乙醇胺 1 mmol/L MgCl2 0.02%疊氮化鈉 用濃HCl調(diào)節(jié)pH到10.0。29AMPPD溶液：在3l檢測緩沖液中加入6l Tropix AMPPD。30脫色液：0.1 SSC 0.1% SDS31有關(guān)設(shè)備：電熱板、電泳儀、電泳槽、長波紫外燈（365nm）、312nm紫外燈

36、、尼龍雜交膜、雜交袋或雜交瓶（二）樣本制備1DNA提取 具體步驟見細(xì)胞內(nèi)核酸的提取 2DNA的限制性內(nèi)切酶消化 DNA的限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來的、在特定序列識別并切割雙鏈DNA的蛋白酶，包括類、類和類。分子生物學(xué)中常用的是類DNA限制性內(nèi)切酶，識別并切割雙鏈DNA的特定序列通常是46個核苷酸長度的短的回文結(jié)構(gòu)，如AAGCTT（Hind ）、GAATTC（Eco R）、GAGCTC（Sac ）等，不同的酶切割的結(jié)果有所不同：有些酶在回文結(jié)構(gòu)的對稱點(diǎn)上同時切割DNA雙鏈而產(chǎn)生平末端的DNA片段；另外一些酶則在回文結(jié)構(gòu)對稱點(diǎn)左右相應(yīng)的位點(diǎn)同時切割兩條鏈而形成粘末端的DNA片段。DNA的限制性

37、內(nèi)切酶的消化步驟如下。（1）在冰水浴中混合下列反應(yīng)成分于微量離心管中，組成DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系混合液：酶切緩沖液 5l1 mg/ml的牛血清白蛋白 5l待切割的DNA 1g 加滅菌蒸餾水至終體積為50l，混勻，于4放置1h，以確保DNA均勻分散。（2）取出冷凍的限制性內(nèi)切酶，待溶化后，用滅菌微量吸管迅速吸取5單位酶加入反應(yīng)管中，在冰水浴中溫和攪拌2min，再升至酶切反應(yīng)所需的溫度（大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度為37，但有些酶的反應(yīng)溫度偏高或偏低，所以應(yīng)以酶的產(chǎn)品說明書提供的溫度為準(zhǔn)），保溫1h（如果是基因組DNA，保溫812h）。（3）如果使用的限制性內(nèi)切酶不只一種，消化20min后，加入第二

38、份限制酶（5單位/g DNA），重復(fù)步驟。（4）取2l反應(yīng)后的酶切樣品，加上樣液后電泳檢查酶切是否完全。3瓊脂糖凝膠電泳 選擇不同濃度（0.2%3%）的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后于紫外燈下檢測。4瓊脂糖凝膠電泳的印記轉(zhuǎn)移 探針與目的DNA片段的雜交所依附的支持物可以是液相的也可以是固相的，常用的是固相支持物。在將電泳分離后的DNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上之前，要對瓊脂糖凝膠上的DNA片段進(jìn)行適當(dāng)處理，首先，將電泳后的DNA片段在紫外燈下與marker進(jìn)行對比，看目的DNA片段是否較長（15kb），大片段的DNA轉(zhuǎn)移較慢且效率較低，可以用弱酸進(jìn)行脫嘌呤處理，以水解DNA成較小片段來增加轉(zhuǎn)印效率

39、，通常脫嘌呤處理應(yīng)在弱酸環(huán)境下作用到溴酚藍(lán)變成黃色或二甲苯青變成黃綠色，水解后的DNA片段長度以為原來長度的三分之一左右為宜，過短的DNA片段在印記轉(zhuǎn)移過程中容易丟失和擴(kuò)散，擴(kuò)散將使檢測觀察到的DNA條帶模糊。其次，要對雙鏈DNA進(jìn)行變性處理。這些處理工作完成后將瓊脂糖凝膠上的DNA片段以適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)移到固相支持物上以備雜交。將電泳分離后的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物是印記雜交的關(guān)鍵步驟，目前，常用的轉(zhuǎn)移方法有五種：液流向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、液流向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、上下同時向兩張膜轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法和真空轉(zhuǎn)移法。最初所選用的固相支持物是硝酸纖維素膜，核酸通過疏水相互作用與硝酸纖維素膜結(jié)合，牢固程度較

40、差，在堿性條件下的結(jié)合能力進(jìn)一步下降，且這種膜質(zhì)地較脆，操作時需格外小心。目前核酸雜交實(shí)驗(yàn)多采用尼龍膜，尼龍膜堅(jiān)固耐用，可進(jìn)行多次雜交；而且核酸可在低離子強(qiáng)度下結(jié)合到尼龍膜上，可用電轉(zhuǎn)移法將DNA片段從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，極大提高了轉(zhuǎn)移效率，在紫外線照射下，核酸可與尼龍膜發(fā)生共價(jià)結(jié)合而被固定。另外，帶電荷的尼龍膜結(jié)合核酸的能力更強(qiáng)，且?guī)д姾傻哪猃埬ぴ趬A性轉(zhuǎn)移緩沖液中可與核酸共價(jià)結(jié)合，轉(zhuǎn)移后不需進(jìn)行固定。以毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法介紹印記轉(zhuǎn)移的操作過程：將修整后的凝膠浸泡于脫嘌呤緩沖液中直至溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色；棄掉脫嘌呤緩沖液，用去離子水沖洗凝膠數(shù)次；將膠浸入變性緩沖液，室溫輕搖40min；棄掉變

41、性緩沖液，用去離子水沖洗凝膠一次；將膠放置在毛細(xì)管轉(zhuǎn)移裝置上，DNA片段轉(zhuǎn)移需16小時；將膠從轉(zhuǎn)移裝置上取下，在雜交膜上對應(yīng)于點(diǎn)樣孔位置作適當(dāng)記號；用2SSC緩沖液淋洗雜交膜數(shù)秒；將雜交膜放入烘箱，80烘烤50min；將雜交膜不含DNA的一面朝向312nm紫外燈照射3min以固定DNA。（三）探針任選探針制備中所提供的方法制備放射性標(biāo)記的或非放射性標(biāo)記的探針。（四）雜交雜交的目的是以帶有標(biāo)記物的探針去對目的核酸進(jìn)行定性、定位檢測，而探針與目的核酸的準(zhǔn)確復(fù)性是影響雜交實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在，所以，雜交環(huán)境及用于進(jìn)行雜交的探針的特異性和純度對于確保雜交實(shí)驗(yàn)的成功就顯得尤為重要。雜交步驟包括：于雜交管中用6

42、SSC洗膜，之后加入10ml預(yù)雜交液，65搖動4h；探針于沸水中變性5min，變性后的探針與10ml（65）混合；棄去預(yù)雜交液，加入含有探針的雜交液，42搖動過夜；雜交結(jié)束后，將膜取出，放入含有數(shù)百毫升洗膜液A的器皿中，輕輕震蕩洗膜5min，此時勿使膜干燥！如果探針是被放射性物質(zhì)標(biāo)記的，應(yīng)將洗膜后的廢液倒入處理放射性污染的廢液缸中；向洗膜的器皿中加入數(shù)百毫升的洗膜液B，輕輕震蕩洗膜15min，洗后棄去洗膜液；向洗膜的器皿中加入數(shù)百毫升的洗膜液C，65輕輕震蕩2h；將膜取出，用聚乙烯膜（或袋）包好，勿使膜干燥；如使用的是放射性探針，應(yīng)立即進(jìn)行放射自顯影；放射自顯影結(jié)束后，洗去第一個探針后，還可與

43、第二個探針雜交。（五）雜交后標(biāo)記探針的檢測對于帶有不同標(biāo)記的探針，可以有不同的檢測方法。如果使用的是放射性探針，則采用放射自顯影使X光膠片曝光而加以顯示；如采用的是非放射性物質(zhì)（生物素或地高辛）標(biāo)記的探針，則是先以偶聯(lián)有報(bào)道酶（常用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）的可與非放射性標(biāo)記物特異結(jié)合的配基（鏈親和素或抗地高辛抗體）與對應(yīng)的非放射性標(biāo)記物（生物素或地高辛）發(fā)生特異結(jié)合，然后或是利用某些物質(zhì)可與報(bào)道酶發(fā)生顏色反應(yīng)而間接地對靶核酸加以顯示，或是利用某些物質(zhì)可與報(bào)道酶發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而得以對目的核酸加以檢測。顯色反應(yīng)中常用的報(bào)道酶是堿性磷酸酶?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)中使用的報(bào)道酶既可以是辣根過氧化物酶（HR

44、P）又可以是堿性磷酸酶。1放射性同位素標(biāo)記探針的檢測步驟 這些步驟包括：用放射性標(biāo)記的探針與膜雜交，雜交完成后，洗膜，用吸水紙吸去大部分膜上的水；將潮濕的膜用Saran膜包好，放在增感屏內(nèi)，于70用X-光膠片曝光24h（檢測哺乳動物基因組中的單拷貝序列曝光2h左右）。2非放射性標(biāo)記探針的化學(xué)發(fā)光法檢測步驟 報(bào)道酶既可以是堿性磷酸酶也可以是辣根過氧化物酶。如果是辣根過氧化物酶（HRP），則應(yīng)用HRP-魯米諾檢測系統(tǒng)；如果應(yīng)用堿性磷酸酶，則應(yīng)用堿性磷酸酶-AMPPD檢測系統(tǒng)。以下介紹一個以地高辛作為非放射性標(biāo)記物，報(bào)道酶為堿性磷酸酶，發(fā)光底物為AMPPD的檢測系統(tǒng)的操作步驟：用含有地高辛標(biāo)記的探針

45、與雜交膜預(yù)雜交、雜交和洗膜；將與地高辛標(biāo)記的探針雜交后的雜交膜浸入含有200ml抗地高辛溶液的容器中，室溫，30min；將膜浸泡于檢測緩沖液中，室溫，10min；將膜放置于一塊與X-光膠片盒大小一致的有機(jī)玻璃板上，并放在X-光膠片盒上；小心地向膜上加AMPPD溶液，之后用Saran膜包好以防干燥；曝光于37，3h（或室溫過夜）；用脫色液洗滌10min；用TE沖洗，空氣干燥后貯存。四、注意事項(xiàng)Southern雜交的注意事項(xiàng)包括以下幾個方面。1限制性內(nèi)切酶的選擇時應(yīng)注意酶切位點(diǎn)的量要適當(dāng)，不宜過多，也不應(yīng)過少，一般消化前DNA的長度至少應(yīng)為消化后長度的三倍。2酶切反應(yīng)體系中不應(yīng)含有氯仿、酚、乙醇、

46、去污劑等成分，以免造成內(nèi)切酶的失活。3操作過程中，應(yīng)在冰盒中進(jìn)行，并且迅速，以免造成對酶的活性造成影響（內(nèi)切酶最好應(yīng)事先分裝）。4高分子量DNA的消化過程中，為避免消化不均勻，應(yīng)加入限制酶緩沖液對DNA進(jìn)行稀釋。5消化過程中應(yīng)設(shè)置若干對照，隨時檢查消化是否徹底。6消化后應(yīng)用乙醇沉淀濃縮DNA片段，并用溴化乙錠測定DNA消化后的濃度。7消化后置于4貯存的DNA，上樣前應(yīng)于56加熱3分鐘以破壞粘性末端的連接。8對于酶切獲得的較大的DNA片段（100kb），上樣前應(yīng)與上樣液充分混勻，以免上樣時DNA漂浮而造成丟失。9根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，DNA片段大于5kb的電泳，電場強(qiáng)度為5V/cm時，可獲得最佳分辨率；DN

47、A片段小于1kb的電泳，電場強(qiáng)度為10V/cm時，可獲得最佳分辨率。10電泳后的凝膠放置不應(yīng)超過24小時，以免DNA條帶擴(kuò)散。11操作時，不能用手直接接觸雜交膜，以免造成背景升高；膜一旦放置于凝膠上后，就不可再移動膜。12預(yù)雜交時封閉要完全，以免背景升高。13不能使用已發(fā)生沉淀的SDS，以免造成背景升高。14如果目的DNA片段長度大于15kb，則轉(zhuǎn)印前應(yīng)進(jìn)行脫嘌呤處理，以產(chǎn)生較小的DNA片段以促進(jìn)轉(zhuǎn)印。15印記轉(zhuǎn)移時，濾紙和雜交膜應(yīng)完全濕潤，并且凝膠與濾紙及凝膠與雜交膜之間不能有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)印效果。16以紫外交聯(lián)進(jìn)行固定時，照射劑量過大或過小都是不合適的，過大的劑量（濕膜1.5J/cm2）

48、將導(dǎo)致胸腺嘧啶與膜之間形成過多的共價(jià)鍵而影響雜交；過小的劑量將使交聯(lián)不牢固。17不馬上雜交的膜應(yīng)在室溫下真空保存。18雙鏈探針雜交前要變性。19雜交液中最好不添加硫酸葡聚糖，以免增加背景。20甲酰胺如果顏色發(fā)黃則不能使用，以免增加背景。21雜交洗膜過程中不可使膜干燥。22對放射性標(biāo)記的探針的檢測，放射自顯影時間不應(yīng)超過4小時。第三節(jié) Northern雜交技術(shù)人們相對應(yīng)于研究DNA的Southern雜交技術(shù)而將研究RNA的印記轉(zhuǎn)移和雜交技術(shù)稱之為Northern雜交技術(shù)。一、Northern雜交的一般程序Northern雜交分析RNA的基本步驟是：首先，從組織或細(xì)胞中分離總RNA；接下來根據(jù)RN

49、A的大小，通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行分離；再將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上并通過紫外線交聯(lián)將其固定在支持物上；再用含有標(biāo)記物的探針與固定后的RNA雜交；之后，除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子；最后，對特異結(jié)合的探針分子的圖象進(jìn)行檢測、捕獲和分析。二、Northern雜交的實(shí)驗(yàn)步驟（一）材料與設(shè)備1PBS：0.137 mol/L NaCl 2.68 mmol/L KCl 7.89 mmol/L Na2HPO4 1.47 mmol/L KH2PO4 (pH 7.2)2RNA沉淀液：1.2 mol/L NaCl 0.8 mol/L 檸檬酸二鈉鹽15H2O35 mol/L NaCl：加2滴DEP

50、C，高壓滅菌（高壓滅菌后的DEPC分解為乙醇、H2O和CO2）。450 mmol/L醋酸鈉：加2滴（DEPC），高壓滅菌。5oligo（dT）- 纖維素62裝柱緩沖液：40 mmol/L Tris-Cl（pH7.6） 1 mmol/L NaCl 2 mmol/L EDTA(pH8.0) 0.2%(m/v)月桂基肌氨酸鈉以上四種溶液中，前三種均以0.1%的DEPC水配制，高壓滅菌，冷卻到65時，加入65含DEPC的水配制月桂基肌氨酸鈉母液。7洗脫緩沖液：10 mmol/L Tris-Cl（pH7.6） 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.05%SDS8乙醇910 mol/L NaOH

51、（DEPC處理的無菌水配制）10200g/ml溴化乙錠：用DEPC處理過的水配制。1110甲醛凝膠電泳緩沖液：50%甘油（由DEPC處理過的水配制） 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.25%（m/v）溴酚藍(lán) 0.25%（m/v）二甲苯腈藍(lán)乙酸1210MOPS電泳緩沖液：0.2 mol/L MOPS（pH7.0） 20 mmol/L乙酸鈉 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 均用經(jīng)DEPC處理過的水配制。13甲酰胺140.1mol/L乙酸胺15轉(zhuǎn)移緩沖液：堿性轉(zhuǎn)移緩沖液：0.01 mol/L NaOH 3 mol/L NaCl 中性轉(zhuǎn)移緩沖液：20SSC16預(yù)雜交緩沖液：0

52、.5 mol/L 磷酸鈉（pH7.2） 7%（m/v）SDS 1 mmol/L EDTA（pH7.0）17雜交緩沖液：0.25 mol/L 磷酸鈉（pH7.2） 7%（m/v）SDS 0.25 mol/L NaCl 50%甲酰胺182SSC190.1SSC200.5%SDS（二）樣本制備1RNA的提取 具體步驟見細(xì)胞內(nèi)核酸的提取2Poly（A）+ RNA的分離 從真核細(xì)胞中分離出來的總RNA中，在mRNA的結(jié)構(gòu)中，由于在3端具有特殊的Poly（A）尾巴，所以，可用oligo（dT）-纖維素親和層析法從總RNA中分離出mRNA。而實(shí)踐證明，柱層析也是從哺乳動物細(xì)胞提取的總RNA中純化大量（25g

53、）Poly（A）+RNA的較好的方法。具體步驟如下。（1）稱取1.0g oligo（dT）- 纖維素，用0.1 mol/L NaOH重懸后灌注經(jīng)DEPC處理過的柱子，并用3 ml 經(jīng)DEPC處理過的水洗柱子。（2）用1裝柱緩沖液洗柱子至流出液Ph達(dá)到8.0。（3）用無菌去離子水溶解RNA，60加熱10分鐘并加等體積的2裝柱緩沖液后加到柱上，收集流出液；于60加熱10分鐘后重新加到柱之上，并收集；再收集并加裝于柱上，總共三次。（4）加入3倍柱體積的洗脫緩沖液洗柱子，收集流出液（每管1ml，收集全部流出液），逐管于260nm處測吸光值（以1裝柱緩沖液作空白對照，以40g/ml=1為標(biāo)準(zhǔn)）來判斷哪管

54、含有RNA，混合含有RNA的收集液。3瓊脂糖凝膠電泳 雖然RNA分子通常是單鏈的，但是，由于存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，RNA分子往往自身折疊形成局部雙鏈。所以，電泳前也應(yīng)對RNA樣品做變性處理，變性劑常使用甲醛、甲酰胺等構(gòu)成的MOPS緩沖體系。RNA樣品經(jīng)過甲醛處理使之變性，并在含有甲醛的變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小電泳分離后，變性瓊脂糖凝膠會變脆，轉(zhuǎn)印操作時應(yīng)小心。另外，在電泳的同時，于變孔中應(yīng)加入判斷分子質(zhì)量的標(biāo)記物（marker），但也可利用真核生物的rRNA作為分子質(zhì)量的標(biāo)記物。真核生物細(xì)胞提取的總RNA中80%85%是rRNA（28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA），這

55、四種RNA可作為標(biāo)記用以判斷RNA的分子量或RNA是否遭降解。在大部分變性瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)中，溴酚藍(lán)遷移速度比5SrRNA稍快，而二甲苯腈藍(lán)的遷移比18SrRNA稍慢，哺乳動物的18SrRNA的大小范圍界于1.8kb2.0kb之間，28SrRNA的大小范圍界于4.6kb5.3kb之間。電泳步驟如下。（1）帶上手套，徹底清洗用于RNA電泳的電泳槽和梳子，并用3%的H2O2在室溫下浸泡10分鐘，最后用0.1%DEPC處理過的水再徹底洗滌電泳槽和梳子；用1MOPS電泳緩沖液配制含有2.2 mol/L甲醛的1.5%的瓊脂糖凝膠并灌制凝膠。（2）在一新的微量離心管中加入以下成分組成反應(yīng)體系：RNA2.

56、0l（10g/l）、10MOPS電泳緩沖液（2.0l）、甲醛（4.0l）、甲酰胺（10.0l）、溴化乙錠（1.0l）。蓋緊蓋子，于55溫育反應(yīng)體系1小時；溫育結(jié)束后，將反應(yīng)管置于冰水混合液中10min，離心5秒。（3）將反應(yīng)管置于冰水混合液中，并向管中加入2l 10甲醛凝膠電泳緩沖液。（4）加1MOPS電泳緩沖液于電泳槽中，加RNA樣本于凝膠上樣孔中（于邊孔加marker），在以5V/cm（電極間長度）電壓電泳4小時（至溴酚藍(lán)移出），電泳過程中每隔1小時換一次電泳液。（5）紫外線檢查電泳結(jié)果。4瓊脂糖凝膠電泳的印記轉(zhuǎn)移和RNA固定 將RNA印記轉(zhuǎn)移到固相支持物上也是Northern雜交所必需的

57、。轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的RNA經(jīng)紫外照射以共價(jià)鍵交聯(lián)于膜上后可反復(fù)雜交。這為研究不同基因表達(dá)的多種RNA提供了一個便捷的途徑，人們每次可以使用不同的探針與膜雜交，這對于RNA材料較難獲得或必需使用少量RNA的研究是很可貴的。（1）安裝印記裝置，并將修整后的凝膠帶孔的一面向下，放于濕的濾紙上，注意不要在膠和濾紙之間產(chǎn)生氣泡。（2）用轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤膠，在膠上放置濕潤的尼龍膜，膠與膜之間不應(yīng)存在氣泡（以玻棒趕走氣泡）。（3）將6cm厚的濾紙、吸水紙和玻璃板及重500g左右的重物放于膠上。（4）上行的RNA印記轉(zhuǎn)移：在中性轉(zhuǎn)移緩沖液中的轉(zhuǎn)移時間應(yīng)少于4小時；在堿性轉(zhuǎn)移緩沖液中的轉(zhuǎn)移時間為1小時。（5）轉(zhuǎn)移完

58、畢后，在膜上對應(yīng)于膠孔的位置用圓珠筆做好標(biāo)記，將膜移至含有6SSC的玻璃皿中，23，輕搖5分鐘。（6）將膜取出，盡量瀝干液體，將膜放于干濾紙上，在波長254nm下照射5分鐘以固定RNA于膜上；照射后，將膜放于兩張濾紙間于80下干烤60分鐘。（三）探針 選擇探針制備中所提供的方法制備所需的放射性標(biāo)記的或非放射性標(biāo)記的探針。（四）雜交 轉(zhuǎn)移并固定到膜上的RNA樣品，可以與特異的探針雜交，以判定感興趣的靶RNA的存在。1預(yù)雜交2小時。2取15ml雜交緩沖液與探針（探針為雙鏈時則需變性）混合，如果是RNA探針，于65雜交12小時（DNA探針的雜交溫度為55）。3雜交結(jié)束后，用2SSC洗膜三次。4以0.

59、1SSC和0.5%SDS與膜在70溫浴1小時，反復(fù)三遍。5依探針標(biāo)記物（放射性或非放射性）的不同，選擇對應(yīng)的檢測方法。（五）注意事項(xiàng)1如果有必要，可用不含RNA酶的DNA酶來徹底清除DNA，以免影響對Poly（A）+ RNA的分離速度。2洗脫液高壓滅菌時會產(chǎn)生大量泡末，可先將Tris-Cl和 EDTA高壓滅菌，再用DEPC處理過的水稀釋。3一次性層析柱要用DEPC處理，并在300下干烤滅菌4小時。4如果RNA總量較?。俁NA10mg），oligo（dT）-纖維素柱子的量應(yīng)小于1ml。5如需再生oligo（dT）-纖維素柱子，可用NaOH、水、裝柱緩沖液沖洗即可。6 電泳分離RNA時，如果RN

60、A片段長度為1.58kb，使用1.4%的瓊脂糖凝膠分離較理想。7凝膠上的Marker泳道，應(yīng)在電泳結(jié)束后，馬上切下染色。8用于雜交部分的RNA不能染色。9操作時，不能用手直接接觸雜交膜，以免造成背景升高；膜一旦放置于凝膠上后，就不可再移動膜。10預(yù)雜交時封閉要完全，以免背景升高。11不能使用已發(fā)生沉淀的SDS，以免造成背景升高。12轉(zhuǎn)移前的變性時間不宜過長，以免造成RNA降解。13印記轉(zhuǎn)移時，濾紙和雜交膜應(yīng)完全濕潤，并且凝膠與濾紙及凝膠與雜交膜之間不能有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)印效果。14紫外交聯(lián)過程中，紫外光的劑量要適中，不宜過大或過小。15雙鏈探針雜交前要變性。16操作過程中，避免膜干燥。第四節(jié)