LabAlliace高效液相色譜系統(tǒng)培訓教材(增加)

1、天津蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司LabAAlliiacee高效液液相色譜譜系統(tǒng)培培訓教材材一、液相相色譜系系統(tǒng)的基基本原理理 1、色譜法法分類按兩相的的物理狀狀態(tài)可分分為：氣氣相色譜譜法(GGC)和和液相色色譜法(LC)。氣相相色譜法法適用于于分離揮揮發(fā)性化化合物。GC根根據(jù)固定定相不同同又可分分為氣固固色譜法法(GSSC)和和氣液色色譜法(GLCC)，其其中以GGLC應應用最廣廣。液相相色譜法法適用于于分離低低揮發(fā)性性或非揮揮發(fā)性、熱穩(wěn)定定性差的的物質(zhì)。LC同同樣可分分為液固固色譜法法(LSSC)和和液液色色譜法(LLCC)。此此外還有有超臨界界流體色色譜法(SFCC)，它它以超臨臨界流體體（界

2、于于氣體和和液體之之間的一一種物相相）為流流動相（常常用COO2），因因其擴散散系數(shù)大大，能很很快達到到平衡，故故分析時時間短，特特別適用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分分為吸附附色譜法法(ACC)、分分配色譜譜法(DDC)、離子交交換色譜譜法(IIEC)、排阻阻色譜法法(ECC，又稱稱分子篩篩、凝膠膠過濾(GFCC)、凝凝膠滲透透色譜法法(GPPC）和和親和色色譜法。(此外外還有電電泳)。按操作形形式可分分為紙色色譜法(PC)、薄層層色譜法法(TLLC)、柱色譜譜法。2、液相相色譜理理論發(fā)展展簡況色譜法的的分離原原理是：溶于流流動相(mobbilee phhasee)中的的各組分分經(jīng)過固

3、固定相時時，由于于與固定定相(sstattionnaryy phhasee)發(fā)生生作用（吸吸附、分分配、離離子吸引引、排阻阻、親和和）的大大小、強強弱不同同，在固固定相中中滯留時時間不同同，從而而先后從從固定相相中流出出。又稱稱為色層層法、層層析法。色譜法最最早是由由俄國植植物學家家茨維特特（Tsswettt）在在19006年研研究用碳碳酸鈣分分離植物物色素時時發(fā)現(xiàn)的的，色譜譜法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后來來在此基基礎(chǔ)上發(fā)發(fā)展出紙紙色譜法法、薄層層色譜法法、氣相相色譜法法、液相相色譜法法。液相色譜譜法開始始階段是是用大直直徑的玻玻璃管柱柱在室溫溫和常壓壓下用液液

4、位差輸輸送流動動相，稱稱為經(jīng)典典液相色色譜法，此此方法柱柱效低、時間長長（常有有幾個小小時）。高效液液相色譜譜法(HHighh peerfoormaancee Liiquiid CChroomattogrraphhy，HHPLCC)是在在經(jīng)典液液相色譜譜法的基基礎(chǔ)上，于于60年年代后期期引入了了氣相色色譜理論論而迅速速發(fā)展起起來的。它與經(jīng)經(jīng)典液相相色譜法法的區(qū)別別是填料料顆粒小小而均勻勻，小顆顆粒具有有高柱效效，但會會引起高高阻力，需需用高壓壓輸送流流動相，故故又稱高高壓液相相色譜法法(Hiigh Preessuure Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)。又

5、因因分析速速度快而而稱為高高速液相相色譜法法(Hiigh Speeed Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HSSLP)。也稱稱現(xiàn)代液液相色譜譜。3、HPPLC的的特點和和優(yōu)點HPLCC有以下下特點：高壓壓壓力可達達15003000kg/ccm2。色譜譜柱每米米降壓為為75 kg/ccm2以上。高速流流速為00.1100.00 mll/miin。高效可可達50000塔塔板每米米。在一一根柱中中同時分分離成份份可達1100種種。高靈敏度度紫外外檢測器器靈敏度度可達00.011ng。同時消消耗樣品品少。HPLCC與經(jīng)典典液相色色譜相比比有以下下優(yōu)點：速度快通常分分析一個個樣品

6、在在1530 minn，有些些樣品甚甚至在55 miin內(nèi)即即可完成成。分辨率高高可選選擇固定定相和流流動相以以達到最最佳分離離效果。靈敏度高高紫外外檢測器器可達00.011ng，熒熒光和電電化學檢檢測器可可達0.1pgg。柱子可反反復使用用用一一根色譜譜柱可分分離不同同的化合合物。樣品量少少，容易易回收樣品經(jīng)經(jīng)過色譜譜柱后不不被破壞壞，可以以收集單單一組分分或做制制備。4、高效效液相色色譜分離離原理高效液相相色譜法法按分離離機制的的不同分分為液固固吸附色色譜法、液液分分配色譜譜法（正正相與反反相）、離子交交換色譜譜法、離離子對色色譜法及及分子排排阻色譜譜法。a液固固色譜法法使用用固體吸吸附劑

7、，被被分離組組分在色色譜柱上上分離原原理是根根據(jù)固定定相對組組分吸附附力大小小不同而而分離。分離過過程是一一個吸附附解吸吸附的平平衡過程程。常用用的吸附附劑為硅硅膠或氧氧化鋁，粒粒度510m。適適用于分分離分子子量2000110000的組分分，大多多數(shù)用于于非離子子型化合合物，離離子型化化合物易易產(chǎn)生拖拖尾。常常用于分分離同分分異構(gòu)體體。b液液液色譜法法使用用將特定定的液態(tài)態(tài)物質(zhì)涂涂于擔體體表面，或或化學鍵鍵合于擔擔體表面面而形成成的固定定相，分分離原理理是根據(jù)據(jù)被分離離的組分分在流動動相和固固定相中中溶解度度不同而而分離。分離過過程是一一個分配配平衡過過程。涂布式固固定相應應具有良良好的惰惰

8、性；流流動相必必須預先先用固定定相飽和和，以減減少固定定相從擔擔體表面面流失；溫度的的變化和和不同批批號流動動相的區(qū)區(qū)別常引引起柱子子的變化化；另外外在流動動相中存存在的固固定相也也使樣品品的分離離和收集集復雜化化。由于于涂布式式固定相相很難避避免固定定液流失失，現(xiàn)在在已很少少采用?，F(xiàn)在多多采用的的是化學學鍵合固固定相，如如C188、C8、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色譜譜法按固固定相和和流動相相的極性性不同可可分為正正相色譜譜法(NNPC)和反相相色譜法法(RPPC)。正相色譜譜法采采用極性性固定相相(如聚聚乙二醇醇、氨基基與腈基基鍵合相相)；流流動相為為相對非非極性的的疏水性性溶劑

9、(烷烴類類如正已已烷、環(huán)環(huán)已烷），常常加入乙乙醇、異異丙醇、四氫呋呋喃、三三氯甲烷烷等以調(diào)調(diào)節(jié)組分分的保留留時間。常用于于分離中中等極性性和極性性較強的的化合物物(如酚酚類、胺胺類、羰羰基類及及氨基酸酸類等）。反相色譜譜法一一般用非非極性固固定相（如如C188、C8）；流流動相為為水或緩緩沖液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、異異丙醇、丙酮、四氫呋呋喃等與與水互溶溶的有機機溶劑以以調(diào)節(jié)保保留時間間。適用用于分離離非極性性和極性性較弱的的化合物物。RPPC在現(xiàn)現(xiàn)代液相相色譜中中應用最最為廣泛泛，據(jù)統(tǒng)統(tǒng)計，它它占整個個HPLLC應用用的800%左右右。隨著柱填填料的快快速發(fā)展展，反相相色譜法法的應用用范圍

10、逐逐漸擴大大，現(xiàn)已已應用于于某些無無機樣品品或易解解離樣品品的分析析。為控控制樣品品在分析析過程的的解離，常常用緩沖沖液控制制流動相相的pHH值。但但需要注注意的是是，C118和CC8使用的的pH值值通常為為2.557.5（228），太太高的ppH值會會使硅膠膠溶解，太太低的ppH值會會使鍵合合的烷基基脫落。有報告告新商品品柱可在在pH 1.55100范圍操操作。正相色譜譜法與反反相色譜譜法比較較表正相色譜譜法 反反相色譜譜法固定相極極性高中 中低低流動相極極性低中 中高高組分洗脫脫次序極極性小先先洗出 極性性大先洗洗出從上表可可看出，當當極性為為中等時時正相色色譜法與與反相色色譜法沒沒有明顯

11、顯的界線線（如氨氨基鍵合合固定相相）。c離子子交換色色譜法固定相相是離子子交換樹樹脂，常常用苯乙乙烯與二二乙烯交交聯(lián)形成成的聚合合物骨架架，在表表面未端端芳環(huán)上上接上羧羧基、磺磺酸基（稱稱陽離子子交換樹樹脂）或或季氨基基（陰離離子交換換樹脂）。被分離離組分在在色譜柱柱上分離離原理是是樹脂上上可電離離離子與與流動相相中具有有相同電電荷的離離子及被被測組分分的離子子進行可可逆交換換，根據(jù)據(jù)各離子子與離子子交換基基團具有有不同的的電荷吸吸引力而而分離。緩沖液常常用作離離子交換換色譜的的流動相相。被分分離組分分在離子子交換柱柱中的保保留時間間除跟組組分離子子與樹脂脂上的離離子交換換基團作作用強弱弱有關(guān)

12、外外，它還還受流動動相的ppH值和和離子強強度影響響。pHH值可改改變化合合物的解解離程度度，進而而影響其其與固定定相的作作用。流流動相的的鹽濃度度大，則則離子強強度高，不不利于樣樣品的解解離，導導致樣品品較快流流出。離子交換換色譜法法主要用用于分析析有機酸酸、氨基基酸、多多肽及核核酸。d離子子對色譜譜法又又稱偶離離子色譜譜法，是是液液色色譜法的的分支。它是根根據(jù)被測測組分離離子與離離子對試試劑離子子形成中中性的離離子對化化合物后后，在非非極性固固定相中中溶解度度增大，從從而使其其分離效效果改善善。主要要用于分分析離子子強度大大的酸堿堿物質(zhì)。分析堿性性物質(zhì)常常用的離離子對試試劑為烷烷基磺酸酸鹽

13、，如如戊烷磺磺酸鈉、辛烷磺磺酸鈉等等。另外外高氯酸酸、三氟氟乙酸也也可與多多種堿性性樣品形形成很強強的離子子對。分析酸性性物質(zhì)常常用四丁丁基季銨銨鹽，如如四丁基基溴化銨銨、四丁丁基銨磷磷酸鹽。離子對色色譜法常常用ODDS柱（即即C188），流流動相為為甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mool/LL的離子子對試劑劑，在一一定的ppH值范范圍內(nèi)進進行分離離。被測測組分保保時間與與離子對對性質(zhì)、濃度、流動相相組成及及其pHH值、離離子強度度有關(guān)。e排阻阻色譜法法固定定相是有有一定孔孔徑的多多孔性填填料，流流動相是是可以溶溶解樣品品的溶劑劑。小分分子量的的化合物物可以進進入孔中中，滯留留

14、時間長長；大分分子量的的化合物物不能進進入孔中中，直接接隨流動動相流出出。它利利用分子子篩對分分子量大大小不同同的各組組分排阻阻能力的的差異而而完成分分離。常常用于分分離高分分子化合合物，如如組織提提取物、多肽、蛋白質(zhì)質(zhì)、核酸酸等。5、固定定相和流流動相在色譜分分析中，如如何選擇擇最佳的的色譜條條件以實實現(xiàn)最理理想分離離，是色色譜工作作者的重重要工作作，也是是用計算算機實現(xiàn)現(xiàn)HPLLC分析析方法建建立和優(yōu)優(yōu)化的任任務之一一。本節(jié)節(jié)著重討討論填料料基質(zhì)、化學鍵鍵合固定定相和流流動相的的性質(zhì)及及其選擇擇。（1）基基質(zhì)（擔擔體）HPLCC填料可可以是陶陶瓷性質(zhì)質(zhì)的無機機物基質(zhì)質(zhì)，也可可以是有有機聚合

15、合物基質(zhì)質(zhì)。無機機物基質(zhì)質(zhì)主要是是硅膠和和氧化鋁鋁。無機機物基質(zhì)質(zhì)剛性大大，在溶溶劑中不不容易膨膨脹。有有機聚合合物基質(zhì)質(zhì)主要有有交聯(lián)苯苯乙烯-二乙烯烯苯、聚聚甲基丙丙烯酸酯酯。有機機聚合物物基質(zhì)剛剛性小、易壓縮縮，溶劑劑或溶質(zhì)質(zhì)容易滲滲入有機機基質(zhì)中中，導致致填料顆顆粒膨脹脹，結(jié)果果減少傳傳質(zhì)，最最終使柱柱效降低低。A基質(zhì)的的種類1）硅膠膠硅膠是HHPLCC填料中中最普遍遍的基質(zhì)質(zhì)。除具具有高強強度外，還還提供一一個表面面，可以以通過成成熟的硅硅烷化技技術(shù)鍵合合上各種種配基，制制成反相相、離子子交換、疏水作作用、親親水作用用或分子子排阻色色譜用填填料。硅硅膠基質(zhì)質(zhì)填料適適用于廣廣泛的極極性和

16、非非極性溶溶劑。缺缺點是在在堿性水水溶性流流動相中中不穩(wěn)定定。通常常，硅膠膠基質(zhì)的的填料推推薦的常常規(guī)分析析pH范范圍為228。硅膠的主主要性能能參數(shù)有有：平均粒粒度及其其分布。平均孔孔徑及其其分布。與比表表面積成成反比。比表面面積。在在液固吸吸附色譜譜法中，硅硅膠的比比表面積積越大，溶溶質(zhì)的kk值越大大。含碳量量及表面面覆蓋度度（率）。在反相相色譜法法中，含含碳量越越大，溶溶質(zhì)的kk值越大大。含水量量及表面面活性。在液固固吸附色色譜法中中，硅膠膠的含水水量越小小，其表表面硅醇醇基的活活性越強強，對溶溶質(zhì)的吸吸附作用用越大。端基封封尾。在在反相色色譜法中中，主要要影響堿堿性化合合物的峰峰形。幾

17、何形形狀。硅硅膠可分分為無定定形全多多孔硅膠膠和球形形全多孔孔硅膠，前前者價格格較便宜宜，缺點點是渦流流擴散項項及柱滲滲透性差差；后者者無此缺缺點。硅膠純純度。對對稱柱填填料使用用高純度度硅膠，柱柱效高，壽壽命長，堿堿性成份份不拖尾尾。2）氧化化鋁具有與硅硅膠相同同的良好好物理性性質(zhì)，也也能耐較較大的ppH范圍圍。它也也是剛性性的，不不會在溶溶劑中收收縮或膨膨脹。但但與硅膠膠不同的的是，氧氧化鋁鍵鍵合相在在水性流流動相中中不穩(wěn)定定。不過過現(xiàn)在已已經(jīng)出現(xiàn)現(xiàn)了在水水相中穩(wěn)穩(wěn)定的氧氧化鋁鍵鍵合相，并并顯示出出優(yōu)秀的的pH穩(wěn)穩(wěn)定性。3）聚合合物以高交聯(lián)聯(lián)度的苯苯乙烯-二乙烯烯苯或聚聚甲基丙丙烯酸酯酯為

18、基質(zhì)質(zhì)的填料料是用于于普通壓壓力下的的HPLLC，它它們的壓壓力限度度比無機機填料低低。苯乙乙烯-二二乙烯苯苯基質(zhì)疏疏水性強強。使用用任何流流動相，在在整個ppH范圍圍內(nèi)穩(wěn)定定，可以以用NaaOH或或強堿來來清洗色色譜柱。甲基丙丙烯酸酯酯基質(zhì)本本質(zhì)上比比苯乙烯烯-二乙乙烯苯疏疏水性更更強，但但它可以以通過適適當?shù)墓δ芑扌揎椬兂沙捎H水性性的。這這種基質(zhì)質(zhì)不如苯苯乙烯-二乙烯烯苯那樣樣耐酸堿堿，但也也可以承承受在ppH133下反復復沖洗。所有聚合合物基質(zhì)質(zhì)在流動動相發(fā)生生變化時時都會出出現(xiàn)膨脹脹或收縮縮。用于于HPLLC的高高交聯(lián)度度聚合物物填料，其其膨脹和和收縮要要有限制制。溶劑劑或小分分子

19、容易易滲入聚聚合物基基質(zhì)中，因因為小分分子在聚聚合物基基質(zhì)中的的傳質(zhì)比比在陶瓷瓷性基質(zhì)質(zhì)中慢，所所以造成成小分子子在這種種基質(zhì)中中柱效低低。對于于大分子子像蛋白白質(zhì)或合合成的高高聚物，聚聚合物基基質(zhì)的效效能比得得上陶瓷瓷性基質(zhì)質(zhì)。因此此，聚合合物基質(zhì)質(zhì)廣泛用用于分離離大分子子物質(zhì)。B基質(zhì)質(zhì)的選擇擇硅膠基質(zhì)質(zhì)的填料料被用于于大部分分的HPPLC分分析，尤尤其是小小分子量量的被分分析物，聚聚合物填填料用于于大分子子量的被被分析物物質(zhì)，主主要用來來制成分分子排阻阻和離子子交換柱柱。硅膠氧化鋁苯乙烯-二乙烯烯苯甲基丙烯烯酸酯耐有機溶溶劑+適用pHH范圍+抗膨脹/收縮+耐壓+表面化學學性質(zhì)+效能+注：+

20、好+一般般+差（2）化化學鍵合合固定相相將有機官官能團通通過化學學反應共共價鍵合合到硅膠膠表面的的游離羥羥基上而而形成的的固定相相稱為化化學鍵合合相。這這類固定定相的突突出特點點是耐溶溶劑沖洗洗，并且且可以通通過改變變鍵合相相有機官官能團的的類型來來改變分分離的選選擇性。A鍵合合相的性性質(zhì)目前，化化學鍵合合相廣泛泛采用微微粒多孔孔硅膠為為基體，用用烷烴二二甲基氯氯硅烷或或烷氧基基硅烷與與硅膠表表面的游游離硅醇醇基反應應，形成成Si-O-SSi-CC鍵形的的單分子子膜而制制得。硅硅膠表面面的硅醇醇基密度度約為55個/nnm2，由由于空間間位阻效效應（不不可能將將較大的的有機官官能團鍵鍵合到全全部

21、硅醇醇基上）和和其它因因素的影影響，使使得大約約有400500%的硅硅醇基未未反應。殘余的硅硅醇基對對鍵合相相的性能能有很大大影響，特特別是對對非極性性鍵合相相，它可可以減小小鍵合相相表面的的疏水性性，對極極性溶質(zhì)質(zhì)（特別別是堿性性化合物物）產(chǎn)生生次級化化學吸附附，從而而使保留留機制復復雜化（使使溶質(zhì)在在兩相間間的平衡衡速度減減慢，降降低了鍵鍵合相填填料的穩(wěn)穩(wěn)定性。結(jié)果使使堿性組組分的峰峰形拖尾尾）。為為盡量減減少殘余余硅醇基基，一般般在鍵合合反應后后，要用用三甲基基氯硅烷烷(TMMCS)等進行行鈍化處處理，稱稱封端（或或稱封尾尾、封頂頂，ennd-ccapppingg），以以提高鍵鍵合相的的

22、穩(wěn)定性性。另一一方面，也也有些OODS填填料是不不封尾的的，以使使其與水水系流動動相有更更好的“濕濕潤”性性能。由于不同同生產(chǎn)廠廠家所用用的硅膠膠、硅烷烷化試劑劑和反應應條件不不同，因因此具有有相同鍵鍵合基團團的鍵合合相，其其表面有有機官能能團的鍵鍵合量往往往差別別很大，使使其產(chǎn)品品性能有有很大的的不同。鍵合相相的鍵合合量常用用含碳量量(C%)來表表示，也也可以用用覆蓋度度來表示示。所謂謂覆蓋度度是指參參與反應應的硅醇醇基數(shù)目目占硅膠膠表面硅硅醇基總總數(shù)的比比例。pH值對對以硅膠膠為基質(zhì)質(zhì)的鍵合合相的穩(wěn)穩(wěn)定性有有很大的的影響，一一般來說說，硅膠膠鍵合相相應在ppH=228的的介質(zhì)中中使用。B鍵

23、合合相的種種類化學鍵合合相按鍵鍵合官能能團的極極性分為為極性和和非極性性鍵合相相兩種。常用的極極性鍵合合相主要要有氰基基(-CCN)、氨基(-NHH2)和和二醇基基(DIIOL)鍵合相相。極性性鍵合相相常用作作正相色色譜，混混合物在在極性鍵鍵合相上上的分離離主要是是基于極極性鍵合合基團與與溶質(zhì)分分子間的的氫鍵作作用，極極性強的的組分保保留值較較大。極極性鍵合合相有時時也可作作反相色色譜的固固定相。常用的非非極性鍵鍵合相主主要有各各種烷基基(C11C118)和和苯基、苯甲基基等，以以C188應用最最廣。非非極性鍵鍵合相的的烷基鏈鏈長對樣樣品容量量、溶質(zhì)質(zhì)的保留留值和分分離選擇擇性都有有影響，一一

24、般來說說，樣品品容量隨隨烷基鏈鏈長增加加而增大大，且長長鏈烷基基可使溶溶質(zhì)的保保留值增增大，并并常?？煽筛纳品址蛛x的選選擇性；但短鏈鏈烷基鍵鍵合相具具有較高高的覆蓋蓋度，分分離極性性化合物物時可得得到對稱稱性較好好的色譜譜峰。苯苯基鍵合合相與短短鏈烷基基鍵合相相的性質(zhì)質(zhì)相似。另外C118柱穩(wěn)穩(wěn)定性較較高，這這是由于于長的烷烷基鏈保保護了硅硅膠基質(zhì)質(zhì)的緣故故，但CC18基基團空間間體積較較大，使使有效孔孔徑變小小，分離離大分子子化合物物時柱效效較低。C固定定相的選選擇分離中等等極性和和極性較較強的化化合物可可選擇極極性鍵合合相。氰氰基鍵合合相對雙雙鍵異構(gòu)構(gòu)體或含含雙鍵數(shù)數(shù)不等的的環(huán)狀化化合物的的

25、分離有有較好的的選擇性性。氨基基鍵合相相具有較較強的氫氫鍵結(jié)合合能力，對對某些多多官能團團化合物物如甾體體、強心心甙等有有較好的的分離能能力；氨氨基鍵合合相上的的氨基能能與糖類類分子中中的羥基基產(chǎn)生選選擇性相相互作用用，故被被廣泛用用于糖類類的分析析，但它它不能用用于分離離羰基化化合物，如如甾酮、還原糖糖等，因因為它們們之間會會發(fā)生反反應生成成Schhifff 堿。二醇基基鍵合相相適用于于分離有有機酸、甾體和和蛋白質(zhì)質(zhì)。分離非極極性和極極性較弱弱的化合合物可選選擇非極極性鍵合合相。利利用特殊殊的反相相色譜技技術(shù)，例例如反相相離子抑抑制技術(shù)術(shù)和反相相離子對對色譜法法等，非非極性鍵鍵合相也也可用于

26、于分離離離子型或或可離子子化的化化合物。ODSS(Octaadeccyl sillanee)是應應用最為為廣泛的的非極性性鍵合相相，它對對各種類類型的化化合物都都有很強強的適應應能力。短鏈烷烷基鍵合合相能用用于極性性化合物物的分離離，而苯苯基鍵合合相適用用于分離離芳香化化合物。另外，美美國藥典典對色譜譜法規(guī)定定較嚴，它它規(guī)定了了柱的長長度，填填料的種種類和粒粒度，填填料分類類也較詳詳細，這這樣使色色譜圖易易于重現(xiàn)現(xiàn)；而中中國藥典典僅規(guī)定定填料種種類，未未規(guī)定柱柱的長度度和粒度度，這使使檢驗人人員難于于重現(xiàn)實實驗，在在某些情情況下還還浪費時時間和試試劑。（3）、流動相相A流動動相的性性質(zhì)要求求一

27、個理想想的液相相色譜流流動相溶溶劑應具具有低粘粘度、與與檢測器器兼容性性好、易易于得到到純品和和低毒性性等特征征。選好填料料（固定定相）后后，強溶溶劑使溶溶質(zhì)在填填料表面面的吸附附減少，相相應的容容量因子子k降低低；而較較弱的溶溶劑使溶溶質(zhì)在填填料表面面吸附增增加，相相應的容容量因子子k升高高。因此此，k值值是流動動相組成成的函數(shù)數(shù)。塔板板數(shù)N一一般與流流動相的的粘度成成反比。所以選選擇流動動相時應應考慮以以下幾個個方面：流動相相應不改改變填料料的任何何性質(zhì)。低交聯(lián)聯(lián)度的離離子交換換樹脂和和排阻色色譜填料料有時遇遇到某些些有機相相會溶脹脹或收縮縮，從而而改變色色譜柱填填床的性性質(zhì)。堿堿性流動動

28、相不能能用于硅硅膠柱系系統(tǒng)。酸酸性流動動相不能能用于氧氧化鋁、氧化鎂鎂等吸附附劑的柱柱系統(tǒng)。純度。色譜柱柱的壽命命與大量量流動相相通過有有關(guān)，特特別是當當溶劑所所含雜質(zhì)質(zhì)在柱上上積累時時。必須與與檢測器器匹配。使用UUV檢測測器時，所所用流動動相在檢檢測波長長下應沒沒有吸收收，或吸吸收很小小。當使使用示差差折光檢檢測器時時，應選選擇折光光系數(shù)與與樣品差差別較大大的溶劑劑作流動動相，以以提高靈靈敏度。粘度要要低（應應2ccp）。高粘度度溶劑會會影響溶溶質(zhì)的擴擴散、傳傳質(zhì)，降降低柱效效，還會會使柱壓壓降增加加，使分分離時間間延長。最好選選擇沸點點在1000以以下的流流動相。對樣品品的溶解解度要適適

29、宜。如如果溶解解度欠佳佳，樣品品會在柱柱頭沉淀淀，不但但影響了了純化分分離，且且會使柱柱子惡化化。樣品易易于回收收。應選選用揮發(fā)發(fā)性溶劑劑。B流動動相的選選擇在化學鍵鍵合相色色譜法中中，溶劑劑的洗脫脫能力直直接與它它的極性性相關(guān)。在正相相色譜中中，溶劑劑的強度度隨極性性的增強強而增加加；在反反相色譜譜中，溶溶劑的強強度隨極極性的增增強而減減弱。正相色譜譜的流動動相通常常采用烷烷烴加適適量極性性調(diào)整劑劑。反相色譜譜的流動動相通常常以水作作基礎(chǔ)溶溶劑，再再加入一一定量的的能與水水互溶的的極性調(diào)調(diào)整劑，如如甲醇、乙腈、四氫呋呋喃等。極性調(diào)調(diào)整劑的的性質(zhì)及及其所占占比例對對溶質(zhì)的的保留值值和分離離選擇

30、性性有顯著著影響。一般情情況下，甲甲醇-水水系統(tǒng)已已能滿足足多數(shù)樣樣品的分分離要求求，且流流動相粘粘度小、價格低低，是反反相色譜譜最常用用的流動動相。但但Snyyderr則推薦薦采用乙乙腈-水水系統(tǒng)做做初始實實驗，因因為與甲甲醇相比比，乙腈腈的溶劑劑強度較較高且粘粘度較小小，并可可滿足在在紫外11852055nm處處檢測的的要求，因因此，綜綜合來看看，乙腈腈-水系系統(tǒng)要優(yōu)優(yōu)于甲醇醇-水系系統(tǒng)。在分離含含極性差差別較大大的多組組分樣品品時，為為了使各各組分均均有合適適的k值值并分離離良好，也也需采用用梯度洗洗脫技術(shù)術(shù)。參考資料料：乙腈的毒毒性是甲甲醇的55倍，是是乙醇的的25倍倍。價格格是甲醇醇

31、的67倍。反相色譜譜中，如如果要在在相同的的時間內(nèi)內(nèi)分離同同一組樣樣品，甲甲醇/水水作為沖沖洗劑時時其沖洗洗強度配配比與乙乙腈/水水或四氫氫呋喃/水的沖沖洗強度度配比有有如下關(guān)關(guān)系：C乙腈0.332C 2甲醇醇0.557C甲甲醇C四氫呋呋喃0.666C甲甲醇C為不同同有機溶溶劑與水水混合的的體積百百分含量量。1000%甲甲醇的沖沖洗強度度相當于于89%的乙腈腈/水或或66%的四氫氫呋喃/水的沖沖洗強度度。C流動動相的ppH值采用反相相色譜法法分離弱弱酸（33pKKa77）或弱弱堿（77pKKa88）樣品品時，通通過調(diào)節(jié)節(jié)流動相相的pHH值，以以抑制樣樣品組分分的解離離，增加加組分在在固定相相上

32、的保保留，并并改善峰峰形的技技術(shù)稱為為反相離離子抑制制技術(shù)。對于弱弱酸，流流動相的的pH值值越小，組組分的kk值越大大，當ppH值遠遠遠小于于弱酸的的pKaa值時，弱弱酸主要要以分子子形式存存在；對對弱堿，情情況相反反。分析析弱酸樣樣品時，通通常在流流動相中中加入少少量弱酸酸，常用用50mmmoll/L磷磷酸鹽緩緩沖液和和1%醋醋酸溶液液；分析析弱堿樣樣品時，通通常在流流動相中中加入少少量弱堿堿，常用用50mmmoll/L磷磷酸鹽緩緩沖液和和30mmmoll/L三三乙胺溶溶液。注：流動動相中加加入有機機胺可以以減弱堿堿性溶質(zhì)質(zhì)與殘余余硅醇基基的強相相互作用用，減輕輕或消除除峰拖尾尾現(xiàn)象。所以在

33、在這種情情況下有有機胺（如如三乙胺胺）又稱稱為減尾尾劑或除除尾劑。D流動動相的脫脫氣HPLCC所用流流動相必必須預先先脫氣，否否則容易易在系統(tǒng)統(tǒng)內(nèi)逸出出氣泡，影影響泵的的工作。氣泡還還會影響響柱的分分離效率率，影響響檢測器器的靈敏敏度、基基線穩(wěn)定定性，甚甚至使無無法檢測測。（噪噪聲增大大，基線線不穩(wěn)，突突然跳動動）。此此外，溶溶解在流流動相中中的氧還還可能與與樣品、流動相相甚至固固定相（如如烷基胺胺）反應應。溶解解氣體還還會引起起溶劑ppH的變變化，對對分離或或分析結(jié)結(jié)果帶來來誤差。溶解氧能能與某些些溶劑（如如甲醇、四氫呋呋喃）形形成有紫紫外吸收收的絡(luò)合合物，此此絡(luò)合物物會提高高背景吸吸收（特

34、特別是在在2600nm以以下），并并導致檢檢測靈敏敏度的輕輕微降低低，但更更重要的的是，會會在梯度度淋洗時時造成基基線漂移移或形成成鬼峰（假假峰）。在熒光光檢測中中，溶解解氧在一一定條件件下還會會引起淬淬滅現(xiàn)象象，特別別是對芳芳香烴、脂肪醛醛、酮等等。在某某些情況況下，熒熒光響應應可降低低達955%。在在電化學學檢測中中（特別別是還原原電化學學法），氧氧的影響響更大。除去流動動相中的的溶解氧氧將大大大提高UUV檢測測器的性性能，也也將改善善在一些些熒光檢檢測應用用中的靈靈敏度。常用的的脫氣方方法有：加熱煮煮沸、抽抽真空、超聲、吹氦等等。對混混合溶劑劑，若采采用抽氣氣或煮沸沸法，則則需要考考慮低

35、沸沸點溶劑劑揮發(fā)造造成的組組成變化化。超聲聲脫氣比比較好，110220分鐘鐘的超聲聲處理對對許多有有機溶劑劑或有機機溶劑/水混合合液的脫脫氣是足足夠了（一一般5000mll溶液需需超聲220330miin方可可），此此法不影影響溶劑劑組成。超聲時時應注意意避免溶溶劑瓶與與超聲槽槽底部或或壁接觸觸，以免免玻璃瓶瓶破裂，容容器內(nèi)液液面不要要高出水水面太多多。離線（系系統(tǒng)外）脫脫氣法不不能維持持溶劑的的脫氣狀狀態(tài)，在在你停止止脫氣后后，氣體體立即開開始回到到溶劑中中。在114小小時內(nèi)，溶溶劑又將將被環(huán)境境氣體所所飽和。在線（系系統(tǒng)內(nèi)）脫脫氣法無無此缺點點。最常常用的在在線脫氣氣法為鼓鼓泡，即即在色譜

36、譜操作前前和進行行時，將將惰性氣氣體噴入入溶劑中中。嚴格格來說，此此方法不不能將溶溶劑脫氣氣，它只只是用一一種低溶溶解度的的惰性氣氣體（通通常是氦氦）將空空氣替換換出來。此外還還有在線線脫氣機機。一般說來來有機溶溶劑中的的氣體易易脫除，而而水溶液液中的氣氣體較頑頑固。在在溶液中中吹氦是是相當有有效的脫脫氣方法法，這種種連續(xù)脫脫氣法在在電化學學檢測時時經(jīng)常使使用。但但氦氣昂昂貴，難難于普及及。E流動動相的濾濾過所有溶劑劑使用前前都必須須經(jīng)0.45&miccro;m（或或0.222&mmicrro;mm）濾過過，以除除去雜質(zhì)質(zhì)微粒，色色譜純試試劑也不不例外（除除非在標標簽上標標明“已已濾過”）。用

37、濾膜過過濾時，特特別要注注意分清清有機相相（脂溶溶性）濾濾膜和水水相（水水溶性）濾濾膜。有有機相濾濾膜一般般用于過過濾有機機溶劑，過過濾水溶溶液時流流速低或或濾不動動。水相相濾膜只只能用于于過濾水水溶液，嚴嚴禁用于于有機溶溶劑，否否則濾膜膜會被溶溶解！溶溶有濾膜膜的溶劑劑不得用用于HPPLC。對于混混合流動動相，可可在混合合前分別別濾過，如如需混合合后濾過過，首選選有機相相濾膜?，F(xiàn)在已已有混合合型濾膜膜出售。F流動動相的貯貯存流動相一一般貯存存于玻璃璃、聚四四氟乙烯烯或不銹銹鋼容器器內(nèi)，不不能貯存存在塑料料容器中中。因許許多有機機溶劑如如甲醇、乙酸等等可浸出出塑料表表面的增增塑劑，導導致溶劑劑

38、受污染染。這種種被污染染的溶劑劑如用于于HPLLC系統(tǒng)統(tǒng)，可能能造成柱柱效降低低。貯存存容器一一定要蓋蓋嚴，防防止溶劑劑揮發(fā)引引起組成成變化，也也防止氧氧和二氧氧化碳溶溶入流動動相。磷酸鹽、乙酸鹽鹽緩沖液液很易長長霉，應應盡量新新鮮配制制使用，不不要貯存存。如確確需貯存存，可在在冰箱內(nèi)內(nèi)冷藏，并并在3天天內(nèi)使用用，用前前應重新新濾過。容器應應定期清清洗，特特別是盛盛水、緩緩沖液和和混合溶溶液的瓶瓶子，以以除去底底部的雜雜質(zhì)沉淀淀和可能能生長的的微生物物。因甲甲醇有防防腐作用用，所以以盛甲醇醇的瓶子子無此現(xiàn)現(xiàn)象。G鹵代代有機溶溶劑應特特別注意意的問題題鹵代溶劑劑可能含含有微量量的酸性性雜質(zhì)，能能

39、與HPPLC系系統(tǒng)中的的不銹鋼鋼反應。鹵代溶溶劑與水水的混合合物比較較容易分分解，不不能存放放太久。鹵代溶溶劑（如如CCll4、CCHCll3等）與與各種醚醚類（如如乙醚、二異丙丙醚、四四氫呋喃喃等）混混合后，可可能會反反應生成成一些對對不銹鋼鋼有較大大腐蝕性性的產(chǎn)物物，這種種混合流流動相應應盡量不不采用，或或新鮮配配制。此此外，鹵鹵代溶劑劑（如CCH2CCl2）與與一些反反應性有有機溶劑劑（如乙乙腈）混混合靜置置時，還還會產(chǎn)生生結(jié)晶。總之，鹵鹵代溶劑劑最好新新鮮配制制使用。如果是是和干燥燥的飽和和烷烴混混合，則則不會產(chǎn)產(chǎn)生類似似問題。HHPPLC用用水HPLCC應用中中要求超超純水，如如檢測

40、器器基線的的校正和和反相柱柱的洗脫脫。進行HPPLC、GC、電泳和和熒光分分析，或或在涉及及組織培培養(yǎng)時，沒沒有有機機物污染染是非常常重要的的。測高高錳酸鉀鉀顏色保保留時間間的定性性方法反反應慢，對對很低水水平的有有機物（對對HPLLC可能能還是太太高了）不不夠靈敏敏，特別別是不能能定量。總有機機碳(TTOC)分析儀儀（把有有機物氧氧化成CCO2，測測游離的的CO22）常用用于I類類（NCCCLSS）水中中低濃度度有機物物的測定定。I類水標標準：NCCLLSASTMM電阻率，MMccm，225，最最小10.0018.00硅酸鹽，mmg/LL，最大大0.0550.0003微粒，&miccro;m

41、濾器器0.2220.2微生物，CCFU/ml10分三檔美國藥典典24版版（20000年年）要求求TOCC0.5 mmg/LL（用標標準蔗糖糖溶液11.199 mgg/L），電電導率在在室溫ppH 66時22.4 &miicroo;S/cm（即即0.42 Mcm）。HPLLC級水水增加吸吸收特性性：在11cm池池中，用用超純水水作空白白，在1190nnm、2200nnm和22504000nm的的吸收度度分別不不得過00.011、0.01和和0.005。增增加不揮揮發(fā)物，3pppm（中中國藥典典純水10pppm）。二、LaabAllliaancee 液相相色譜系系統(tǒng)組成成泵進樣器色譜柱（柱柱溫箱）

42、檢測器工作站柱后衍生生裝置調(diào)節(jié)流速開泵/關(guān)泵模式切換出口單向閥入口單向閥泵頭旁通閥出口過濾器Seriies 泵前前視圖 手動進樣樣閥AS10000/30000自動動進樣器器色譜柱201型型檢測器器LabAAlliiancce 工工作站界界面三、LaabAllliaancee液相色色譜系統(tǒng)統(tǒng)常見使使用故障障及維護護1、泵的的使用和和維護注注意事項項為了延長長泵的使使用壽命命和維持持其輸液液的穩(wěn)定定性，必必須按照照下列注注意事項項進行操操作：防止任任何固體體微粒進進入泵體體，因為為塵?；蚧蚱渌稳魏坞s質(zhì)質(zhì)微粒都都會磨損損柱塞、密封圈圈、缸體體和單向向閥，因因此應預預先除去去流動相相中的任任何固體體

43、微粒。流動相相最好用用微孔濾膜膜（0.2或0.445umm）過濾。泵泵的入口口都應連連接0.2umm過濾頭頭（或片片）。泵泵的濾頭頭應經(jīng)常常清洗或或更換。流動相相不應含含有任何何腐蝕性性物質(zhì)，含含有緩沖沖液的流流動相不不應保留留在泵內(nèi)內(nèi)，尤其其是在停停泵過夜夜或更長長時間的的情況下下。如果果將含緩緩沖液的的流動相相留在泵泵內(nèi)，由由于蒸發(fā)發(fā)或泄漏漏，甚至至只是由由于溶液液的靜置置，就可可能析出出鹽的微微細晶體體，這些些晶體將將和上述述固體微微粒一樣樣損壞密密封環(huán)和和柱塞等等。因此此，必須須泵入純純水將泵泵充分清清洗后，再再換成適適合于色色譜柱保保存和有有利于泵泵維護的的溶劑（對對于反相相鍵合硅硅

44、膠固定定相，可可以是甲甲醇或甲甲醇-水水）。泵工作作時要留留心防止止溶劑瓶瓶內(nèi)的流流動相被被用完，否否則空泵泵運轉(zhuǎn)也也會磨損損柱塞、缸體或或密封環(huán)環(huán)，最終終產(chǎn)生漏漏液。輸液泵泵的工作作壓力決決不要超超過規(guī)定定的最高高壓力，否否則會使使高壓密密封環(huán)變變形，產(chǎn)產(chǎn)生漏液液。流動相相應該先先脫氣，以以免在泵泵內(nèi)產(chǎn)生生氣泡，影影響流量量的穩(wěn)定定性，如如果有大大量氣泡泡，泵就就無法正正常工作作。如果輸液液泵產(chǎn)生生故障，須須查明原原因，采采取相應應措施排排除故障障：沒有流動動相流出出，又無無壓力指指示。原原因可能能是泵內(nèi)內(nèi)有大量量氣體，這這時可打打開排氣氣閥，用用一個550mll針筒在在泵出口口處抽出出氣體

45、。另一個個可能原原因是密密封環(huán)磨磨損，需需更換。壓力和和流量不不穩(wěn)。原原因可能能是氣泡泡，需要要排除；或者是是單向閥閥內(nèi)有異異物，可可卸下單單向閥，浸浸入甲醇醇水溶液液中超聲聲清洗。有時可可能是流流動相濾濾頭內(nèi)有氣氣泡，或或被鹽的的微細晶晶?；蜃套躺奈⑽⑸锊坎糠侄氯?，這時時，可卸卸下濾頭浸入甲醇醇水溶液液內(nèi)超聲聲除氣泡泡。壓力過過高的原原因是管管路被堵堵塞，需需要清除除和清洗洗。壓力力降低的的原因則則可能是是管路有有泄漏。檢查堵堵塞或泄泄漏時應應逐段進進行。2、手動動進樣閥和和自動進進樣器。現(xiàn)在大都都使用六六通進樣樣閥或自自動進樣樣器。進進樣裝置置要求：密封性性好，死死體積小小，重復復性

46、好，保保證中心心進樣，進進樣時對對色譜系系統(tǒng)的壓壓力、流流量影響響小。手動進樣樣閥和自動動進樣器器的維護護注意事事項包括括：樣樣品溶液液進樣前前必須用用0.445umm濾膜過過濾，以以減少微微粒對進進樣閥的的磨損。轉(zhuǎn)動動閥芯時時不能太太慢，更更不能停停留在中中間位置置，否則則流動相相受阻，使使泵內(nèi)壓壓力劇增增，甚至至超過泵泵的最大大壓力；再轉(zhuǎn)到到進樣位位時，過過高的壓壓力將使使柱頭損損壞。為防止止緩沖鹽鹽和樣品品殘留在在進樣閥閥中，每每次分析析結(jié)束后后應沖洗洗進樣閥閥。通常?？捎盟疀_洗，或或先用能能溶解樣樣品的溶溶劑沖洗洗，再用用水沖洗洗。3、色譜譜柱的維維護色譜是一一種分離離分析手手段，分

47、分離是核核心，因因此擔負負分離作作用的色色譜柱是是色譜系系統(tǒng)的心心臟。對對色譜柱柱的要求求是柱效效高、選選擇性好好，分析析速度快快等。市市售的用用于HPPLC的的各種微微粒填料料如多孔孔硅膠以以及以硅硅膠為基基質(zhì)的鍵鍵合相、氧化鋁鋁、有機機聚合物物微球（包包括離子子交換樹樹脂）、多孔碳碳等，其其粒度一一般為33,5,7,110mm等，柱柱效理論論值可達達5116萬/米。對對于一般般的分析析只需550000塔板數(shù)數(shù)的柱效效；對于于同系物物分析，只只要5000即可可；對于于較難分分離物質(zhì)質(zhì)對則可可采用高高達2萬萬的柱子子，因此此一般110330cmm左右的的柱長就就能滿足足復雜混混合物分分析的需需

48、要。柱效受柱柱內(nèi)外因因素影響響，為使使色譜柱柱達到最最佳效率率，除柱柱外死體體積要小小外，還還要有合合理的柱柱結(jié)構(gòu)（盡盡可能減減少填充充床以外外的死體體積）及及裝填技技術(shù)。即即使最好好的裝填填技術(shù)，在在柱中心心部位和和沿管壁壁部位的的填充情情況總是是不一樣樣的，靠靠近管壁壁的部位位比較疏疏松，易易產(chǎn)生溝溝流，流流速較快快，影響響沖洗劑劑的流形形，使譜譜帶加寬寬，這就就是管壁壁效應。這種管管壁區(qū)大大約是從從管壁向向內(nèi)算起起30倍倍粒徑的的厚度。在一般般的液相相色譜系系統(tǒng)中，柱柱外效應應對柱效效的影響響遠遠大大于管壁壁效應。1柱的的構(gòu)造色譜柱由由柱管、壓帽、卡套（密密封環(huán)）、篩板（濾濾片）、接頭、

49、螺絲等等組成。柱管多多用不銹銹鋼制成成，壓力力不高于于70 kg/cm22時，也也可采用用厚壁玻玻璃或石石英管，管管內(nèi)壁要要求有很很高的光光潔度。為提高高柱效，減減小管壁壁效應，不不銹鋼柱柱內(nèi)壁多多經(jīng)過拋拋光。也也有人在在不銹鋼鋼柱內(nèi)壁壁涂敷氟氟塑料以以提高內(nèi)內(nèi)壁的光光潔度，其其效果與與拋光相相同。還還有使用用熔融硅硅或玻璃璃襯里的的，用于于細管柱柱。色譜譜柱兩端端的柱接接頭內(nèi)裝裝有篩板板，是燒燒結(jié)不銹銹鋼或鈦鈦合金，孔孔徑0.2220&mmicrro;mm(510&miccro;m)，取取決于填填料粒度度，目的的是防止止填料漏漏出。色譜柱按按用途可可分為分分析型和和制備型型兩類，尺尺寸規(guī)格格

50、也不同同：常常規(guī)分析析柱（常常量柱），內(nèi)內(nèi)徑25mmm（常用用4.66mm，國國內(nèi)有44mm和和5mmm），柱柱長100300cm；窄徑徑柱（nnarrrow borre，又又稱細管管徑柱、半微柱柱semmi-mmicrrocoolummn），內(nèi)內(nèi)徑12mmm，柱長長1020ccm；毛細管管柱（又又稱微柱柱miccroccoluumn），內(nèi)內(nèi)徑0.200.5mmm；半制備備柱，內(nèi)內(nèi)徑55mm；實驗驗室制備備柱，內(nèi)內(nèi)徑200400mm，柱柱長100300cm；生產(chǎn)產(chǎn)制備柱柱內(nèi)徑可可達幾十十厘米。柱內(nèi)徑徑一般是是根據(jù)柱柱長、填填料粒徑徑和折合合流速來來確定，目目的是為為了避免免管壁效效應。2柱的的

51、發(fā)展方方向因強調(diào)分分析速度度而發(fā)展展出短柱柱，柱長長3110cmm，填料料粒徑223&miccro;m。為為提高分分析靈敏敏度，與與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而而發(fā)展出出窄徑柱柱、毛細細管柱和和內(nèi)徑小小于0.2mmm的微徑徑柱（mmicrroboore）。細管徑徑柱的優(yōu)優(yōu)點是：節(jié)省省流動相相；靈靈敏度增增加；樣品量量少；能使用用長柱達達到高分分離度；容易易控制柱柱溫；易于實實現(xiàn)LCC-MSS聯(lián)用。但由于柱柱體積越越來越小小，柱外外效應的的影響就就更加顯顯著，需需要更小小池體積積的檢測測器（甚甚至采用用柱上檢檢測），更更小死體體積的柱柱接頭和和連接部部件。配配套使用用的設(shè)備備應具備備如下性性能：輸輸液泵

52、能能精密輸輸出11000&miicroo;l/minn的低流流量，進進樣閥能能準確、重復地地進樣微微小體積積的樣品品。且因因上樣量量小，要要求高靈靈敏度的的檢測器器，電化化學檢測測器和質(zhì)質(zhì)譜儀在在這方面面具有突突出優(yōu)點點。3色譜譜柱的使使用和維維護注意意事項色譜柱的的正確使使用和維維護十分分重要，稍稍有不慎慎就會降降低柱效效、縮短短使用壽壽命甚至至損壞。在色譜譜操作過過程中，需需要注意意下列問問題，以以維護色色譜柱。避免免壓力和和溫度的的急劇變變化及任任何機械械震動。溫度的的突然變變化或者者使色譜譜柱從高高處掉下下都會影影響柱內(nèi)內(nèi)的填充充狀況；柱壓的的突然升升高或降降低也會會沖動柱柱內(nèi)填料料，因此此在調(diào)節(jié)節(jié)流速時時應該緩緩慢進行行，在閥閥進樣時時閥的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動不能能過緩（如如前所述述）。應逐逐漸改變變?nèi)軇┑牡慕M成，特特別是反反相色譜譜中，不不應直接接從有機機溶劑改改變?yōu)槿渴撬粗嗳?。一般般說來色色譜柱不不能反沖沖，只有有生產(chǎn)者者指明該該柱可以以反沖時時，才可可以反沖沖除去留留在柱頭頭的雜質(zhì)質(zhì)。否則則反沖會會迅速降降低柱效效。選擇擇使用適適宜的流流動相（尤尤其是ppH），以以避免固固定相被被破壞。有時可可以在進進樣器前前面連接接一預柱柱，分析析柱是鍵鍵合硅膠膠時，預預柱為硅硅膠，可可使流動動相在進進入分析析柱之前前預先被被硅膠“飽