類彈性蛋白的分子設計非色譜純化與分子動力學模擬位論文

1、 .56/64碩士學位論文類彈性蛋白的分子設計、非色譜純化與分子動力學模擬原創(chuàng)性聲明本人聲明茲呈交的學位論文是本人在導師指導下完成的研究成果。論文寫作中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究容，如參考他人或集體的科研成果，均在論文中以明確的方式說明。本人依法享有和承擔由此論文所產(chǎn)生的權利和責任。學位論文作者簽名：日期：學位論文使用授權聲明本人同意授權華僑大學有權保留并向國家機關或機構(gòu)送交學位論文和磁盤，允許學位論文被查閱和借閱。論文作者簽名：指導教師簽名：簽名日期：簽名日期：Dissertation Submitted to the Academic Degree Committee of Hua

2、QiaoUniversityMolecular design, non-chromatographic purification and dynamics simulations ofelastin-like peptidesByKaizong HuangIn Candidacy for the Masters Degree of Biochemistry and Molecular BiologySupervised by Assistant Professor Guang-ya ZhangHuaQiaoUniversityNovember 2011摘要類彈性蛋白多肽(Elastin-lik

3、e polypeptides，ELPs)，是一種非常重要的具有彈性功能的，且對環(huán)境溫度有很大敏感性的生物高分子，利用類彈性蛋白的可逆相變特性，使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應用。ELPs的相變溫度是定量描述其相變溫度性質(zhì)最便利的參數(shù)，通過相變溫度實測值探討與其序列組成、每一單體的Xaa數(shù)量、濃度等因素間的關系具有重要意義。將偽氨基酸組成中的的相關系數(shù)部分作為類彈性蛋白的特征向量，從類彈性蛋白序列出發(fā)，利用最小中位方差回歸，找出其序列相關系數(shù)的最佳階數(shù)。運用均勻設計分別對支持向量機與BP神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)進行優(yōu)化，并進行交叉驗證，結(jié)果表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡獲得的預測模型最佳，其絕對誤

4、差為0.39，均方根誤差為0.89.從頭設計了類彈性蛋白多肽的序列并人工合成其編碼基因片段，克隆至改造后的表達載體pET-22b中，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21(DE3)中并誘導表達，采用可逆相變循環(huán)經(jīng)高速離心對其進行純化，利用SDS與色氨酸標準曲線對ELPs進行分析與定量，并考察了五種陰離子與三種陽離子與濃度對類彈性蛋白相變溫度的影響。結(jié)果表明：0.4 mM的Na2CO3能使25M ELPKV8F-20相變溫度降低至19，此ELPs序列有望開發(fā)成一新型純化標簽，為今后重組蛋白的非色譜分離純化奠定基礎。通過分子動力學模擬探討類彈性蛋白ELPs發(fā)生可逆相變 (ITT， inverse

5、 temperature transition)的分子機理與預測ELPKV8F-20的相變溫度。隨著溫度的升高，類彈性蛋白經(jīng)歷可逆相變，由舒展的構(gòu)象過渡到折疊構(gòu)象。在300K400k間5個不同的溫度下，對ELPKV8F-20在水溶液與1M的NaCl溶液各進行9ns的模擬。模擬過程中，ELPKV8F-20 在水溶液與1M的NaCl溶液均發(fā)生疏水縮聚，推斷在水溶液條件下，ELPKV8F-20在375K時發(fā)生相變，400K時ELPs已經(jīng)變性；在水溶液條件下，ELPKV8F-20在350K時發(fā)生相變，375K時ELPs已經(jīng)變性。通過分析，推斷疏水作用與結(jié)合水的減少在ELPKV8F-20的相變過程中起到

6、關鍵作用。此外，比較不同溫度下蛋白的縮聚程度，并結(jié)合實驗結(jié)果，推斷出蛋白的相變溫度在102左右。本論文完成了一次從ELPs的相變溫度預測到基因的從頭合成并表達的過程，考察不同種鹽對ELPKV8F-20相變溫度的影響.使用NAMD對ELPKV8F-20進行分子動力學模擬，并與實驗結(jié)果結(jié)合，完成了一次ELPs相變機理與鹽離子降低相變溫度機理的探討?？偨Y(jié)了相關結(jié)論，這可為今后利用ELPs純化重組蛋白提供經(jīng)驗積累和理論依據(jù)。關鍵詞：類彈性蛋白多肽，相變溫度，非色譜純化，分子動力學模擬，相變機理AbstractElastin-like polypeptides (Elastin-like polypep

7、tides, ELPs) are elasticity and environmentally responsive biopolymers.Due to their reversible phase transition characteristic, Elastin-like polypeptides (ELPs) have been used for a number of applications, such as protein purification, drug delivery, and tissue engineering.For the ELPs, the transiti

8、on temperature () is the most convenient parameters for quantificational description of the ELP properties. It is of great importance to explore the relationship between the transition temperature and the sequence characteristics, the number of Xaa of each monomer and the concentration of ELP. The b

9、est order of the correlation coefficient for pseudo-amino acid composition was obtained by using Least Median of Squares Regression from sequence. The uniform design was used to optimize the running parameters and leave-one out cross-validation was carried out to evaluate the model of back propagati

10、on neural network (BPNN) and support vector machines, respectively. The results showed that the predicted model obtained by BPNN was the best, of which the mean absolute error and root mean squared error was 0.39and 0.89, respectively.Then, we de novo designed a novel ELPs gene and cloned it into th

11、e modified expression vector pET-22b. Then, we transformed the recombinant expression vector pET-22b-ELPs into Escherichia coli BL21(DE3). Upon induction by Isopropyl -D-Thiogalactoside (IPTG), ELPs was expressed and purified by a non-chromatographic purification method named inverse temperature cyc

12、ling. The influences of salts types and concentrations on ELPs were also determined. The results showed that the transition temperature of the ELPKV8F-20 decreased to 19 by 0.4 mmol/L Na2CO3. Due to its small molecular weight and sensitivity to salt, the ELPs might be a useful purification tag, whic

13、h can provide a reliable and simple non-chromatographic method for purification of the recombinant protein by inverse transition cycling.Finally，we concerned on the molecular mechanism for ITT(Inverse temperature transition) of ELPs(elastin-like peptides)，and prediction for the transition temperatur

14、e of ELPKV8F-20. As the temperature increased, ELPs undergoes changing from a extended to folded conformation. Molecular dynamic simulations were performed 9ns in explicit water and 1M NaCl solution for ELPKV8F-20 at five different temperature between 300K and 400K. During simulation processing, ELP

15、KV8F-20 had hydrophobic collapse in explicit water and 1M NaCl solution.According to simulation result,we concluded that ELPKV8F-20 had undergone phase transition at the 375K and suffered from denaturalization at 400K when the ELPKV8F-20 was in inaqueous solutions; ELPKV8F-20 had undergone phase tra

16、nsition at the 350K and suffered from denaturalization at 375K when the ELPKV8F-20 was in 1M NaCl solutions.We believed that hydrophobic collapse and decreasing quantity of combinational water played a key role for ITT. At addition,analysed degree of hydrophobic collapse at different temperature,and

17、combining with experiment result,which indicated the transition temperature for ELPKV8F-20 is about 102.In this paper, we completed predicting the transition temperature of ELPs, and de novo synthesis and expressed a ELPs gene(ELPKV8F-20), determined effection of different kinds of salt on transitio

18、n temperature for ELP KV8F-20. Did molecular dynamics simulations on the ELPKV8F-20 by NAMD, whose result combined with experimental results, discussed mechanism that the ELPs undergone Inverse temperature transition and decreased transition temperature by NaCl. Our results can provide the theoretic

19、al basis of experience about using ELPs tag to purify the recombinant protein.Keywords: elastin-like peptides；transition temperature；non-chromatographic purification; molecular dynamics simulations ;transition principle TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc289871892摘要 PAGEREF _Toc289871892 h IHYPERLINK l

20、 _Toc289871893Abstract PAGEREF _Toc289871893 h IIHYPERLINK l _Toc289871894第一章 緒論 PAGEREF _Toc289871894 h 1HYPERLINK l _Toc2898718951.1類彈性蛋白多肽的概述 PAGEREF _Toc289871895 h 1HYPERLINK l _Toc2898718961.1.1類彈性蛋白多肽簡介 PAGEREF _Toc289871896 h 1HYPERLINK l _Toc2898718971.1.2類彈性蛋白多肽的相變機理 PAGEREF _Toc289871897

21、h 1HYPERLINK l _Toc2898718981.1.3影響Tt的各種因素 PAGEREF _Toc289871898 h 2HYPERLINK l _Toc2898718991.1.4類彈性蛋白多肽的合成方法 PAGEREF _Toc289871899 h 4HYPERLINK l _Toc2898719001.1.5類彈性蛋白多肽的應用 PAGEREF _Toc289871900 h 5HYPERLINK l _Toc2898719011.1.6動力學模擬方法的應用 PAGEREF _Toc289871901 h 8HYPERLINK l _Toc2898719021.2課題來源

22、與研究意義 PAGEREF _Toc289871902 h 9HYPERLINK l _Toc289871903第二章 使用偽氨基酸組成和BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測類彈性蛋白多肽的相變溫度 PAGEREF _Toc289871903 h 10HYPERLINK l _Toc2898719042.1引言 PAGEREF _Toc289871904 h 10HYPERLINK l _Toc2898719052.2實驗材料 PAGEREF _Toc289871905 h 10HYPERLINK l _Toc2898719062.2.1數(shù)據(jù)來源與預測工具 PAGEREF _Toc289871906 h 10HY

23、PERLINK l _Toc2898719072.3結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc289871907 h 12HYPERLINK l _Toc2898719082.3.1 氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)的選擇 PAGEREF _Toc289871908 h 12HYPERLINK l _Toc2898719092.3.2利用支持向量機預測相變溫度 PAGEREF _Toc289871909 h 13HYPERLINK l _Toc2898719102.3.3利用神經(jīng)網(wǎng)絡預測相變溫度 PAGEREF _Toc289871910 h 15HYPERLINK l _Toc2898719112.4小結(jié) P

24、AGEREF _Toc289871911 h 16HYPERLINK l _Toc289871912第三章 類彈性蛋白多肽的從頭設計、非色譜純化與鹽效應研究 PAGEREF _Toc289871912 h 17HYPERLINK l _Toc2898719133.1 ELPsKV8F-20的表達策略 PAGEREF _Toc289871913 h 17HYPERLINK l _Toc2898719143.1.1 ELPs的命名 PAGEREF _Toc289871914 h 17HYPERLINK l _Toc2898719153.1.2表達載體與宿主的選擇 PAGEREF _Toc28987

25、1915 h 17HYPERLINK l _Toc2898719163.1.3表達質(zhì)粒pET-22b-KV8F-20的構(gòu)建 PAGEREF _Toc289871916 h 18HYPERLINK l _Toc2898719173.2實驗材料 PAGEREF _Toc289871917 h 18HYPERLINK l _Toc2898719183.2.1菌種和質(zhì)粒 PAGEREF _Toc289871918 h 18HYPERLINK l _Toc2898719193.2.2培養(yǎng)基 PAGEREF _Toc289871919 h 19HYPERLINK l _Toc2898719203.2.3工

26、具酶、DNA Marker和試劑盒 PAGEREF _Toc289871920 h 19HYPERLINK l _Toc2898719213.2.4主要試劑 PAGEREF _Toc289871921 h 19HYPERLINK l _Toc2898719223.2.5主要儀器 PAGEREF _Toc289871922 h 20HYPERLINK l _Toc2898719233.2.6試劑的配制 PAGEREF _Toc289871923 h 20HYPERLINK l _Toc2898719243.3實驗方法 PAGEREF _Toc289871924 h 21HYPERLINK l _

27、Toc2898719253.3.1 ELPKV8F-20的克隆 PAGEREF _Toc289871925 h 21HYPERLINK l _Toc2898719263.3.1.1重組克隆質(zhì)粒與表達載體的雙酶切 PAGEREF _Toc289871926 h 21HYPERLINK l _Toc2898719273.3.2 ELPsKV8F-20的表達與純化 PAGEREF _Toc289871927 h 23HYPERLINK l _Toc2898719283.4結(jié)果與討論 PAGEREF _Toc289871928 h 26HYPERLINK l _Toc2898719293.4.1 pU

28、C-19-ELPs的酶切與ELPs基因片段回收 PAGEREF _Toc289871929 h 26HYPERLINK l _Toc2898719303.4.2 ELPKV8F-20的誘導表達與純化 PAGEREF _Toc289871930 h 27HYPERLINK l _Toc2898719313.4.3 ELPKV8F-20相變溫度的影響因素考察 PAGEREF _Toc289871931 h 27HYPERLINK l _Toc2898719323.5本章小結(jié) PAGEREF _Toc289871932 h 31HYPERLINK l _Toc289871933第四章 類彈性蛋白多肽

29、的分子動力學模擬 PAGEREF _Toc289871933 h 32HYPERLINK l _Toc2898719344.1 NAMD模擬方法 PAGEREF _Toc289871934 h 32HYPERLINK l _Toc2898719354.1.1 NAMD軟件 PAGEREF _Toc289871935 h 32HYPERLINK l _Toc2898719364.1.2基本流程 PAGEREF _Toc289871936 h 32HYPERLINK l _Toc2898719374.1.3結(jié)果分析方法 PAGEREF _Toc289871937 h 33HYPERLINK l _

30、Toc2898719384.2研究容與意義 PAGEREF _Toc289871938 h 33HYPERLINK l _Toc2898719394.2.1 ELPsKV8F-20的MD模擬的建立 PAGEREF _Toc289871939 h 34HYPERLINK l _Toc2898719404.3動力學模擬的結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc289871940 h 36HYPERLINK l _Toc2898719414.3.1 RMSD值分析 PAGEREF _Toc289871941 h 36HYPERLINK l _Toc2898719424.3.2 氫鍵數(shù)目分析 PAGERE

31、F _Toc289871942 h 38HYPERLINK l _Toc2898719434.3.3 末端距值分析 PAGEREF _Toc289871943 h 42HYPERLINK l _Toc2898719444.3.4 溶劑可與性表面積分析 PAGEREF _Toc289871944 h 43HYPERLINK l _Toc2898719454.4本章小結(jié) PAGEREF _Toc289871945 h 45HYPERLINK l _Toc289871946第五章 結(jié)論 PAGEREF _Toc289871946 h 46HYPERLINK l _Toc289871947第六章 研究

32、展望 PAGEREF _Toc289871947 h 47HYPERLINK l _Toc289871948參考文獻 PAGEREF _Toc289871948 h 48HYPERLINK l _Toc289871949攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況 PAGEREF _Toc289871949 h 52HYPERLINK l _Toc289871950致 PAGEREF _Toc289871950 h 53HYPERLINK l _Toc289871951附圖 PAGEREF _Toc289871951 h 54第一章緒論1.1類彈性蛋白多肽的概述1.1.1類彈性蛋白多肽簡介類彈性蛋白多肽(

33、Elastin-like polypeptides，ELPs)是一種具有彈性功能且對環(huán)境溫度非常敏感的人造基因工程蛋白質(zhì)聚合物。其結(jié)構(gòu)主要由五肽重復序列單元構(gòu)成，即（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly, VPGXG），源自于彈性蛋白的疏水區(qū)域，其中 Xaa可以是除 Pro以外任一氨基酸1。ELPs有一個可逆相變過程，稱之為反轉(zhuǎn)變溫度（inverse temperature transition，ITT），若環(huán)境溫度低于該相變溫度（transition temperature，），該多肽在水溶液中為高度可溶，聚合物鏈保持無序結(jié)構(gòu)，且相當伸展。相反，當溫度高于時，該含水的多肽鏈結(jié)構(gòu)就瓦解，并開

34、始聚集，形成一個富含 ELPs的聚集物。利用類彈性蛋白的可逆相變特性,使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應用21.1.2類彈性蛋白多肽的相變機理相變過程是 ELPs在水溶液中絮聚的過程，伴有伸展型多肽鏈的瓦解并與溶液相分離3-4。從構(gòu)象變化上，Urry認為（VPGVG）重復單元在Pro-Gly處結(jié)構(gòu)為-轉(zhuǎn)角（- turn），而重復的-轉(zhuǎn)角形成右手螺旋的-螺旋（right-handed helix termed-spiral），而-螺旋可用來解釋效應與機理（-effect與 mechanism）；在分子水平上，當溫度高于時，部分較為伸展且無序的構(gòu)象轉(zhuǎn)變成較為緊湊的-螺旋5-6

35、。Dybal 7認為發(fā)生相變時，在Pro與Val殘基處會形成(II)-轉(zhuǎn)角；但Gross 8等認為，在整個相變的過程中，聚合五肽(GVGVP)n并不存在-螺旋構(gòu)像，而-折疊（- sheets）則是其最基本的規(guī)則構(gòu)象（the basic regular part of conformation）；Serrano等9研究表明升高溫度會使得-螺旋聚集在一起，在1的相變溫度圍，他們觀測到有25的氨基酸在鏈形成了-折疊。 Urry從振動熵的形成與疏水性聚集兩方面來闡述(GVGVP)n的相變機理。在(GVGVP)n疏水區(qū)域有序體運動鏈節(jié)會產(chǎn)生相互作用，由于疏水區(qū)域部運動鏈的阻尼作用，疏水性區(qū)域聚集會引起振

36、動熵的上升，疏水性區(qū)域聚集的發(fā)生是伴隨著蛋白疏水部位共振，而溫度在一定圍上升時有助于疏水作用加強。在相變發(fā)生時，增加溫度會使在水環(huán)境中的聚合物有序性得到加強，而包圍在疏水性殘基的有序水分子變成無序狀態(tài)，此時疏水性基團將與水溶液相分離，結(jié)果在整個變化過程中是趨于無序性的，這與熱力學第二定律相吻合10-11。從能量變化角度來看，相變過程是一個復雜多步的轉(zhuǎn)變，在該轉(zhuǎn)變過程中，某些步驟是吸熱的，這可能與疏水性水合作用的損耗有關；而其它步驟均是放熱的，結(jié)果導致 ELPs多肽鏈以物理方式（德華力）聚集在一起，但在這一過程中ELPs放熱組份數(shù)量還不與吸熱組份數(shù)量三分之一12。1.1.3影響Tt的各種因素1.

37、1.3.1重復序列次數(shù)、濃度對Tt影響Meyer D E等13利用遞歸定向連接(recursive directional ligation，RDL)技術，成功地表達出三種不同單體類彈性蛋白文庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELPs的可作為其五肽重復序列次數(shù)的函數(shù)。當五肽重復序列次數(shù)較少時，ELPs的隨重復序列的重復次數(shù)的增加而下降較明顯，當五肽重復序列次數(shù)較大時，ELPs的隨重復序列重復次數(shù)的增加，其值變化不大。Meyer D E等14分析 ELPV5A2G3文庫的與 ELPs濃度關系時，結(jié)果表明：隨著 ELPs濃度的上升而下降，并且呈線性關系。即，代表斜率，ELPs單體不同，其值也不一樣，為ELP濃度。1.

38、1.3.2 Xaa對 Tt的影響Lim D W等15在 Xaa中選取可電離的 Lys，與疏水的 Phe相比，前者可以提高 ELPs的鹽敏感度以降低 ELPs的。通常情況下，相似分子量的 ELPsKV2F家族的比 ELPs KV7F家族要高 1642C，這是因為 ELPsKV2F家族的賴氨酸含量比 ELPsKV7F家族高 2倍以上。1.1.3.3 鹽濃度對Tt的影響對于所有的 ELPs，均隨 NaCl濃度增加而下降。根據(jù)經(jīng)驗，每增加 1M的 NaCl濃度，就相應地減少 15左右。然而，這種影響效應會隨著 ELPs分子中帶電氨基酸的不同而變化，在溶解液中，ELPs的的離子效應遵循霍夫邁斯特離子序(

39、Hofmeister series)。但有時一些鹽離子可以提高，例如胍鹽15。1.1.3.4 分子量對 ELPs的 Tt影響GirottiA等16對一系列的 ELPs模型進行研究時發(fā)現(xiàn)，隨著分子量下降，ELPs的卻逐漸上升。ELPs的長度與聚合物的疏水性存在一個平衡，由于受到 ELPs聚合物鏈末端的影響，這種影響對低分子量的 ELPs的效應更大，如果 ELPs分子量越低，疏水性就越小。然而，這種鏈末端的極性并不能有效說明這一情況，GirottiA認為，分子量對的影響更大部分取決于聚合物鏈疏水性相互作用而產(chǎn)生的絮集作用。因而，如果 ELPs鏈比較短時，就降低了聚合物鏈部疏水性相互作用的效率，所以

40、絮集作用就受抑制。1.1.3.5 pH對Tt的影響GirottiA等16通過實驗表明，在一樣 ELPs濃度下，ELPs(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)2n（n分別為 5，9，15，30，45），它們的均顯示出一樣的趨勢：當?shù)陀谀骋粋€給定的 pH時，值幾乎保持常數(shù)，當高于這一特定的PH值時，就迅速增加。這一趨勢可以這樣解釋：由于 pH增加，谷氨酸的-羧基團逐漸開始去質(zhì)子化，去質(zhì)子化導致其極性的增強，結(jié)果使得 Tt向更高的溫度轉(zhuǎn)變，以上這些因素主要取決于 ELPs的親疏水性，而在帶電的羧酸根附近不可能有這種水合狀態(tài)（hydration mode）。1.1.3.6 其它與Tt有關的因素ELP

41、sKV2F-8 和 ELPsKV7F-9，分別只有 40和 45個氨基酸，是到目前為止最短的ELPs純化標簽，這兩種 ELPs（free ELPs）是不能通過反相轉(zhuǎn)換循環(huán)(Inverse transition cycling ITC)純化出來，但這兩種 ELPs的融合蛋白是可以通過 ITC被提純的，因為 ELPs的融合蛋白的比純粹的 ELPs（free ELPs）的低14。ELPs的重復序列次數(shù)、濃度、Xaa、鹽濃度、pH與分子量是影響類彈性蛋白主要因素，由于 ELPs是一種對環(huán)境有很大敏感性的生物高分子，影響類彈性蛋白還有其它多種因素。1.1.4類彈性蛋白多肽的合成方法 ELPs合成方式主要

42、有兩種：一種是化學法，另一是基因重組合成法，后者為目前主流方法。前者的優(yōu)勢是可以在 ELPs序列特定的位點導入一些非天然氨基酸，但進行大規(guī)模生產(chǎn)卻比較困難。與化學合成法相比，使用基因重組合成法具有以下優(yōu)勢：可通過基因模板控制ELPs序列、立體化學、分子量；且ELPs的轉(zhuǎn)化菌株可以永久性生產(chǎn) ELPs；細胞折疊機制可幫助ELPs折疊成正確的二級或三級結(jié)構(gòu)2?；蛑亟M合成法更是由于RDL(recursive directional ligation，RDL)技術13的使用而被推向新的高度，其原理如圖1所示。使用基因重組合成法，并通過一系列條件優(yōu)化后，ELPs的純化產(chǎn)量可達1.6克/升17。但使用重

43、組的方法合成 ELPs也有一些缺點：由基因編碼的 ELPs存在一個很重要的滯后期（lead-time），這主要是由于需要在理想的載體中對基因進行組裝與需要對宿主細胞進行優(yōu)化表達所導致的2。圖1.1 RDL技術的分子生物學步驟13Fig1.1 The molecular biology steps of RDL13（續(xù)圖1.1）（A）人工合成的ELPs單體基因插入到克隆載體中。（B）ELPs單體基因序列的兩端設計成可被兩個限制性切酶RE1與RE2（即分別為pflM 與Bgl）識別的序列。（C）分別用RE1與RE2的限制性切酶酶切含有ELPs基因的克隆載體，產(chǎn)生含有RE1與RE2酶切后粘性末端的片

44、段；用RE1酶切含有ELPs克隆載體，產(chǎn)生線性克隆載體。（D）含有RE1與RE2酶切后粘性末端的片段與線性載體嚴格地進行頭對尾連接。（E）通過此方式，進行新一輪的ELPs基因序列延長13。(A) A synthetic monomer gene is inserted into a cloning vector. (B) The gene is designed to contain recognition sites for two different restriction endonucleases， RE1 and RE2（ pflM and Bgl respectively）， at

45、 each of the coding sequence. (C)An insert is prepared by digestion of the vector with both RE1 and RE2 and subsequently ligated into the vector that has been linearized by digestion with only RE1. (D) The product contains two head-totail repeats of the original gene， with the RE1 and RE2 sites main

46、tained only at the ends of the gene. (E) Additional rounds of RDL proceed identically， using products from previous rounds as starting materials13.1.1.5類彈性蛋白多肽的應用1.1.5.1 在純化蛋白方面的應用ELPs的應用目前研究最多的是在純化蛋白質(zhì)方面。當 ELPs與目標蛋白進行融合表達， ELPs融合蛋白也有可逆階段，這使得通過 ITC開發(fā)一種非層析法來純化融合蛋白成為可能。在 ITC中，ELPs融合蛋白經(jīng)過多次的絮集、離心、再溶解等步驟可

47、以分別從溶菌液中的生物大分子中分離出來18。表1.1 五種純化方法成本比較Tabl e 1.1The cost of five purification methods項目 pMAL fusion w/tag removal His-tag w/ tag removal IMPACT-CN PHB純化體系 ELPs純化體系常規(guī)產(chǎn)量 40 Mg/L 74 Mg/L 4.5 Mg/L 36 Mg/ 85 Mg/L樹脂吸附力 3 Mg/ml 8 Mg/ml 2 Mg/ml 生長培養(yǎng)基44,198.38 23,101.67 379，894 123,257 58,699誘導成本35,373.35 19,

48、101.61 314,115.30 39,304.03 緩沖成本51,900.11 5,921.45 103.596 27，212.63 15,810樹脂成本624,375.00 790,000.00 192,000 復性成本428,835.99 蛋白酶成本8,480,000.00 總計9,664,682.82 838,124.73 989,606 153,470 74,509對于大規(guī)模生產(chǎn)融合蛋白與高通量生產(chǎn)多肽的蛋白質(zhì)組學研究來說，發(fā)展一種簡單且可靠的純化方式是一個重要目標。Banki M R等19設計一種自我剪接的 ELPs，這種能自我剪接的 ELPs由 ELPs基因與能自我剪接的含肽基

49、因進行融合表達，其中含肽是在生物裂解過程中必要的工具。當加熱到 3040C時，這一 ELPs能夠利用 ITC而被純化，而另一優(yōu)點是在一定溫度與一定 pH下，利用自我剪接的 ELPs中的含肽中自我剪接的特點，進行生物裂解。采用 ELPs和含肽進行蛋白分離優(yōu)勢明顯，Wood DW等計算了采用目前常用的蛋白純化方法純化 1kg蛋白質(zhì)所需原材料的費用見表1.120?？梢?，每純化1kg蛋白質(zhì)所需原材料的費用分別為：利用 His尾巴親和層析 $838124.73，使用 IMPACT-CN純化系統(tǒng) $989606.23，而采用 ELPs體系僅 $74509.75，不到前兩者的 10。1.1.5.2 ELPs

50、在組織工程上應用 ELPs本身具有良好的生物相容性、可在體進行自然降解成氨基酸、無毒、且可通過基因工程進行高通量生產(chǎn)等優(yōu)勢。因而作為一種人工高聚物，近年來，ELPs已成為生物醫(yī)學材料領域的新寵。組織工程是一跨學科的領域，它覆蓋了細胞工程材料和相關的生物化學方面的知識與技術，其目標是創(chuàng)造出人工器官組織或再生受損的組織，因此它可幫助成千上萬患者擺脫組織損傷與組織喪失的困擾21。作為生物材料的 ELPs已廣泛當作可再生與修繕的醫(yī)藥。ELPs在水溶液中具有良好的生物相容性；在體有很好的生物適應性；且可在體降解成氨基酸，這些氨基酸可在體進行代；此外ELPs基本無毒、無免疫反應、不會產(chǎn)生炎癥等 2。ELP

51、s在組織工程中可作為一種注射藥物，它可以在體以化學或物理的方式形成凝膠體。因而 ELPs可作為運載幾微米的組織支架。使用前，ELPs的液態(tài)前體（precursors）易于操作且可在組織受傷處直接注射。注射之后，ELPs可迅速形成一種水凝膠，這種水凝膠可作為三維人工胞外基質(zhì)，以提供有完整結(jié)構(gòu)與功能的外植細胞，外植細胞可用來組織修復。ELPs根據(jù)環(huán)境刺激如溫度、pH、離子強度等引發(fā)其自組裝成水凝膠。在基因水平上可對 ELPs進行優(yōu)化設計，ELPs可被設計成在室溫下成液體狀，當注射物的溫度增加到一定圍時，ELPs可以形成膠狀物質(zhì)，還可在基因水平上對多化學物理耦連位點進行控制，這樣可使 ELPs形成網(wǎng)

52、狀物，其反應活性位點可設計為可控降解，添加特定的配體可以促進細胞的固定與組織的生長2。Urry等通過實驗表明植入 ELPs后僅導致極微小的毒性與免疫反應22。ELPs的水凝膠體已成功應用于軟骨、椎骨的組織修復，血管的移植，膀胱干細胞基體神經(jīng)引導干細胞薄片與手術后的傷口治愈2。Betre等23-24研究表明，軟骨細胞可被裝入由ELPs聚集形成的凝膠狀膠囊中，在膠囊中的軟骨細胞，可在體外15天保持其獨特形態(tài)與與表型，這表明ELPs的凝聚層能支持軟骨細胞的增長，這些軟骨細胞能夠產(chǎn)生并積累硫酸粘多糖和型膠原，此外在沒有外生軟骨細胞補充時，ELPs凝聚層還可促進來源自于脂肪的成體干細胞（adipose-

53、derived adult stem cells）分化成軟骨細胞。Lim等25設計合成了能在水溶液中快速交聯(lián)的ELPs多嵌塊共聚物（block copolymers），結(jié)果表明植入到ELPs水凝膠的纖維原細胞至少能夠在ELPs多嵌塊共聚物交聯(lián)過程中存活三天。Martn等26研究表明ELPs的水凝膠可促進人臍靜脈皮細胞固定，并且人臍靜脈皮細胞易于滲透到多孔ELPs水膠體中。Osorio等27認為由基因工程生產(chǎn)的ELPs與視角面（ocular surface）的細胞外基質(zhì)相類似，因而ELPs可作為視角面細胞在體外培養(yǎng)的一種基質(zhì)（substratum）。Annabi 28等以戊二醛為交聯(lián)介質(zhì)以與高濃

54、度的 CO2，制作出的ELPs水凝膠在孔徑大小與機械性能均能得到較大改善。在三維結(jié)構(gòu)上小孔相互連接（interconnected）的 ELPs膠體可促進纖維原細胞生長，提高滲透性，利用該特性，ELPs膠體還可應用于外科整形。從上述報道可見，ELPs通過凝聚能產(chǎn)生穩(wěn)定性較好的 ELPs水凝膠，在組織工程有巨大潛力。通過基因重組的方式生產(chǎn) ELPs并以物理化學法引發(fā) ELPs相變以制作膠體將是一個非常令人振奮的領域29。1.1.5.3 ELPs在藥物載體上的應用1.1.5.3.1 在靶向腫瘤上應用很多理療實驗在體外顯示出有很高活性，但在體效果卻很低，這往往是由于藥物在運輸過程導致的30。由于藥物動

55、力學的分化或者是系統(tǒng)性毒性，大多數(shù)治療效果受到限制31。過去幾十年中，利用 ELPs作為可溶性載體并應用于靶向腫瘤，眾多學者作了大量研究。通過設計一 ELPs序列并與藥物蛋白進行融合表達，在生理溫度下，當向身體某一組織注射ELPs融合蛋白時，ELPs藥物融合蛋白可在人體循環(huán)系統(tǒng)保持溶解狀態(tài)或者是從循環(huán)系統(tǒng)被清除；且當對人體特定部位如腫瘤組織進行局部溫和地加熱，ELPs藥物融合蛋白經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)最終將會聚集于腫瘤部位32-34。把ELPs作為藥物的載體，具有如下優(yōu)勢：ELPs是生物大分子，具有良好的生物相容性、無毒、可在體自然降解、可增加藥物的溶解性、能有效延長藥物的半衰期、減少藥物的毒理作用、定向

56、在腫瘤部位累積35-37；ELPs序列長度以與氨基酸組成可在基因水平上進行精確控制；與ELPs融合表達的藥物蛋白可以通過可逆熱循環(huán) (inverse thermal cycling，ITC)直接純化出來，因為基于 ELPs融合蛋白也有相變溫度特性；采用ELPs作為為藥物載體可以直接將載體與藥物注射到體；無需尋找病害部位2。此外，ELPs作為藥物載體，還可向動關節(jié)、背根輸送藥物38-39。1.1.5.3.2 在構(gòu)造藥物載體微粒上應用Fujita等40通過一系列方法使ELPs與聚天冬氨酸融合，成功構(gòu)造出一種均一且有理想相變溫度的微粒-(PGVGV)120D176，這種物質(zhì)只在生理條件下（pH=7.

57、4，37）才能形成球狀的微粒，而在相似的條件下如36不能形成微粒，且該微粒部為疏水性，易于在其部導入一些疏水性小分子藥物。Osborne等41基于彈性蛋白的多嵌段共聚物有疏水區(qū)域與交聯(lián)區(qū)域的特點，設計出來的重組ELPs具有自組裝特點：當溫度在 ELPs融合蛋白相變溫度之上時，ELPs融合蛋白就自組裝成具有雙峰式分布、直徑為納米或者是微米的微粒。直徑更大的微?？梢酝ㄟ^直徑為微米級別的微粒進行可逆的形成。在高濃度的聚乙二醇條件下，微粒合并減少，但其穩(wěn)定性卻增加，微粒的穩(wěn)定性還可以通過戊二醛進行共價交聯(lián)得到提高。對響應型組裝納米級微粒來說，環(huán)境響應型藥物載體的發(fā)展需要在制備方法上有新突破。Wu等42

58、使用電噴霧構(gòu)造出能生物反應ELPs微粒，這種微?？裳b入藥物。產(chǎn)生這種納米微粒是把 ELPs和藥物共溶于有機溶劑中，然后加速通過電壓梯度，在傳輸過程中，由于受蒸發(fā)作用，最終在靶面上可收集到藥物微粒。MacKay等43設計出含ELPs的嵌合肽，此嵌合肽利用ELPs自組裝的特點可以自發(fā)形成納米微粒，通過老鼠的腫瘤模型實驗，結(jié)果表明單純藥物運輸相比（free drug），嵌合肽耐劑量（maximum tolerated）高四倍，且注射一劑量（single dose）后，腫瘤幾乎完全衰退。由于ELPs具有很好的機械性能與特殊的生物活性，自組裝的 ELPs可以生成微管與納米管結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。利用 ELPs的自

59、組裝特性，ELPs作為生物醫(yī)學材料將有更廣闊的前景。1.1.6動力學模擬方法的應用分子動力學是一套分子模擬方法，該方法主要是依靠牛頓力學來模擬分子體系的運動，以在由分子體系的不同狀態(tài)構(gòu)成的系綜中抽取樣本，從而計算體系的構(gòu)型積分，并以構(gòu)型積分的結(jié)果為基礎進一步計算體系的熱力學量和其他宏觀性質(zhì)。系綜(ensemble)是指在一定的宏觀條件下(約束條件)，大量性質(zhì)和結(jié)構(gòu)完全一樣的、處于各種運動狀態(tài)的、各自獨立的系統(tǒng)的集合。全稱為統(tǒng)計系綜。系綜是用統(tǒng)計方法描述熱力學系統(tǒng)的統(tǒng)計規(guī)律性時引入的一個基本概念；系綜是統(tǒng)計理論的一種表述方式，系綜理論使統(tǒng)計物理成為普遍的微觀統(tǒng)計理論；系綜并不是實際的物體，構(gòu)成系

60、綜的系統(tǒng)才是實際物體。運行模擬是為了分析分子中所有原子在微觀上的相互作用關系與特性，并從中分析出相應的宏觀性質(zhì)44。Roger Rousseau等45對類彈性GVG(VPGVG)八個寡肽進行動力學模擬，觀察到這一溫敏性寡肽的結(jié)構(gòu)變化：當溫度達到4060時，寡肽結(jié)構(gòu)開始折疊，此外他們還觀察到當溫度接近水的沸點時，寡肽構(gòu)象不再發(fā)生變化。Aliaksei Krukau等46對類彈性多肽GVG(VPGVG)3進行在280 與 440 K進行動力學分析，結(jié)果表明，在模擬的過程是主要有兩種構(gòu)象存在，一種是在溫度較時以剛性的構(gòu)象存在，另一是在較高的溫度時以柔性的構(gòu)象存在；此外他們預測到相變溫度大約為310